PROBLEMAS 2

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 2 - 2008
Trabajo práctico Nº6: Problemas Direccionamiento proteico-Tránsito
vesicular
Nota: Los problemas 1-4 fueron extraídos de la Guía de Problemas de Introducción a la Biología
Molecular y Celular, FCEN, UBA.
1) Hace algunos años se ha descubierto que, pese a tener secuencias aminoacídicas
muy diversas, todas las proteínas peroxisomales poseen cerca de su extremo Cterminal la secuencia Ser-Lys-Leu (SKL). Esta secuencia consenso SKL sirve de
"etiqueta" para dirigir a estas proteínas a los peroxisomas. Por métodos de ingeniería
genética es posible construir un plásmido de expresión en células de mamíferos con
un ADNc para la proteína peroxisomal luciferasa que contiene la secuencia SKL
(figura 1). Cuando se transfectan células de mamífero en cultivo con este plásmido se
observa que la luciferasa codificada por él se almacena correctamente en los
peroxisomas. Mediante manipulación genética es posible eliminar la secuencia SKL o
agregar secuencias provenientes de genes de otras proteínas (figuras 2 y 3). En todos
los casos, las modificaciones no alteran el marco de lectura del resto de la luciferasa.
Figura 1 ADNc de luciferasa normal con secuencia SKL (en negro)
Figura 2 ADNc de luciferasa con deleción de secuencia SKL
Figura 3 ADNc de luciferasa con deleción de secuencia SKL y agregado de secuencias que
codifican para un péptido señal (rayado horizontal) que es reconocido por la peptidasa de la
señal (flecha) y para un péptido hidrofóbico de anclaje ("stop transfer", rayado vertical).
a) ¿Por qué mecanismo entra al peroxisoma la luciferasa codificada por el
plásmido de la figura 1?
b) ¿En qué compartimento celular se almacenará la luciferasa codificada por el
plásmido de la figura 2? Justifique.
c) ¿En qué compartimento celular se almacenará la luciferasa codificada por el
plásmido de la figura 3? Justifique.
Si corresponde, describa la orientación final de la proteína.
d) Los tres ADNc de luciferasa codifican para la secuencia consenso de
glicosilación Asparagina-X-Serina (NXS) ¿Cuál/es de las tres luciferasas
producidas terminarán glicosiladas? Justifique su respuesta.
2) En las levaduras, la degradación de los ácidos grasos ocurre en los peroxisomas. Los
ácidos grasos se degradan totalmente hasta fragmentarse en moléculas de AcetilCoA. Este Acetil-CoA sale del peroxisoma gracias a una enzima de localización
peroxisomal llamada carnitina acetiltransferasa y entra en la mitocondria ayudado por
la misma enzima, de localización en la membrana mitocondrial interna. Una vez en la
mitocondria, el Acetil-CoA entra al ciclo de Krebs, contribuyendo a la obtención de
energía metabólica (ATP) del mismo modo que el Acetil-CoA proveniente de la
glucólisis. Un único gen de localización nuclear codifica para las dos formas
(peroxisomal y mitocondrial) de la carnitina acetiltransferasa:
MTS: Región que codifica para señal de transporte mitocondrial (predominan
aminoácidos hidrofóbicos y básicos).
AKL: Región que codifica para la secuencia aminoacídica Ala-Lys-Leu (AKL),
equivalente en levaduras de la secuencia Ser-Lys-Leu (SKL) de mamíferos (etiqueta
de localización en peroxisomas).
Este gen tiene 2 promotores alternativos de la transcripción. El promotor 1 (P1) es
constitutivo. El promotor 2 (P2) es inducible por ácidos grasos. El transcripto iniciado
por el promotor 1 no incluye nunca al exón 2 en el mRNA maduro, por splicing
alternativo. El transcripto iniciado por el promotor 2 incluye a todos los exones que se
encuentran corriente abajo de P2 en el mRNA maduro. Ambos promotores pueden
funcionar simultáneamente. La actividad enzimática de la carnitina acetiltransferasa
está codificada por los exones 3 y 4.
a) ¿En qué compartimento celular se sintetizan las carnitina acetiltransferasas
mitocondrial y peroxisomal y qué tipo de translocación las lleva a sus destinos?
b) ¿En qué compartimento/s celular/es se acumulará la actividad de carnitina
acetiltransferasa en las siguientes condiciones?
i)
levaduras cultivadas sin ácidos grasos en el medio de cultivo.
ii) levaduras cultivadas con ácidos grasos en el medio de cultivo.
c) ¿Cuál será la ventaja (valor adaptativo) de que el promotor 2 sea inducible por
ácidos grasos?
d) Para cada una de las dos condiciones de cultivo de la pregunta b, indique el o los
destinos celulares de la actividad de carnitina acetiltransferasa para las siguientes
mutaciones del gen (suponga en todos los casos que las mutaciones se
encuentran en homocigosis):
i)
Deleción de la secuencia que codifica para MTS.
ii) Deleción de la secuencia que codifica para AKL.
iii) Deleción de las secuencias que codifican para MTS y AKL.
iv) Inserción de una secuencia codificante para un péptido señal start transfer, que
incluye el sitio de reconocimiento para la peptidasa de la señal, en el exón 2,
corriente abajo del ATG y en fase de traducción con éste.
e) ¿Cuál es la causa molecular de que ninguna de las carnitina acetiltransferasas
estudiadas (ni la enzima normal ni las mutantes descriptas en la pregunta d) se
