Seminario 6: Transcripción, procesamiento del RNA y control de la

Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata
Bioquímica III – 2009
Seminario 6: Transcripción, procesamiento del RNA y control de la expresión en
eucariotes
Temario
Clase 1: Mecanismos de transcripción en eucariotas
 Polimerasas eucariotas (RNA pol I, II y III)
 Estructura de los distintos promotores (rec RNA pol I, II y III)
 La iniciación de la transcripción por la RNA pol II. TBP, factores generales de transcripción,
secuencias "TATA", "CAAT"
 Estructura genómica: niveles de organización, nucleosomas, fibras, cromatina y cromosomas;
secuencias únicas, moderada y altamente repetitivas. Niveles de regulación. eu- y heterocromatina,
propiedades químicas y estructurales de la cromatina activa, sensibilidad a DNAasa, modificación de
histonas, submetilación.
 Enhancers, activadores, co activadores, el mediador.
Clase 2: Factores de transcripción:
 Factores de transcripción: generales, activadores, coactivadores, "enhancers", insulator. Matriz
Attachments Regions (MARS). Estructura modular de los factores de transcripción. Tipos de dominios
de interacción a DNA y de activación. Formación de homo y heterodímeros.
 Estructura modular de promotores. El rol de la heterodimerización en la regulación de la expresión
tejido específica y desarrollo.
 Métodos de clonado de factores de transcripción.
 Métodos de análisis patrones de expresión.
 Heterocromatina. Metilación del DNA, islas CpG, metilación dirigida por RNA de interferencia.
Imprinting.
Clase 3: Procesamiento y Degradación de RNAs
Procesamiento de RNAs
 Procesamiento de mRNA
- Capping y adición de poly A
- Splicing: En mitocondrias y plástidos (intrones de grupo I y II), Splicing de mensajeros- El
spliceosoma, Splicing alternativo; Trans Splicing
- Edición de mRNA
- Transporte de mRNA
 Procesamiento de rRNAs
 Procesamiento de tRNAs
Degradación de RNA mensajeros
-Vías de decapping, deadenilación y endoribonucleolíticas
- Mecanismos de supervivencia de RNA
-Secuencias AURE
Control postranscripcional de la expresión.
Patrones de "splicing" alternativo.
Control traduccional: regulación positiva y negativa, cambios en el marco de lectura, estabilidad de los
mensajeros.
Regulación a nivel del editing.
RNA pequeños y silenciamiento postranscripcional.
Bibliografía

Molecular Biology. Clark, David, (2005) Elsevier Academic Press. Regulation at the RNA Level,
Capítulo 11. Regulation of Transcription in Eukaryotes, Molecular Biology, Clark, (2005) Capítulo
10, 262-280. Capítulo 12: Processing of RNA, 302-332. Regulation at the RNA Level. Capítulo
11, 281-301.



Lehninger Principles of Biochemistry, Nelson, D.L. & Cox, M.M., 4th Ed (2005) Worth Publishers.
Capítulos 26 y 28.
Biología Celular y Molecular. Lodish, H, Baltimore, D., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P. &
Darnel,J. . 5a ed. Capítulos 11 y 12.
Biochemistry by Voet and Voet. (Wiley Publishers, 3rd Ed.),
http://bcs.wiley.com/he-bcs/Books?action=index&bcsId=1847&itemId=047119350X
Preguntas guía (clases 1 y 2).
I- Indique la o las respuestas correctas
A. Las RNA-polimerasas localizadas en el núcleo de organismos eucariotas poseen en común las siguientes
características
a) Son sensibles a alfa-amanitina
b) Reconocen la secuencia promotora ubicada upstream (aguas arriba) del sitio de inicio de la transcipción.
c) Reclutan los factores que intervienen en la formación del "cap" en el extremo 5' del transcripto.
d) Requieren de TATA box binding protein (TBP) para que ocurra iniciación de la transcripción.
e) Se desplazan sobre la hebra molde en la dirección 5' a 3'.
B) Los factores de transcripción
a) Se unen únicamente a DNA.
b) Se unen únicamente a proteínas.
c) Deben unirse tanto a DNA como a proteínas para controlar la transcripción.
d) Son sólo activos en el cromosoma a partir del cual fueron transcriptos.
