ACIDOS NUCLEICOS - SILADIN Oriente

ÁCIDOS NUCLEICOS.
Los ácidos nucleicos están formados por nucleótidos
Los ácidos nucléicos, ácido desoxirribonucleico DNA y ácido ribonucleico RNA, son
macromoléculas encargadas de almacenar y transferir la información genética.
Al analizar el producto de la hidrólisis total de cualquier ácido nucleico se obtienen siempre
tres componentes:



una pentosa,
un conjunto de bases nitrogenadas,
fosfato
La unión de estas tres moléculas en relación 1:1:1
constituye un nucleótido, unidad básica o monómero
de los ácidos nucleicos.
El monosacárido puede ser una pentosa: ribosa o desoxirribosa. La diferencia entre ambas
reside en que el grupo hidroxilo (-OH) del carbono 2´ de la ribosa es sustituido por un
hidrógeno en la desoxirribosa. Los nucleótidos con ribosa (ribonucleótidos) son los
constituyentes del RNA, mientras que aquellos que tienen desoxirribosa
(desoxirribonucleótidos), constituyen el DNA. Los carbonos (C) de las pentosas se
representan como C1´ , C2´, etc., a diferencia de las bases nitrogenadas que se designan
como C1, C2, etc.
Las bases nitrogenadas, son una familia de moléculas cíclicas derivadas de dos anillos
básicos: purina y pirimidina. Los ácidos nucleicos están formados por 2 bases puricas y dos
bases pirimidínicas. El DNA contiene dos bases púricas, adenina (A) y guanina (G) y dos
bases pirimidínicas citosina (C) y timina (T).
Las bases púricas son las mismas en el RNA y DNA, sin embargo en el RNA las bases
pirimidínias, son la citosina y el uracilo (U)
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Bases púricas (A y G) o bases grandes derivadas de la purina y bases
pirimidínicas (T,C y U) derivadas de la piridina.

Una base, una pentosa y un
fosfato forman un nucleótido
En la formación de un nucleótido, la base
nitrogenada se une al C 1´ de la pentosa
mediante un enlance -glucosídico
mientras que el grupo fosfato se une al C
5´ de la pentosa mediante un enlace
éster.
Los nucleótidos pueden contener uno,
dos o tres fosfatos, denominándose
respectivamente nucleótido mono, di o tri
fosfato.
 Los nucleótidos se unen entre
sí para formar ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos, DNA y RNA, son cadenas
de desoxirribonuceótidos o ribonucleótidos
respectivamente, unidos entre sí por enlaces
fosfodiéster entre los C 5´y 3´ de las pentosas de
nucleótidos consecutivos.
De esta forma el extremo 5’ de la cadena
polinucleotídica tendrá un grupo fosfato libre y el
extremo 3´ un grupo hidroxilo libre.
La secuencia lineal de los nucleótidos de un
ácido nucleico se abrevia con la letra
correspondiente a la abreviatura de cada base
nitrogenada comenzando desde la izquierda, por
con el extremo 5´de la cadena.
Así, el extremo 5´ hace referencia al primer
nucleótido de la cadena y el extremo 3´ al último.
La secuencia de bases constituye lo que se
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denomina estructura primaria y se lee en sentido 5´-3´de la cadena de nucleótidos.
 Los nucleótidos además de participar en los ácidos nucleicos tienen otras
funciones
Algunas funciones de los nucleótidos se describen a continuación:
Transporte y almacenamiento de energía química mediante enlaces de alta energía.
El ATP es el nucleótido más usado a nivel celular, aunque el UTP, GTP, CTP y TTP se
emplean también como donadores de energía en reacciones específicas y en la síntesis de
ácidos nucleicos. En las monohebras, el enlace entre los grupos fosfato 2 y 3 (enlaces
fosfoanhidro) requieren mucha energía de formación: son enlaces de alta energía. La
hidrólisis de cada uno de estos enlaces libera aproximadamente 30 kJ/mol (7,5 Kcal/mol), lo
que impulsa a menudo reacciones que son menos favorables, es decir reacciones que
requieren energía (AGº < 0). Los mononucleótidos pueden entonces contener dos o tres
fosfatos y por lo tanto uno o dos enlaces de alta energía.
Algunos nucleótidos se pueden combinar con otros grupos para formar coenzimas
Muchos cofactores enzimáticos y coenzimas, que llevan a cabo una amplia gama de
funciones químicas, incluyen a la base adenina en su estructura. Entre ellas se encuentran el
NAD, el NADP, FAD, la coenzima A. Estas moléculas las estudiaremos
La fórmula de la coenzima A aparece abajo.
Muchas moléculas señalizadoras específicas en la célula son nucleótidos.
Una de las moléculas con función de segundo mensajero más común es el AMP cíclico
(AMPc). El AMPc tiene funciones reguladoras en prácticamente todas las células animales,
modificando actividades enzimáticas en el interior celular, en respuesta a cambios
extracelulares. El AMPc se forma a partir del ATP por la enzima adenilato ciclasa, que
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cataliza la esterificación del fosfato 5´ con el -OH 3´. Esta enzima está asociada a la cara
interna de la membrana plasmática.
 ESTRUCTURA DEL DNA

