Aislar ADN - Universidad de Puerto Rico Humacao

UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO- HUMACAO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
BIOL 3013
Experiencia de Laboratorio: Macromoléculas: ácidos nucléicos y método
de separación
Adaptado y traducido por la Dra. Melissa Colón Cesario, UPRH 2009 de:
 “Exercise Seven: Separating Organic Compounds”, Biology Laboratory
Manual, Vodopich & Moore, McGraw Hill, 2008.
Objetivos:
1. Describir y utilizar procedimientos clásicos para aislar DNA.
2. Reconocer que la gel de electroforesis es una técnica utilizada
para separar moléculas orgánicas.
Introducción:
Todo sistema vivo se compone de moléculas orgánicas que forman las
estructuras principales de la célula. Las moléculas orgánicas de mayor
abundancia en la célula son los hidratos de carbono, los lípidos, las proteínas y
los ácidos nucléicos. En la unidad pasada utilizamos pruebas para detectar la
presencia de los hidratos de carbono y los lípidos en diferentes soluciones. En
esta unidad vamos a utilizar una prueba bioquímica para detectar la presencia
de las proteínas en una solución y un procedimiento para aislar el DNA de las
células.
El DNA y el RNA son ácidos nucléicos compuestos por pequeñas
unidades conocidas como nucleótidos. Los nucleótidos se caracterizan por estar
compuestos de tres grupos: un azúcar (desoxirribosa o ribosa), un grupo fosfato
y una base nitrogenada. Existen cuatro nucleótidos que componen la molécula
del DNA: timina, citosina, guanina y adenina, los cuales varían en la base
nitrogenada. Un nucleótido se une a otro nucleótido mediante un enlace
fosfodiester, esta unión ocurre entre el grupo fosfato de un nucleótido y el del
azúcar del nucleótido adyacente. Esta cadena larga de nucleótidos forma los
ácidos nucléicos. Aunque el DNA y el RNA son ácidos nucléicos
estructuralmente éstas moléculas difieren. La molécula de DNA se caracteriza
por tener dos cadenas de nucleótidos que permanecen unidas por puentes de
hidrógeno, mientras que la molécula de RNA se compone de una cadena
sencilla de nucleótidos. Los nucleótidos de DNA están compuestos por una
azúcar conocida como desoxirribosa, mientras que la molécula de RNA está
compuesta por una ribosa. Además, la molécula de RNA carece de timina, la
cual es sustituida por uracilo. Tanto la molécula de DNA como la de RNA son de
gran importancia en los organismos vivos porque son las moléculas que están
asociadas con la herencia.
1
Terminal 5’
Bases Nitrogenadas
Pirimidinas
5’C
3’C
Nucleósido
Base
Nitrogenada
Citosina (C)
Timina
(T, en DNA)
Uracilo
(U, en RNA)
Purinas
Grupo
Fosfato
5’C
Azúcar
(pentosa)
Adenina (A)
Guanina (G)
(b) Nucleótido
3’C
Azúcar
Terminal 3’
(a) Ácido nucléico
Desoxirribosa (en DNA)
Ribosa (en RNA)
(c) Nucleósido componentes: azúcar
Extracción de DNA
El siguiente procedimiento experimental es para aislar (extraer) DNA de
las células de un organismo. Este método es una versión modificada del
procedimiento que se utiliza en los laboratorios de biotecnología. El objetivo es
extraer DNA del filtrado de una fruta o vegetal.
Procedimiento para extraer DNA de una fresa:
1. Coloca en una bolsa zip-locked una fresa. Añade 6 mL de detergente de
fregar o SDS/NaOH. Cuidadosamente remueve el aire de la bolsa y
ciérrala apretadamente.
2. Suavemente, pero completamente, tritura la fresa de forma tal que no
queden pedazos grandes (tipo puré). El filtrado de fruta se obtiene de la
mezcla de la fruta con un detergente. El detergente emulsifica y forma
complejos con los lípidos y las proteínas de la membrana plasmática
precipitándolas fuera de la solución. El contenido celular, incluyendo el
DNA, queda suspendido en la solución. La mezcla celular se purifica para
producir un filtrado que contenga el DNA y proteínas adheridas.