C) Cuáles de las siguientes afirmaciones sobre la síntesis de RNA ribosomales es falsa?
a) En una célula típica, hay aproximadamente 100 copias de los genes para rRNA.
b) La producción de rRNA no necesita splicing.
c) Los rRNA se producen a partir de un precursor 45S que se procesa en fragmentos pequeños
d) La mayor parte de los rRNA son transcriptos por la RNA polimerasa II
D) El TATA box en eucariotas es:
a) Corazón del promotor (core promoter)
b) Secuencia – 35.
c) Secuencia – 10
d) 5' cap.
E) El complejo de preiniciación, en eucariotas, se forma en la región promotora de un gen codificante
para una proteína con la finalidad de
a) Reclutar a la RNA polimerasa I.
b) Reclutar a RNA polimerasa II
c) Reclutar a RNA polimerasa III
d) Reclutar la helicasa Dna B
e) Inhibir la transcripción
.
II-Responda brevemente las siguientes preguntas
A) ¿Cuál es la estructura de un promotor eucariota? ¿Qué es el TATA box? ¿Se encuentra en todos los
promotores eucarióticos? ¿Qué ocurre con promotores procarióticos y primitivos?
B) ¿Qué proteínas son necesarias para la transcripción basal por la RNA pol II y cuáles para la transcripción
activada?
C) ¿Cuáles son las propiedades de un enhancer y cómo actúa?
2
D) Haga un diagrama de los elementos promotores típicos de los genes que codifican para tRNA, rRNA, y mRNA
genes. Marque la posición de dichos elementos en relación al sitio de inicio de la transcripción (+1). Indique
además si dichos elementos son esenciales o activadores.
E) Algunos libros como por ej "Principles of Genetics, 5th ed Tamarin, R. 1996 afirman que la actividad
"proofreading" (correctora de errores) es muy importante durante la replicación del DNA, porque los errores
serían transmitidos a la descendencia, sin embargo, este principio no se aplica a la transcripción ya que los RNA
tienen una vida media corta en el citoplasma y los errores en su síntesis no serían permanentes. En este
contexto en bibliografía aparecen afirmaciones como:
"las RNA polimerasas no poseen actividad correctora de errores"
"los errores en el RNA no son tan críticos como en el DNA"
"no es necesario que se efectúe una corrección de errores durante la transcripción, ya que de esta
manera se logra un proceso mucho más rápido"
Otros libros como por ej Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (2004) o el Genes VIII, Lewin, Ed
2004, no hacen ninguna mención a la actividad proofreading de las RNA polimerasas.
¿Cuál es su opinión respecto a la actividad de corrección de errores de las RNA polimerasas y las
afirmaciones anteriores?
E).Defina los siguientes términos
F1- 5’ Capping
F2-Dominio CTD de la Pol II
F3- HATs y HMTs
.
Problemas a discutir en la clase 1:
1. Los experimentos mostrados en las figuras 1 y 2
tienen como objetivo estudiar la función de la proteína que se une al
TATA box (TBP) y del factor general de transcripción factor IIB (TFIIB) aislados a partir de una biblioteca de cDNA de arroz,
en la transcripción en plantas.
1) Indique en qué etapa de la transcripción intervienen TBP y TFIIB y qué papel desempeñan
2) Analice los resultados de la figura 1 e indique si están de acuerdo con la función indicada en el inciso anterior.
3) Indique todos los componentes que utilizaría para hacer una reacción de transcripción in vitro. ¿Qué componentes
aporta el extracto celular?
4) Analice los resultados de la figura 2.
TBP
TBP+TFIIB
Sonda
no unida
Figura 1. Actividad de unión a DNA de TBP
y TFIIB.
A)Esquema de los fragmentos de DNA usados
en el ensayo. La región en negro corresponde a
la posición del TATA box.
B)Ensayo de retraso. Los fragmentos de DNA
mostrados en la parte A de la figura se marcaron
y preincubaron con 50ng de TBP o TBP+ TFIIB y
se separaron en un gel de poliacrilamida 5%,
revelándose por autorradiografía.
Figura 2: ensayo de transcripción in vitro
Se realizó empleando extractos celulares obtenidos
a partir de una suspensión celular de arroz que en los
casos indicados fueron suplementados con TBP o
TFIIB recombinantes. La cantidad de producto obtenido
se evaluó por primer extension.
3
2- Se tomo un fragmento de DNA de
400 bp DNA conteniendo el sitio de inicio de la transcripción del gen A y
se estudió con el objetivo de identificar señales que intervienen en el control de la transcripción. Este
fragmento de 400bp es suficiente para dirigir la expresión del gen luc, que codifica para la enzima luciferasa, en
una línea celular adecuada. Se realizaron dos clases de deleciones abarcando tanto zonas del extremo 5' y 3'
del fragmento de 400bp y se midió la capacidad de estas construcciones de dirigir la transcripción del gen luc.