El DNA está formado por dos cadenas de polinucleótidos
En 1953 Watson y Crick publicaron un modelo de la estructura tridimensional del DNA y
concluyeron que consistía en dos cadenas de polinuceótidos enrolladas alrededor del mismo
eje con sentido dextrógiro, formando una doble hélice con un diámetro de 2nm.
La estructura primaria del DNA está definida por la secuencia de las bases en la cadena del
polinucleótido. Conocer esta secuencia de bases implica poder descifrar la información
genética del DNA.
Las orincipales características de la molécula son:

La polaridad de estas dos cadenas es opuesta, es decir el extremo 5´de una cadena
coincide con el extremo 3´de la otra: son antiparalelas.

La estructura fosfato-pentosa conforma el exterior de la hélice, mientras que las
bases se sitúan hacia el interior formando un ángulo recto con el eje de la hélice.
Esta disposición permite que las bases de ambas cadenas queden enfrentadas en el
interior de la doble hélice.

Las dos hebras de la hélice se mantienen unidas de forma no covalente por la
formación de puentes de hidrógeno entre las bases complementarias: la adenina
forma 2 puentes de hidrógeno con la timina y la guanina forma tres con la citosina.
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La especificidad en el apareamiento de las bases se conoce como
complementariedad. Las bases de una de las cadenas de polinucleótidos son
siempre complementarias de las bases de la otra cadena
Modelo de DNA propuesto por Watson
y Crick (1953).
Hebras antiparalelas del DNA,
esqueleto pentosa fosfato. Las
bases nitrogenadas están
orientadas hacia el centro de la
molécula.
Distintos factores que contribuyen a estabilizar la doble hélice
a. Puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. Los puentes de
hidrógeno son interacciones débiles, de todas formas la doble hélice queda
estabilizada por la presencia de un número extremadamente grande de ellos a lo
largo de la cadena.
b. Interacciones hidrofóbicas. Las bases son moléculas aromáticas planas y de
naturaleza hidrofóbica. Esta característica permite interacciones hidrofóbicas entre
las bases enfrentadas de cada hebra.
c. Cargas de los grupos fosfatos. Los grupos fosfatos tiene carga negativa que se
encuentran en el exterior de la molécula, donde pueden interaccionar con el agua,
una molécula polar sin carga. De esta forma contribuyen a la mayor estabilidad de la
doble hélice de DNA.
 El DNA se desnaturaliza por efecto de la temperatura
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Las temperaturas altas, 80 ó 90ºC, así como valores de pH extremos, provocan la
desnaturalización del DNA. La desnaturalización consiste en la ruptura de los
puentes de hidrógeno entre bases apareadas y la pérdida de las interacciones
hidrofóbicas entre las bases apiladas de cada hebra. Como resultado de este
proceso la doble hélice de DNA se desenrolla dando lugar a dos hebras simples que
pueden quedar:

totalmente separadas (desnaturalización total)