almacene en los lisosomas?
3) La T7 RNA polimerasa es la enzima que transcribe los genes del bacteriófago T7
reconociendo los promotores de los mismos. Esta enzima no existe en células
eucariotas, como tampoco existen en los genes de dichas células promotores que
sean reconocidos por ella. Sin embargo, si se hace expresar una T7 polimerasa
recombinante en células eucariotas, las mismas pueden transcribir genes a los cuales
se les haya reemplazado su promotor natural por uno de algún gen del fago T7.
Se transfectaron células humanas carentes del gen de la pirulasa ácida
simultáneamente con las dos construcciones plasmídicas descriptas en la figura 4:
Figura 4
Dato: Los 2 plásmidos se dirigen a los núcleos de las células humanas transfectadas.
A las 48 hs después de comenzada la transfección se separó por un lado el medio de
cultivo que bañaba las células (medio condicionado) y por el otro las células
transfectadas. De estas últimas se aislaron lisosomas. Posteriormente se midió la
presencia de enzima pirulasa en el medio condicionado y en los lisosomas. Además se
midió qué proporción de la enzima pirulasa presente en dichos destinos quedaba retenida
en una columna de afinidad de concanavalina-sefarosa. La concanavalina es una proteína
vegetal que tiene alta afinidad por los azúcares.
Los resultados se encuentran en la siguiente tabla (tabla 1):
Tabla 1
a) Interprete los resultados mostrados en la tabla 1 (casilleros llenos). Justifique.
b) Complete los casilleros vacíos de la tabla, justificando su respuesta en cada caso
y describiendo a qué compartimento celular se dirigió la pirulasa ácida y por qué.
Datos:
- B1 es una variante del plásmido B que carece de la secuencia que codifica para la seguidilla de
aminoácidos básicos sin alterar el resto del marco de lectura.
- A1 a A5 son variantes del plásmido A donde las modificaciones mencionadas a continuación no
alteraron el resto del marco de lectura en cada caso:
- A1 carece de la secuencia que codifica para el sitio de reconocimiento de la peptidasa de
la señal.
- A2 carece de la secuencia que codifica para Asn-Ser-Ser.
- A3 carece de la secuencia que codifica para el péptido señal start transfer. El marco de
lectura remanente comienza por una metionina.
- A4 tiene insertada una secuencia que codifica para un péptido señal stop transfer donde
indica la flecha vertical a en la figura 6.
- A5 tiene insertada una secuencia que codifica para un péptido señal stop transfer donde
indica la flecha vertical ß en la figura 6.
- Las etiquetas que llevan a las proteínas solubles al lisosoma también dirigen a proteínas de
membrana a la membrana del lisosoma.
4) El Dominio de Agregación Condicional (DAC) es una secuencia aminoacídica que, por
presentar alta afinidad por sí misma, provoca el agregado y precipitación de las
proteínas que la poseen. A su vez, el DAC presenta sitios de unión específica para el
ligando sintético AP22542 (una molécula orgánica, no tóxica, pequeña e hidrofóbica
que no es fabricada en células animales). Cuando se une al DAC, AP22542 promueve
la desagregación de la proteína, permitiendo que la misma se pliegue correctamente y
no precipite.
La agregación de proteínas en el retículo endoplásmático rugoso provoca la retención
de las mismas en su lumen, mientras que si se encuentran solubles y bien plegadas,
dichas proteínas siguen la vía normal de secreción. La agregación de proteínas en el
citosol provoca la inmediata degradación total de las mismas por proteasas
inespecíficas. Teniendo en cuenta estos conceptos, Rivera y col. (Science 287, 826830, 2000) transfectaron células humanas en cultivo con la construcción I con el fin de
desarrollar un sistema de expresión de proteínas recombinantes controlable por la
adición o no del ligando AP22542 al medio de cultivo de las mismas. Entre el ADNc
para DAC y el ADNc para la proteína X introdujeron una región que codifica para el
sitio de reconocimiento de la proteasa furina, presente en todos los tipos celulares de
mamíferos, pero de localización exclusiva en el lumen del aparato de Golgi.
a) Se realizó un experimento de transfección con la construcción I, en ausencia del
ligando AP22542. Al cabo de 48 hs se analizó la expresión de la construcción I en
distintos compartimentos celulares por la técnica de Western Blot, usando
anticuerpos policlonales anti-proteína X. ¿En qué destino (núcleo, citosol,
lisosomas, peroxisomas, RER, Golgi, mitocondrias, medio extracelular) encontrará
Ud. una banda que sea reconocida por el anticuerpo mencionado? ¿Qué peso
molecular tendrá la banda observada? (1 aminoácido = 100 Dalton). Justifique su
respuesta.
b) ¿En qué compartimentos encontrará Ud. una banda que sea reconocida por el
anticuerpo mencionado y qué peso molecular tendrá la banda observada en una
transfección igual a la de la pregunta anterior, pero en presencia del ligando
AP22542? Justifique.
c) ¿Qué resultados de Western Blot habría obtenido en cada caso si se hubieran
usado para transfectar las construcciones II y III, en ausencia y en presencia del