Los resultados obtenidos se muestran en la figura.
a) Explique cómo se realiza el ensayo de expresión transiente empleado en este problema.
b) ¿Qué puede decir del rol del fragmento -250 a -200?
-300 -250
-200
-150
-100
-50
+1
+50
+100
luciferasa
Actividad
luciferasa
c) ¿Qué puede decir del rol del fragmento -150 a -100?
//
//
//
//
//
//
//
//
//
//
//
//
//
//
d) ¿Qué puede decir del rol del fragmento +1 a +50?
e) Ud. sospecha que el factor de transcripción BZIPA es
capaz de regular la expresión del gen A. Diga qué
ensayos haría para probar esta hipótesis y cuáles serían
los resultados esperables.
//
//
100
100
50
50
25
10
0
150
//
//
150
3-
La saciedad en vertebrados está controlada por una hormona codificada por el gen de obesidad (ob).
Mutaciones en el gen ob (homocigotas recesivas) producen una gran expansión del tejido adiposo. Dado que los
animales que poseen un gen ob no funcional son fenotípicamente obesos, se ha especulado que el producto del
gen ob podría tener un rol el la homeostasis energética y en la supresión del apetito. El gen ob codifica para un
polipéptido denominado leptina, que es secretado por el tejido adiposo. La producción de leptina podría estar
regulada a nivel transcripcional por lo que se desea clonar y estudiar su secuencia promotora.
Figura 1: organización molecular del gen ob de ratón
a- Proponga una estrategia para el clonado del promotor del gen ob de ratón
4
b- Una vez clonado el promotor, éste fue secuenciado, obteniéndose la secuencia mostrada a continuación.
¿Qué información puede obtener de la misma? ¿Cómo lo haría?
1 ggtaccaaag gaagacaagt tgccctgagc
61 gttaggtatg caaagagctg tcggaaaaag
121 cctgtcccca agccagcctt ctgtagcctc
181 caagggaccc gtccttaaac taccgctgct
241 ccggctcata ccaagcgccc ccaaacttgc
301 aggcgcctag aatggagcac taggttgctg
361 cgggagttgg cgctcgcagg gactggggct
421 cagttataag aggggcaggc aggcatggag
481 aaggtaaggc ccggggcgcg ctactttctc
541 cagctctgga aattagagaa actgaggcaa
601 aattc
Figura 2: secuencia de promotor del gen ob de ratón
ttgggaccag
cagctggcag
ttgctccctg
cagtagctgc
actcgagggc
ctgccactgt
ggccggacag
ccccggaggg
ctccaccagt
gaaggaggtc
tttctcctct
agtcctggct
cggtgctgga
tggccggacc
gcggctgaag
tgctggcccg
ttgcgcaagt
atccctgctc
ctttctaata
atgtggacag
gagcagccag
cactggtctc
agcaccatcc
tcgaggatta
ttctccctcg
ctgggtgggg
ggcactgggg
cagcagctgc
gcaccccatc
cttggtgttg
c-¿Como determinaría el sitio de inicio de la transcripción?
d- A fin de corroborar el rol de los elementos identificados en la secuencia del promotor ob se fusionó esta
secuencia al gen reportero luciferasa, realizándose ensayos de expresión temporal en adipocitos. Se obtuvieron
los resultados mostrados en la figura. ¿Qué conclusiones saca? ¿Para qué se transfecta con la construcción que
no tiene promotor?
Figura 3: ensayos de expresión transitoria en células de adipocitos
4- En un reciente experimento los dominios de pegado al DNA de la proteína lexA de E. coli fueron fusionados a
un segmento de GAL4 carente de la actividad de pegado a DNA. Para estudiar la capacidad de esta proteína
fusionada en la activación de la transcripción de GAL1, se empleó una célula de levadura (gal-) que expresa
fusión lexA-Gal4 mencionada. Estas células fueron transformadas con un plásmido que no contiene secuencias
UAS pero sí el operador lexA insertado upstream o en la mitad del gen GAL1. Se halló que la proteína lexAGAL4 se comporta de la misma manera que la proteína GAL4 y las UASG en la cepa salvaje ya que presentaba
un fenotipo gal+. En contraposición, la proteína lexA sola no activó la transcripción de GAL1, cuando se la testeó
con el mismo sistema.