parcialmente separadas (desnaturalización parcial)
Cuando la temperatura o las condiciones de pH retornan a valores fisiológicos, los
segmentos de DNA desapareados vuelven a enrollarse, es decir, sus bases
complementarias se aparean
nuevamente y se obtiene la estructura de doble
hélice. Este proceso se denomina renaturalización del DNA y es posible mientras
exista alguna región de la molécula de DNA con estructura de doble hélice, es decir,
desnaturalizada parcialmente.
En el proceso de desnaturalización los enlaces covalentes del DNA se mantienen
inalterados.
Los DNA de distintos orígenes tienen una temperatura de desnaturalización o
temperatura de fusión característica que depende de la composición de bases.
Cuanto más alto sea el porcentaje de bases G-C mayor será la temperatura de
fusión. Esto se debe a que el par de bases G-C con tres puentes de hidrógeno es
más estable que el par A-T y por lo tanto requiere más energía calórica para
disociarse.
La transición de DNA de doble hélice a monohebra puede detectarse por el efecto
hipercrómico, que se debe al incremento de absorción de luz UV por las bases del
DNA.
Curva de Fusión. La absorbancia a 260nm de
una solución de DNA aumenta cuando se
desnaturaliza.
Curvas de Fusión de diferentes DNA con
distinto contenido de G+C

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
El DNA está asociado a proteínas que permiten su empaquetamiento
Tanto en procariotas como en eucariotas el DNA se condensa, proceso que permite
una adecuación a las dimensiones de las células. Por ejemplo, el DNA de la bacteria
E. Coli, que forma un sólo cromosoma debe condensarse unas 1000 veces.
En eucariotas este proceso es más evidente, debido al mayor contenido de DNA de
sus células y consiste en el enrollamiento de la doble hélice sobre sí misma, para dar
lugar fibras más cortas y gruesas: súper hélice o DNA superenrrollado. El DNA con
grupos fosfatos cargados negativamente se asocia con moléculas cargadas
positivamente, para estabilizar su estructura. Estas moléculas pueden ser proteínas
denominadas histonas, a otras proteínas básicas o a moléculas de pequeño tamaño
como las poliaminas.
Las histonas son proteínas de pequeño tamaño, con una alta proporción de
aminoácidos básicos que a pH neutro tienen carga positiva (lisina o arginina), lo que
les permite interaccionar con el DNA, independientemente de la secuencia de
nucleótidos.
La doble hélice se va enrollando a intervalos regulares alrededor de un complejo de
histonas, dando lugar a los denominados nucleosomas. Cada nucleosoma, está
formado por un segmento de DNA superenrollado de unos 200 pares de bases sobre
un octámero de histonas. Las histonas son de cinco tipos: H1, H2A, H2B, H3 y H4.
Un nucleosoma está formado por dos moléculas de las histonas H2A, H2B, H3 y H4
según se observa en la figura. La histona H1 se asocia con el DNA
internucleosómico y favorece la aproximación de nucleosomas adyacentes.
Los nucleosomas constituyen las unidades básicas de la cromatina.
Sin embargo el DNA se debe condensar mucho más para “adaptarse” al tamaño
celular. En la figura se resumen las sucesivas etapas de condensación del DNA,
desde la doble hélice a los cromosomas.
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 ESTRUCTURA DEL RNA