ligando AP22542? Justifique.
d) La proteína X no posee señal de glicosilación. ¿Bastaría con introducirle la señal
de glicosilación Asn-Ala-Ser en la construcción I para direccionarla a los
lisosomas? ¿Por qué?
e) En humanos normales, a los pocos minutos de haber ingerido alimentos aumenta
la concentración de glucosa en sangre y la glucosa gatilla la secreción de la
hormona insulina por parte de las células del páncreas. La insulina secretada viaja
por la sangre y estimula la entrada de glucosa a las células de los tejidos, donde
será utilizada como fuente de energía. Al bajar los niveles de glucosa la insulina en
sangre disminuye. En cierto tipo de diabetes, los pacientes no fabrican insulina y
por lo tanto tienen altos niveles de glucosa en sangre (hiperglucemia). Como la
glucosa no puede entrar a las células, éstas quedan deficitarias en energía. Si con
fines de terapia génica se utilizara una construcción similar a la I donde la proteína
X fuera insulina y el promotor fuera de expresión en todos los tejidos,
introduciéndola de manera estable en cualquier tipo celular del paciente, ¿qué
debería administrarse a los pacientes y en qué momentos del día, para garantizar
una secreción y función de insulina recombinante similares a las fisiológicas?
Justifique.
5) La hormona tiroidea tiroxina está compuesta por dos residuos de tirosina yodados
(figura 5). Se almacena en la glándula tiroides es una estructura denominada folículo,
como parte de una proteína mucho más grande llamada tiroglobulina. El folículo
consiste en un epitelio celular que rodea a un espacio extracelular, o lumen. Cuando la
glándula tiroides es estimulada por TSH (hormona estimulante de la tiroides), la
tiroxina se separa de la tiroglobulina por acción de proteasas y se libera al torrente
sanguíneo.
La identificación de la vía de liberación de tiroxina resultó difícil. Cuando la tiroides es
estimulada por la TSH, aparecen “gotitas coloidales” en el citoplasma de las células
foliculares. La similitud del material de estas gotitas con el material del lumen del
folículo generó un intenso debate: ¿Las gotitas representan un material que se
encuentra en camino hacia el exterior de la célula (hacia el lumen, para reabastecer su
provisión), o constituyen en cambio material del lumen que ha sido englobado por la
célula (para generar tiroxina)? Esta incógnita pudo resolverse por una serie de
observaciones experimentales:
a) Si se marca el coloide en el lumen con 131I y luego se estimulan los folículos
con TSH bajo condiciones que bloquean la incorporación adicional de yodo, las
gotitas intracelulares resultan marcadas.
b) Las gotitas intracelulares se forman alrededor de 4 minutos luego de la
exposición a la TSH y se ven inicialmente en los procesos celulares apicales,
que lindan con el lumen del folículo, luego en la región apical de la célula, y
finalmente en la región basal.
c) La tiroglobulina presente en el lumen del folículo contiene M6P, que
normalmente dirige a las proteínas hacia los lisosomas.
Dadas estas observaciones, proponga una vía para la producción y la liberación de la
tiroxina desde las células foliculares.
Figura 5 Estructura química de la tiroxina.
6) La fusión entre una vesícula y su membrana target requiere el ensamblado de una
maquinaria compleja. Entre los componentes de la maquinaria de fusión se
encuentran NSF (proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida), dos SNAPs
(proteínas solubles de unión a NSF) y SNAREs (receptores de SNAPs) específicos
sobre la vesícula y la membrana target. Durante el ensamblado de la maquinaria, las
SNAPs se unen inicialmente a sus receptores, que luego pueden unir NSF. Una vez
que la maquinaria está ensamblada correctamente, NSF actúa como ATPasa,
hidrolizando el ATP que lleva unido y liberándose desde el complejo en formación
para la fusión de las membranas.
Se desea identificar proteínas que actúen como SNAREs en la sinapsis nerviosa. A tal
fin, se purifican SNAREs a partir de un extracto de membranas de cerebro bovino
obtenido con detergente. El protocolo de purificación se esquematiza en la figura 6. En
primer lugar, se mezcla un exceso de -SNAP y -SNAP recombinantes con el
extracto de membranas crudo y luego se agrega NSF recombinante en presencia de
ATPS (un análogo no hidrolizable del ATP). La mezcla se une luego a esferas
recubiertas de un anticuerpo anti NSF. Las esferas se ubican posteriormente en una
columna y se lavan profusamente en presencia de ATPS. Finalmente, se agrega un
buffer que contiene ATP a la columna, se recogen los complejos que salen de la
misma y se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida (figura 7). Las bandas
se identifican por microsecuenciación. Los resultados de la microsecuenciación
indican que las proteínas no recombinantes presentes en los complejos (sintaxina B,
SNAP-25 y sinaptobrevina-2) corresponden a proteínas previamente identificadas
como componentes de la vía de secreción.
Figura 6 Procedimiento para la purificación de SNAREs.
CARGA
LAVADO
ATPS
Extracto de membranas