¿Qué sugiere este resultado sobre el mecanismo de activación de GAL4? En una situación en la cual hubo una
sobreproducción de la proteína lexA-GAL4, la expresión de GAL1 fue constitutiva. Sugiera una explicación.
Problemas a discutir en la clase 2:
1- Para estudiar el rol de la metilación del DNA en el control de la expresión genética se utilizó el gen de la 
globina humana como sistema de ensayo. Cuando se introduce este gen humano en el genoma de fibroblastos
5
de ratón se puede detectar el mRNA correspondiente, aunque a niveles más bajos que en los glóbulos rojos. Sin
embargo, si el gen es metilado en sus 27 sitios CG, la expresión es bloqueada completamente. Ud utiliza este
sistema para decidir si existe un sitio crítico de metilación suficiente para determinar la expresión de globina.
Utilizando una combinación de mutagénesis sitio
dirigida y síntesis por primer en presencia de 5-metil
dCTP, se generan varias construcciones que están
metilados en diferentes regiones del gen.
Estas construcciones se muestran en la figura B; las
regiones metiladas se indican en negro. La disposición
de los seis sitios de metilación alrededor del promotor
se muestra debajo de las construcciones. Los sitios 11,
12 y 13 no están metilados en la construcción E y los
sitios 14, 15 y 16 no están metilados en la construcción
D. En la construcción F los seis sitios no están
metilados.
Ud. incorpora estas construcciones en los fibroblastos
de ratón, crece las líneas celulares que contienen las
construcciones individuales y mide la síntesis del
mRNA de  globina humana relativa a la línea celular
que contiene la construcción no metilada.
Para confirmar si los patrones de metilación fueron
heredados correctamente, aísla muestras de ADN de
las líneas celulares conteniendo las construcciones
B,C y F y las digiere con HindIII mas CfoI o HpaII. CfoI
y HpaII no hidrolizan el enlace fosfodiéster si los
sitios de reconocimiento están metilados. Los sitios
de clivaje para estas enzimas se muestran en la
figura A junto con los tamaños de los fragmentos
de restricción relevantes superiores a 1 kb. Ud.
separa los fragmentos de ADN mediante
electroforesis en gel y los visualiza mediante
hibridación con
una sonda
radioactiva
correspondiente al fragmento HindIII (figura C).
A partir de los patrones de restricción de las
construcciones aisladas de las líneas celulares
¿puede concluir que las secuencias CG que fueron
metiladas durante su creación fueron mantenidas
en la célula?
¿Puede afirmarse que la síntesis de RNA de  globina humana depende de un único sitio crítico de metilación
para determinar la expresión genética? Explique
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2- La proteína codificada por el gen que causa el tumor de Wilm (WT1) se expresa preferencialmente en riñones
en desarrollo. Niños que tienen ambas copias del gen WT1 mutado y que por lo tanto producen una proteína
WT1 no funcional sufren de tumores en riñón muy temprano en sus vidas. La proteína WT1 tiene un dominio de
unión a DNA de tipo zinc-finger que se une al promotor que codifica para el activador de la transcripción EGR-1.
En la figura se muestra un experimento realizado para estudiar el mecanismo de acción de WT1. Se utilizó el
gen reportero CAT (cloranfenicol acetil transferasa, que transfiere un grupo acetilo del Acetil-CoA al cloranfenicol
para producir Acetil-Cloranfenicol) dirigido por el promotor de EGR-1. Se utilizaron distintas formas de WT1
generadas por splicing alternativo de mRNA de WT1. La región carboxilo terminal de WT1 (amarillo) contiene 4
zinc fingers; WT1-KTS tiene una inserción de 3 aminoácidos en la región de unión a DNA de WT1; WT1-17AA
tiene una inserción de una secuencia de 17 por fuera de la región de unión a DNA de WT1. En la parte (c) de la
figura se muestra una autorradiografía de los productos de reacción del ensayo con CAT. El control no tiene
WT1. Analice los resultados obtenidos y explique cómo WT1 regula la expresión de EGR-1
3.
Células de fibroblasto cultivadas "in vitro" fueron transfectadas ("transformadas genéticamente") con un gen
quimérico conteniendo la secuencia estructural del
gen myoDI (gen que codifica para un factor de
transcripción de activa expresión en mioblastos:
células musculares) y un promotor constitutivo del
virus SV40 (virus animal cuyo promotor funciona en
un amplio rango de células de mamíferos). Como
resultado, se observó la brusca formación de un
mioblasto incluyendo la formación de un sincisio a
partir de células uninucleadas.
a) Explique cómo tan abrupta "transdeterminación” pudo ser causada por un solo gen.
b) ¿Por qué no se utilizó el gen myoDl con su propio promotor para realizar el experimento y se lo cambió por
uno constitutivo?
c) ¿Podría ocurrir lo mismo con cualquier célula de cualquier otro tejido, como ser una célula neuronal? ¿Por
qué?