El RNA está formado por ribonucleótidos
Los nucleótidos del RNA se denominan ribonucleótidos y se unen entre sí del mismo
modo que se unen los desoxinucleótidos en el DNA. En cualquiera de los dos casos
los nucleótidos se unen a través de enlaces fosfodiéster entre el fosfato que está en
el C5´de la pentosa y el –OH del C 3´ de otra pentosa.
Las moléculas de RNA, en general constan de una cadena única polinucleotídica y si
bien no adoptan estructura de doble hélice como en el DNA, pueden tener regiones
de apareamiento de bases complementarias en la misma hebra.
Si bien en algunos los casos el RNA constituye el material genético, como en
algunos virus, las funciones del RNA están asociadas a la síntesis de proteínas.
Se han encontrado cuatro tipos de RNA: el RNA mensajero (mRNA), el RNA
ribosómico (rRNA), el RNA de transferencia (tRNA) y el RNA nuclear de pequeño
tamaño (snRNA). En la Tabla a continuación se resumen las funciones de cada tipo
de RNA.
Tipos de RNA
mRNA
rRNA
tRNA
snRNA
Función
Lleva la información para la síntesis de
proteínas
Participa en la síntesis de proteínas
formando parte de los ribosomas
Actúa como un “adaptador” entre el
mRNA y los aminoácidos
Participa en la maduración del pre-mRNA
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
RNA mensajero: transportador de la información genética
El mRNA es una única cadena polinucleotídica que resulta de la transcripción de un
gen, es decir de un segmento de DNA. La función del mRNA es transportar la
secuencia de nucleótidos de un gen determinado hasta el ribosoma, donde ocurre la
traducción del mRNA en el proceso de síntesis proteica.
En eucariotas cada mRNA contiene generalmente la información transcrita de un
gen, es decir de una sola cadena polipeptídica. En cambio en bacterias, es frecuente
que una serie de genes adyacentes se transcriban en conjunto en forma de un solo
mRNA, el cual contiene la información de diferentes proteínas.
Habitualmente las moléculas de DNA son largas y contienen las instrucciones para
miles de proteínas diferentes, mientras que una molécula de RNA es mucho más
corta, y contienen la información de un fragmento de DNA.
Habitualmente las moléculas de DNA son largas y contienen las
instrucciones para miles de proteínas diferentes, mientras que una
molécula de RNA es mucho más corta, y contienen la información de un
fragmento de DNA.

El RNA ribosómico asociado a proteínas forma los ribosomas
Los ribosomas son moléculas de proteínas asociadas a moléculas de RNA. En el
cuadro que aparece abajo se indican las diferencias entre ribosomas eucariotas y
procariotas así como el tamaño de los rRNA que los conforman. El rRNA contribuye
a dar al ribosoma una estructura capaz de acomodar al mRNA y a la proteína
durante su proceso de síntesis.
Los ribosomas de las células eucariotas son muy similares a las procariotas en
cuanto a diseño y función. Ambos están formados por una subunidad grande y una
pequeña que se acoplan formando un ribosoma.
SUBUNIDAD
PESADA o MAYOR
LIVIANA o MENOR
Ribosomas procariotas
70S
rRNA 23S
rRNA 5S + 34 proteínas
Ribosomas eucariotas
80S
rRNA 28S
rRNA 5,8S y rRNA 5S
+ 49 proteínas
rRNA 16S + 21 proteínas
RRNA 18S + 30
proteínas
Observe en la figura que aparece a continuación las estructuras espaciales
complejas que adoptan los rRNA, donde se ve la alternancia de regiones apareadas
y no apareadas en forma de bucles.
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
RNA de transferencia: adaptador entre los nucleótidos y los aminoácidos.
Los tRNA son moléculas de tamaño pequeño que tienen aproximadamente unos 80
nucleótidos. Estas moléculas se pliegan formando una estructura tridimensional
compleja, presentan 4 segmentos en doble hélice, que en una representación
sencilla tiene un parecido con una “hoja de trébol”, según se ve en la figura. La forma
en hoja de trébol se pliega sobre si misma y adopta una estructura más compacta y
estable en forma de “L”, también representada en la figura.
Modelo de tRNA en forma de hoja de
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trébol CCH. Plantel Oriente.Área de Ciencias Experimentales.BIOLOGÍA I, 1ª UNIDAD.
Modelo de tRNA en forma de L
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Las principales características de la molécula de tRNA se resumen a continuación:
Región anticodón, corresponde al triplete de bases que se aparea con el
codón, triplete de bases complementario al codón de la molécula de mRNA.
Extremo 3´, es una región corta de tRNA de simple hebra, que interviene en la
unión de la molécula de tRNA con el aminoácido correspondiente. Este extremo
siempre se une al aminoácido.
Los tRNA contienen bases que no son comunes en otros RNA como la
pseudouridina, dihidrouridina e inosina. Estas bases se generan por modificaciones
de las bases “comunes”, posteriores a la síntesis del tRNA Otra característica de la
molécula de tRNA es que el extremo 5´ presenta una guanina fosforilada.

snRNA: pequeñas moléculas de RNA nuclear
El snRNA (small nuclear) contiene pocos nucleótidos y está asociado a proteínas
formando complejos. Su localización es en el núcleo celular y como se verá más
adelante están implicados en el proceso de maduración del mRNA: participan en el
corte de intrones y ensamble de exones.