3. Coloca el jugo de fresa y detergente en un filtro de café. Recoge el
filtrado líquido en un beaker o tubo de ensayo limpio. No te preocupes si
parte de los desechos de fresas caen en el filtrado. Presiona suavemente
el filtro a la pared del tubo de ensayo para facilitar el flujo del jugo de
fresa.
a. Vas a obtener más o menos 8 mL del jugo de la fresa.
b. El jugo de fresa contiene el DNA, pero no se puede observar
porque está disuelto en el agua.
4. Cuidadosamente añade 2 mL de 100% alcohol etílico (EtOH) al jugo de
fresa filtrado. Añade el EtOHl de forma tal que este baje por las paredes
2
del tubo de ensayo, se formará una capa de alcohol sobre el jugo de
fresa. NO mezcle el alcohol con el jugo.
a. En este punto se va a observar que se forma una interfase borrosa
entre las capas del alcohol y el jugo de fresa. Este es el DNA que
se está precipitando del jugo de fresa. El DNA es insoluble al
alcohol.
5. Sin alterar las dos capas, sumerge una varilla fina de cristal dentro del
jugo de fresa y alcohol. Con la varilla obtén la molécula de DNA (tiene
forma de algodón) que se va a encontrar en la zona del EtOH.
Preguntas:
1. ¿Cuál es la función del detergente en este protocolo de extracción de
DNA?
2. ¿Qué sucedió con el jugo filtrado al añadir el EtOH 100%?
3. Cuál es la función del EtOH 100% en este protocolo de extracción de
DNA?
Separar moléculas orgánicas:
Como podemos reconocer las células se componen de una mezcla de
moléculas orgánicas (hidratos de carbono, proteínas, lípidos y ácidos nucléicos).
Para poder caracterizar todas estas moléculas los científicos utilizan ciertos
métodos para separar los compuestos de la célula.
Entre los diferentes métodos que existen, la gel de electroforesis se utiliza
para separar las moléculas de acuerdo a sus cargas, estructuras y tamaño. Las
muestras (moléculas orgánicas) son ubicadas en los pozos que se encuentran
en la gel (parecida al Jello). Luego a la gel se le aplica una corriente eléctrica
que permite que las moléculas orgánicas se muevan fuera del pozo y atraviesen
la gel. La velocidad, la dirección y la distancia de movimiento de cada molécula
está asociado a su carga, tamaño y estructura.
3
Técnica
Fuente de
Según ilustrado en la figura, el aparato
energía
Mezcla de
para una gel de electroforesis se
moléculas
ánodo +
– cátodo
de DNA de
compone de una cámara de
diferente
electroforesis, una gel, un buffer (solución tamaños
amortiguadora), las muestras y una
fuente de energía.
gelatina
1
 La gel: consiste de agarosa
(derivado de agar) disuelta en una
Fuente de
solución amortiguadora caliente.
energía
Cuando la solución se enfría esta
–
+
se solidifica en una gel porosa que
Moléculas
grandes
funciona como un cedazo. La gel
se sumerge en una cámara que
contiene electrodos y está llena de
2
Moléculas
solución amortiguadora.
pequeñas
 La solución amortiguadora
conduce electricidad y controla el pH. El pH suele afectar la estabilidad y
cargas de las muestras.
 Las muestras son una mezcla de moléculas (DNA o proteínas) ubicadas
en los pozos de la gel y migran a lo largo de la gel durante la
electroforesis.
 La fuente de energía provee la corriente que pasa a través de la gel.
Las moléculas con cargas responden a la corriente migrando desde el
pozo a lo largo de la gel. Las moléculas con cargas negativas migran
hacia el electrodo positivo (el ánodo), mientras que las moléculas con
cargas positivas migran hacia el electrodo negativo (el catión). Mientras
más alto sea el voltage más rápido migran las moléculas.
Las propiedades de cedazo de la gel afecta la velocidad de movimiento de
las moléculas a través de la gel. Las moléculas pequeñas se mueven más
facilmente por los poros de la gel que las moléculas grandes. Por tanto,
moléculas pequeñas y compactas (esféricas) se mueven más rápido que las
moléculas grandes. Si las moléculas tienen estructuras similares y el mismo
peso, entonces la molécula con mayor carga se mueve más rápido.
En la mesa de demostración usted podrá observar el equipo para una
electroforesis. Aunque en esta experiencia no tendremos la oportunidad
de llevar a cabo una electroforesis para la muestra de DNA obtenida, si
tendremos la oportunidad de manejar una micropipeta digital y hacer un
simulacro de cómo cargar unas muestras en una gel.