7
Clase 3
Preguntas guía
I- Indique la o las respuestas correctas
A) Antes de que un RNA mensajero recién sintetizado se una a los ribosomas debe sufrir:
a) Capping.
b) Poliadenilación.
c) Splicing.
d) Transporte al citosol.
e) Todas las anteriores.
B) La secuencia consenso para la adición de poly-A es/está:
a) En el sitio donde se adiciona la cola poly A.
b) AAUAAA
c) Aguas abajo del sitio de clivaje
d) Ninguna de las anteriores
C) Durante el splicing de un pre-RNA mensajero en el núcleo de células eucariotas se forma un "lariat".
Que afirmación sobre los "lariat" es más exacta?
a) El RNA en el lariat es un exón en proceso de ser cortado; el lazo del lariat se forma cuando la adenosina
terminal ataca una unión intron-exon y se une a si misma al RNA exonico
b) La formación del lariat es un evento autocatalitico que no requiere la participación del spliceosoma
c) El lariat se forme por dos reacciones sucesivas de transesterificación
d) El RNA que forma el lariat consiste únicamente en RNA intronico
D) El mecanismo de splicing
a) requiere del clivaje de uniones de alta energía del ATP.
b) de intrones del grupo I (incluyendo intrones de pre-rRNA de Tetrahymena) se inicia por el ataque nucleofílico
del hidroxilo 3' de un nucleótido guanina.
c) El splicing de pre-mRNA nucleares se inicia por el ataque nucleofílico de un hidroxilo 2' de una guanina
interna.
d) Las reacciones individuales de transesterificación son reversibles, pero el proceso completo es irreversible
debido a que la circularización del intrón eliminado es irreversible.
e) En todos los casos los intrones están flanqueados por exones.
E) Qué es snRNP?
a) Un complejo nuclear de proteínas y RNA catalítico
b) Una particular requerida para el reconocimiento de la secuencia señal N-terminal de proteínas destinadas
a la membrana celular
c) Un complejo enzimático requerido para la iniciación de la transcripción en eucariotas
F) Cuáles de los siguientes procesos no requiere de enzimas de naturaleza proteica?
a) RNA editing
b) Escisión del grupo II de intrones
c) Transsplicing
d) Escisión del grupo III de intrones
G) RNA editing es:
a) Una alteración post-transcripcional de las secuencias de mRNAs
b) Una alteración pre-transcripcional de las secuencias de RNAs
c) Unión post-transcripcional de dos moléculas de RNA
d) Ninguna de las anteriores
H) Cuál de los siguientes RNA participa en la exportación de mRNA hacia fuera del núcleo
8
a) snRNA
b) hnRNA
c) tRNA
d) rRNA
I) Los mRNAs de histonas carecen:
a) Colas de poly A
b) Intrones
c) 3'UTR
d) Todos las anteriores
J) Indique cuál de los siguientes procesos involucra dos reacciones de transesterificación
a) Splicing
b) RNA editing
c) Capping
d) Transporte nuclear
K) Si tres proteínas diferentes son codificadas por el mismo gen, esto es probablemente el resultado de:
a) Regulación transcripcional del gen
b) Atenuación
c) Un operón
d) Splicing alternativo del mRNA
e) Tres proteínas diferentes no pueden ser codificadas por el mismo gen.
L). El mecanismo de supervivencia de RNA se refiere a:
a) Estabilización de RNA no procesados por la maquinaria de splicing.
b) Mecanismo de retención en el núcleo de RNA no procesados .
c) Degradación de RNA que carecen de codones de terminación.
d) Degradación de RNA que carecen de señales de terminación de transcripción.
II-Responda brevemente las siguientes preguntas
A). Especifique las modificaciones que sufre el producto de transcripción de un mRNA eucariota. Explique qué
mecanismos se utilizan).
B) ¿Qué modificaciones sufren los RNA ribosomales y de transferencia?
C) ¿Qué mecanismos de degradación de mRNA conoce?
D) ¿Qué mecanismos moleculares post-transcripcionales conoce que sean capaces de producir una sustancial
modificación en la secuencia de un transcripto primario? Describa los 4 tipos de procesamientos. Describa el
editing del RNA.