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE
El desarrollo de la tecnología de DNA recombinante o ingeniería genética, ha
cambiado el concepto de la biología dado que ha permitido, no solo comprender a
nivel molecular los seres vivos, sino modificar en forma controlada su información
genética.
Los trabajos de Watson y Crick que permitieron descifrar la estructura del DNA en los
años -50 fueron el punto de partida para el desarrollo de esta nueva rama de la
biología. Al mismo tiempo se han dado importantes desarrollos científicos que son
fundamentales en la tecnología del DNA recombinante:
1. La capacidad de introducir DNA en una célula, proceso conocido como
transformación, asi como la selección de las células transformadas.
2. Purificación de DNA con altos rendimientos.
3. Descubrimiento y purificación de enzimas de restricción y enzimas de
modificación del DNA.
Básicamente con estos tres procedimientos se han podido modificar genéticamente
organismos como bacterias, plantas y animales con el objetivo que, tras la
introducción de un gen foráneo no presente en su genoma, el organismo sea capaz
de expresar la proteína codificada por dicho gen.
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Si bien existen numerosos ejemplos de las aplicaciones biotecnológicas derivadas de
la tecnología del DNA recombinante, solo vamos a hacer referencia a los
procedimientos más usados para generación de plantas transgénicas.
El principal objetivo de la biotecnología vegetal es la generación mediante ingeniería
genética de nuevas variedades de plantas que presentan alguna característica que
mejore su valor frente a la especie ya existente. Por ejemplo, plantas resistentes al
ataque de diferentes patógenos y/o resistentes a determinados herbicidas, asi como
plantas capaces de tolerar a condiciones adversas de cultivo.
Un ejemplo particular del uso de las técnicas de DNA recombinante es el desarrollo
de líneas de maíz transgénico. Estas plantas transgénicas tienen la capacidad de
producir moléculas con acción insecticida en forma endógena y se denominan maíz
Bt. La resistencia al ataque de insectos como los taladros fue lograda por la
introducción en el genoma del maíz del gen que codifica para la proteína CryIAb. La
fuente natural de está proteína es una bacteria, Bacillus thuringensi, que ha sido
empleada en forma de aspersión para el control de estos insectos en el cultivo de
maíz desde hace más de 30 años.

Introducción del gen de interés en un vector.

Plásmidos
Los plásmidos son DNA extracromosómico que se encuentran con frecuencia en
bacterias y levaduras. Estas moléculas de DNA circular confieren a las células
características como resistencia a antibióticos, metales pesados y a sustancias
aromáticas.
Los plásmidos son usados por la ingeniería genética como vectores de clonación
para introducir el gen de interés, obteniéndose un plásmido recombinante.
Posteriormente el plásmido recombinante se usa para ser transferido a la célula
hospedadora.

Introducción del gen de la proteína Bt en un plásmido
Para llevar adelante la introducción del gen Bt es necesario:
a) cortar el DNA de interés con enzimas de restricción
b) cortar el plásmido vector con enzimas de restricción
c) unir el DNA de interés al plásmido vector
Las enzimas de restricción o endonucleasas son enzimas de origen bacteriano, que
reconocen secuencias específicas en el DNA e hidrolizan el enlace pentosa-fosfato,
produciendo asi un corte en la molécula de DNA. El esqueleto pentosa-fosfato se
rompe entre dos bases en una hebra y en otras dos bases equivalentes en la otra
hebra lo que puede generar un corte a distinta altura en cada hebra y formar
extremos cohesivos como se ve en la figura. Otras enzimas de restricción realizan
cortes rectos produciendo extremos romos, que también se muestran en la figura.
En la actualidad se conocen cientos de enzimas de restricción y en la mayoría de los
casos la secuencia que se reconoce es un palíndromo o secuencia simétrica de 4, 5,
6 ó más nucleótidos. Algunos ejemplos se muestran en la Tabla siguiente.
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Si se digiere el DNA de interés y el vector plasmídico con la misma enzima de
restricción se generaran extremos cohesivos complementarios y de este modo las
moléculas de DNA pueden aparear sus bases. De todas formas para que se una el
esqueleto pentosa fosfato se necesita una enzima de modificación del DNA
denominada DNA ligasa. La ligación es un paso fundamental para la generación de
DNA recombinante ya que permite la unión del esqueleto de DNA de distinto origen.
Esta enzima sella tanto extremos cohesivos como romos y requiere la presencia de
un grupo fosfato en el extremo 5´y de un –OH en un extremo 3´.
Como consecuencia de la acción de la ligasa se producirán moléculas del vector, es
decir del plásmido bacteriano, que contienen el gen de interés, en este caso el gen
Bt. Una vez obtenido el plásmido recombinante, se procede a transformar las células
maíz.

