Qué es exactamente un microchip de DNA

Tecnologías de secuenciación de alto rendimiento
1) Amplificación clonal in vitro: para generar muchas copias de cada molécula individual.
- PCR de emulsión: 1)se aíslan las moléculas individuales de ADN junto con microesferas recubiertas con
cebadores en burbujas acuosas dentro de una fase oleosa. 2) Una PCR recubre cada microesfera con copias
clonales de las moléculas aisladas y seguidamente se inmovilizan para ser más tarde secuenciadas.
-PCR de puente: los fragmentos se amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie sólida.
Ambos métodos producen muchas localizaciones, físicamente aisladas, que contienen cada una muchas
copias de un solo fragmento.
2) Secuenciación paralelizada
Se pueden utilizar varios métodos de secuenciación para determinar las secuencias de ADN de todas las
localizaciones en paralelo.
- La secuenciación por síntesis, usa el proceso de síntesis de ADN por ADN polimerasa para identificar las
bases presentes en la molécula complementaria de ADN.
- Los métodos de terminador reversible (usados por Illumina y Helicos) utilizan versiones reversibles de
terminadores marcados con colorante, añadiendo un nucleótido cada vez, y detectando la fluorescencia
correspondiente a esa posición y removiendo posteriormente el grupo de bloqueo para permitir la
polimerización de otro nucleótido.
- La Pirosecuenciación (utilizada por 454) también usa la polimerización del ADN para añadir nucleótidos,
añadiendo cada vez un tipo diferente y después detectando y cuantificando el número de nucleótidos
añadidos a una determinada localización a través de la luz emitida por la liberación de los pirofosfatos
unidos a ellos.
La secuenciación por ligación emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la
secuencia objetivo. Este método utiliza un reservorio de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud
dada, marcados de acuerdo con la posición secuenciada. Los oligonucleótidos se templan y ligan; el
ligamiento preferente de las ADN ligasas por su secuencia específica produce una señal correspondiente a la
secuencia complementaria en esa posición concreta.
Otras tecnologías de secuenciación
- La secuenciación por hibridación es un método no enzimático que usa un chip de ADN. Un único
reservorio de ADN se marca mediante fluorescencia y se hibrida con una colección de secuencias conocidas.
Si el ADN desconocido se hibrida fuertemente en un punto dado de entre las secuencias, haciéndole que
"luzca", entonces se infiere que esa secuencia existe dentro de los ADN desconocidos
- La Espectrometría de masas también se puede usar para secuenciar las moléculas de ADN; las reacciones
convencionales de terminación de la cadena producen moléculas de ADN de diferentes longitudes y la
longitud de esos fragmentos se determina entonces por las diferencias de masa entre ellas (en lugar de
utilizar una separación por gel).
Hay nuevas propuestas para la secuenciación de ADN que están en desarrollo:
- secuenciación por nanoporos
- técnicas basades en microscopías, como la microscopía de fuerza atómica o el microscopio electrónico
Qué es exactamente un microchip de DNA?
Se trata de un soporte sólido, normalmente de cristal, que lleva unido, de forma densa y ordenada, un gran
número de fragmentos de DNA, llamados “sondas”, que contienen secuencias específicas diseñadas para la
detección de variantes genéticas de interés.
Ácido nucleico aislado
de la muestra y marcado
Hibridación
Sonda
Soporte
a
Estos soportes pueden ser membranas de
nitrocelulosa o nailon, o bien portaobjetos
recubiertos con residuos de polilisinas u otro
compuesto capaz de unir ADN.
En cuanto a las sondas, pueden ser clones de
ADN procedentes de una genoteca, productos de
PCR obtenidos a partir del genoma de interés o
bien oligonucleótidos sintéticos.
Ventajas:
- Aumentan exponencialmente la velocidad del proceso de detección de las variantes genéticas puntuales de
cambio de nucleótido (SNP), ya que nos permiten analizar un gran número de genes a la vez con un proceso
sencillo y reproducible.
- Análisis de la diferencias de expresión a nivel de ARN: pretende determinar qué genes varían su nivel de
expresión en función del tejido analizado (normal / tumoral).
Problemas:
Esta gran cantidad de datos precisa de métodos estadísticos novedosos y sistemas bioinformáticos para su
tratamiento adecuado.
- Se conoce que la técnica tiene una reproducibilidad limitada
- análisis de las imágenes y cuantificación de la expresión.
- Control de calidad de los datos: permite detectar valores incorrectos para su posterior exclusión
de los análisis.
- Normalización de los datos: eliminación de errores sistemáticos.
- Diseño experimental: el estudio de las fuentes de variabilidad y su magnitud es fundamental para
definir si es necesario replicar los experimentos y en qué medida.
- La tasa de resultados falsamente positivos es muy elevada si no se emplean correcciones que
tengan en cuenta la multiplicidad de hipótesis que se prueban.
En estos momentos se están investigando diversas soluciones
Las muestras pueden ser ADN o ARN, según se trate de un análisis genómico (genotipificación) o bien un
análisis de la expresión génica (genómica funcional). Una vez purificado el ácido nucleico se procede a su
marcado, que puede ser radiactivo o fluorescente. Esta última es la más popular porque permite hibridar dos
muestras simultáneamente si se utilizan dos fluorocromos distintos (fig. 4).
En el caso del ADN, se fragmenta mediante sonicación o digestión enzimática parcial y a continuación se
procede a su marcado mediante una polimerasa. En el caso del ARN el marcaje se lleva a cabo durante el
proceso de transcripción inversa .
Una vez marcado el ADN (o ADNc) se procede a su hibridación con el array sintetizado previamente,
uniéndose cada ADNc a la sonda correspondiente.
A continuación se somete al microarray a una serie de lavados para eliminar el exceso de ADNc que ha
hibridado inespecíficamente y se procede a la medición de la señal, generándose una imagen que se somete a
un proceso de digitalización, normalización y cuantificación.
Tras este tratamiento se obtiene una colección de datos con las intensidades correspondientes a cada gen
incluido en el array.
Finalmente se procede al análisis de los datos, que en ocasiones se convierte en una tarea compleja, pues la
ventaja de esta técnica es que permite obtener una enorme cantidad de información en un único experimento.
Este aspecto supone la necesidad de análisis de tipo estadístico para poder analizar los resultados. Por esta
misma razón, la ayuda de los sistemas informáticos es clave para el análisis de todos los datos por un lado, y
evitar la subjetividad inherente del propio investigador, por el otro. La aplicación de la estadística es
especialmente importante cuando el investigador no conoce de antemano algunos genes cuya expresión varíe
en el sistema analizado, es decir, controles que permitan determinar de manera objetiva cuál es el valor a
partir del que se va a considerar que existe un cambio en la expresión de un gen.