E) ¿Cómo influyen los distintos órdenes de empaquetamiento del DNA en la expresión genética? ¿Cómo varía el
grado de empaquetamiento durante el ciclo celular? ¿Cómo resulta la susceptibilidad de corte por DNAasa I en
cromatina transcripcionalmente activa con respecto a la inactiva?
F) ¿Cómo influye la metilación de las citosinas sobre la expresión genética en eucariotas? Compare el grado de
metilación de la heterocromatina en relación con el resto del genoma.
G) Indique las características moleculares distintivas de los diferentes tipos de factores de transcripción
eucariotas.
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Problemas a discutir en la clase 3:
1. Existe un solo gen para la fibronectina (FN) en cada célula de mamífero (en realidad dos copias, dos alelos,
cuyas secuencias son idénticas). El gen tiene 70 kb de longitud. Sin embargo, se han encontrado en el
citoplasma de fibroblastos dos RNA mensajeros de 7,7 y 8,0 kb de longitud, respectivamente. El de 7,7 kb es
idéntico en secuencia al de 8,0 kb, excepto por el hecho de que carece de un segmento interno de 0,3 kb.
a) ¿Cómo explica la gran diferencia de tamaño entre el gen (70 kb) y sus mensajeros (aproximadamente 8 kb) ?
b) ¿Cómo explica la existencia de dos tipos de RNA mensajeros de FN diferentes? Discuta los posibles
mecanismos que pudieron originar los dos mRNAs. ¿Qué implicancias biológicas podría tener la presencia de los
dos mRNAs?
c) Ud. supone que algunos tejidos expresan el mensajero de 7,7 kb, mientras que otros sólo expresan el de 8,0
kb, y decide investigarlo hibridando mensajero total de distintos tejidos con sondas de cDNA radioactivo. ¿Cuál
de las dos especies de mensajero detecta en un Northern blot con cada una de las siguientes tres sondas?
c1-un cDNA del mRNA de FN de 7,7 kb
c2-un cDNA del mRNA de FN de 8,0 kb
c3-un cDNA del mRNA del segmento diferencial de 0,3 kb
¿Por qué?
2. Para analizar el efecto de la presencia del CAP en el splicing de pre-mRNA se utilizaron RNAs sintetizados in
vitro a los que se le modificó su extremo 5’, obteniéndose los pre-mRNA indicados en la figura. Posteriormente
se trataron los pre-mRNA con un extracto nuclear, y se analizó el producto de esta reacción por electroforesis
obteniéndose los resultados de la figura.
a) Indique en
forma
esquemática qué
utiliza
como
molde para la
transcripción in
vitro
b) Indique qué
componentes
tiene el extracto
nuclear
adicionado y qué
función cumplen.
Indique además si
cree
necesario
adicionar algún
otro componente
para la reacción.
c) Interprete los
resultados
mostrados en la
figura.
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3.
El gen PRP43 de Saccharomyces cerevisiae codifica para una proteína con actividad ATPasa RNAdependiente que forma parte del spliceosoma.
Con el fin de estudiar su rol en el splicing se
obtuvo un mutante (T123A) que produce una
proteína que carece de la actividad ATPasa.
Ambas proteínas fueron producidas en E. coli
y utilizadas para un ensayo de splicing in vitro
obteniendo los resultados mostrados en la
figura.
a- ¿Qué componentes cree que son necesarios
para el ensayo de splicing in vitro?
b-Haga un esquema del sustrato, producto/s e
intermediario/s de la reacción e interprete los
resultados mostrados en la parte A de la figura.
c- Analice los resultados de la parte B de la
figura. Es la actividad ATPasa de PRP43
necesaria para que ocurra el splicing?
d- Explique el mecanismo de splicing de los
RNA mensajeros. ¿Qué otros mecanismos
conoce?
e- ¿Qué patrón de bandas habría obtenido en
experimentos en los que la preparación de
spliceosomas hubiera sido pretratada de las
siguientes maneras:
e1. Calentamiento a 100ºC por 10
minutos y enfriamiento rápido en hielo
e2. Digestión con una proteasa
e3. Digestión con una DNasa
e4. Digestión con una RNasa
Efecto de Prp43 y T123A exógenas en el splicing:
Parte A: los productos de la reacción fueron analizados en un gel
PAGE desnaturalizantes seguido de autoradiografía
Parte B: los productos de la reacción de splicing fueron primeros
separados en un gradiente de glicerol y las distintas fracciones del
gradiente separadas en un gel PAGE desnaturalizante.
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