NSF
ATP

NSF
ATPS
NSF
-SNAP
-SNAP
ATPS
Esfera asociada a un
anticuerpo anti NSF
ELUCIÓN
Eluato no
específico
Complejo
ensamblado unido
a la esfera


Eluato específico
Figura 7 Proteínas eluídas de la columna luego del agregado de ATP.
sintaxina B
-SNAP
sintaxina A
-SNAP
SNAP-25
sinaptobrevina-2
ADP + Pi
a) ¿Por qué se usa ATPS para el lavado y ATP para la elución?
b) ¿Por qué se considera que en la elusión se recogen proteínas candidatas a ser
SNAREs?
c) ¿Por qué se usa un exceso de SNAPs recombinantes en lugar de depender de
las SNAPs que estarían presentes en el extracto de membranas?
d) Sobre una base molar, la suma de todos los posibles receptores de SNAP es
aproximadamente igual a la mitad de la suma de los -SNAP y -SNAP. ¿Es
esto lo que usted hubiese esperado?
e) Las sintaxinas A y B son parte de la membrana plasmática presináptica, la
sinaptobrevina-2 es un componente de la membrana de la vesícula sináptica, y
SNAP-25 (proteína de 25 kDa asociada al sinaptosoma) puede ser también un
componente de la membrana de la vesícula sináptica. Basado en su
localización, ¿cuál de estas proteínas es probable que sean v-SNAREs y
cuáles es posible que sean t-SNAREs?
7) La proteína Core del virus de hepatitis C (HCV) forma multímeros e interactúa
físicamente con el ARN viral para organizar la nucleocápside. Esta proteína presenta
propiedades que le permiten modular una cantidad de procesos celulares, como la
transcripción, la inhibición o la inducción de la apoptosis y la supresión de la
inmunidad del hospedador.
La secuencia primaria de aminoácidos de Core se encuentra bien conservada entre los
distintos aislamientos de HCV. El dominio N-terminal de Core es altamente básico,
mientras que su extremo C-terminal es hidrofóbico. La proteína Core madura se
obtiene a partir de dos eventos de procesamiento proteico que ocurren en el retículo
endoplasmático (RE). El dominio N-terminal de Core contiene tres segmentos de
secuencias ricas en arginina y lisina, y se ha observado la translocación de la proteína
hacia el núcleo mediada por estos segmentos de residuos básicos, que funcionarían
como señales de localización nuclear. Se desconoce si existen otros compartimentos
subcelulares involucrados en la distribución de Core.
Dadas sus funciones reguladoras del crecimiento celular, se postula que Core
debe presentar también una localización en RE y mitocondria (MT), y se desea
definir las secuencias determinantes de la misma.
Diseñe experimentos que le permitan demostrar esta hipótesis y describa los
resultados esperados. No olvide incluir los controles correspondientes. Las
siguientes preguntas constituyen una guía para el diseño experimental:

¿Qué técnica utilizaría para determinar la localización subcelular de Core?

¿Cómo identificaría las secuencias de Core responsables del tropismo?

¿Cómo determinaría la ubicación exacta de Core dentro de la mitocondria?
Usted dispone de los siguientes reactivos y sistemas, además de todo el equipamiento
que considere necesario:

Líneas celulares en cultivo

cDNA de Core, longitud completa

Anticuerpos anti Core, anti proteínas marcadoras de RE, anti proteínas de
mitocondria