4
Analizar e interpretar una Gel de electroforesis
Utiliza la siguiente situación para analizar los resultados representados en la
caricatura, de una electroforesis.
Situación: La hemoglobina que genera anemia (HbS) migra más lentamente al
polo positivo que la hemoglobina normal (HbA). Esta condición se genera por
una mutación en donde glutamato (polar,
Polo hidrofílica) es sustituida por valina (no polar,
Carril 1
Carril 2
Carril 3
hidrofóbica).
pozos
1. ¿Cuál carril contiene solo a HbS,
indicando que el individuo es HbS
HbS?
2. ¿Cuál carril contiene solo a HbA,
indicando que el individuo es HbA
HbA?
Polo +
3. ¿Cuál carril contiene ambos HbA y HbS, indicando que el individuo es HbA
HbS?
4. Basado en la información obtenida y el resultado, ¿qué puede decir usted
de los amino ácidos de valina y glutamato?
5. ¿Cuál característica o factor está determinando el movimiento de las
moléculas HbA y HbS a través de la gelatina?
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Separar moléculas orgánicas por un gel de electroforesis
Procedimiento:
1. Obtén una cámara de electroforesis. Cubre los extremos del plato con las
gomas apropiadas (en algunos casos puedes utiliza tape), según le
demuestre el instructor.
2. Ubica el peine en el extremo y en el centro de la cama (según sea
indicado). Va a observar que existe un espacio entre el peine y el plato.
3. Mezcla 0.8% (peso por volumen) de polvo de agarosa con el “buffer”
(solución amortiguadora), suficiente volumen para llenar el plato del gel.
Calienta la mezcla hasta que la agarosa se disuelva.
4. Cuando la solución de agarosa se enfríe (que usted pueda tocarlo) añade
la solución al plato del gel.
5. Cuando la gel se solidifique, quita las gomas de los extremos. Este paso
hay que hacerlo con delicadeza para que el gel no se rompa. Además,
quita el peine del gel. Va a observar los pozos del gel.
6. Ubica el plato con el gel en el interior del aparato de electroforesis.
7. Añade el buffer al aparato de electroforesis, de forma tal que el gel quede
sumergido en el buffer.
8. Usted tendrá cuatro muestras:
a. Muestra 1: Bromophenol blue (peso molecular = 670 g mole-1)
b. Muestra 2: Methylene blue (peso molecular = 320 g mole-1)
c. Muestra 1: Orange G (peso molecular = 452 g mole-1)
d. Muestra 1: Xylene cyanol (peso molecular = 555 g mole-1)
9. Utilizando una micropipeta carga cada muestra en cada pozo del gel.
Asegúrate que la solución esté en la punta de la pipeta (de esta forma la
solución queda en el interior del pozo y no se forma burbujas dentro del
pozo).
a. Ubica la punta de la pipeta en el pozo sin tocar el fondo. No
absorbas el buffer.
b. Suavemente libera el contenido de la pipeta en el pozo del gel.
Remueve la pipeta, sin absorber el material del pozo o el buffer.
10. Haz el procedimiento 9 para las demás muestras. Recuerda cambiar de
tip para cada muestra. Utiliza los subsiguientes pozos para las diferentes
muestras.
11. Cuidadosamente cubre la cámara de electroforesis con la tapa. Conecta
la cámara con la fuente de energía. La conección roja es la carga positiva
y la carga negra es la carga negativa.
12. Enciende la energia hasta que el voltage llegue a 90 V. Rápidamente se
van a formar burbujas en el buffer cerca de los electrodos.
13. Después de 30 min, apaga la fuente de energía, desconecta la cámara de
electroforesis. Suavemente remueve y dibuje sus resultados.
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Preguntas:
1. Utilizando sus resultados, ¿Cuá es la carga del bromophenol blue, del
orange G y el azul de metileno? Explique el resultado
2. ¿El orange G, el bromophenol blue se mueven a la misma distancia?
¿Por qué o por qué no?
Referencias:
Audesirk T, Audesirk, G & Byers B.E. Capítulo 4: Moléculas biológicas.
Biología: La vida en la Tierra. (8va ed.). Pearson Prentice Hall.
Campbell, Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky & Jackson. (2008)
Chapter 4: Carbon and Molecular Diversity. Biology. 8va Ed. Pearson
Benjamin Cummings, USA.
Raven, Johnson, Losos, Mason & Singer. (2008) Biology. 8va Ed. McGraw
Hill, USA
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