Transformación de una célula vegetal
El proceso de transformación consiste en introducir el vector que contiene el gen de
interés en una célula hospedadora. Hay varias formas de transformar una célula
vegetal y se describirá uno de los métodos que permite introducir el gen Bt en una
célula de maíz.
Un método para introducir DNA aislado en células vegetales es la biolística, que
consiste en recubrir partículas de oro con plásmido recombinante (vector + gen Bt).
Estas partículas son usadas como proyectiles en la medida que son disparadas por
un sistema de aire comprimido “cañón de genes” sobre tejido vegetal.
Estas partículas van a atravesar las paredes celulares hasta el interior celular donde
el DNA que las recubre se libera y probablemente un número reducido del DNA
alcance el núcleo y se integre en el DNA vegetal.
Otro requisito imprescindible para obtener plantas transgénicas es la integración
estable de ese DNA exógeno en una célula vegetal asi como contar con un método
para poder seleccionar las células vegetales que han sido transformadas. El método
más usado consiste en usar plásmidos con resistencia a antibióticos, de manera que
al cultivar las células vegetales en un medio selectivo, es decir complementado con
antibiótico, solo crecerán se dividirán y originarán una planta transgénica las células
transformadas.
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A partir de una célula transformada con el gen exógeno se obtiene una planta que
se denomina transgénica, que son clones respecto a la célula original.
Las variedades de maíz transgénicos con la proteína Bt han demostrado ofrecer un
control eficaz de los taladros de maíz, primero en ensayos de campo que se viene
realizando desde comienzo de los 90, y posteriormente en la experiencia comercial,
con millones de hectáreas cultivadas desde 1997.
Electroforesis de DNA
Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución de moléculas con carga
neta, éstas se deplazarán hacia el polo contrario a su carga. En este principio se
basa la técnica denominada electroforesis y el deplazamiento de la molécula en
cuestión depende de dos factores: la carga y el tamaño.
Un equipo de electroforesis consta de una fuente de poder que genera el campo
eléctrico y una cuba, recipiente con dos compartimentos con un electrodo cada uno.
En la foto que aparece abajo se indican los componentes del sistema.
La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o
fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para
separar moléculas de ácidos nucleicos son polimeros como la acrilamida y la
agarosa. Estos geles van en la cuba, sumergidos en un tampón, con pH superior a 8.
De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se
desplazarán al polo positivo, porque poseen carga neta negativa a pH superiores a
5.
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Cuando la electroforesis se realiza en un gel, este se comporta como un tamiz
molécular y permite separar moléculas cargadas basándose en su tamaño y forma.
Así una mezcla de moléculas de DNA de diferente tamaño, que pueden resultar de
una reacción con enzimas de restricción, se separarán en función de su tamaño. En
la figura que aparece a continuación se observa un gel de agarosa teñido con
bromuro de etidio, donde se visualizan bandas que corresponden a fragmentos de
DNA con diferente masa molecular. Las moléculas de DNA de mayor masa
molecular migran menos respecto a las moléculas de DNA de menor masa molecular
que quedan más próximas al polo positivo..
Es importante el empleo de un marcador de masa molecular conocida porque
permite calcular la masa molecular de las bandas de DNA: la movilidad relativa suele
ser una funcion lineal del logaritmo de la masa molecular.
Equipo de electroforesis, a la izquierda se ve la cuba de
electroforesis conectada a una fuente de poder.
DNA de un fago se digirió con
varias enzimas de restricción y
los poductos obtenidos se
separaron en un gel de agarosa.
A la izquierda del gel se
observan
las
bandas
del
marcador del peso molecular.
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