ELIchrom FUNGI
Identificación de las principales levaduras de interés médico
25 tests (REF 44328)
ES-2010-11
1 - FINALIDAD
El estuche ELIchrom FUNGI permite la identificación de las principales levaduras halladas en patología humana
utilizando substratos cromógenos. Él permite la diferenciación de Candida albicans y Candida dubliniensis.
2 - INTRODUCCIÓN
La frecuencia de las infecciones fúngicas y en particular las causadas por levaduras ha aumentado
considerablemente a lo largo de los 10 últimos años. Las levaduras son agentes oportunistas. La mayoría son
saprofitos pero pueden convertirse en patógenos cuando existen en el huésped condiciones favorables. Estas
condiciones son principalmente factores fisiológicos: recién nacidos, personas mayores, mujeres embarazadas;
factores locales: frotamientos, maceraciones; factores patológicos: cáncer, insuficiencia inmunitaria, trastornos
metabólicos; factores terapia dependientes: antibioterapia, píldoras anticonceptivas, inmunosupresores,
radiaciones ionizantes, cirugía...
Los cuadros clínicos provocados por estas levaduras son muy variados: afecciones cutáneas (intértrigo, onyxis)
afecciones de las mucosas (candidiasis oral, esofagitis, colitis, vaginitis....) afecciones viscerales y septicémicas.
Las levaduras son hongos unicelulares que se multiplican por gemación. Los principales géneros encontrados en
patología son los siguientes: Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Saccharomyces, Trichosporon.
El género Geotrichum se compone de hongos filamentosos, cuyo micelio produce hifas verdaderas que se
fragmentan en artroconidias rectangulares que varían en tamaño y la redondez de la porción distal.
3 - PRINCIPIO
La identificación de las levaduras se basa en la presencia o ausencia de diversas enzimas, visualizadas por un
cambio de color. Las actividades enzimáticas se manifiestan por tres tipos de reacciones:
• La hidrólisis de 7 substratos cromógenos : las actividades oxidasa y peptidasa de las levaduras, hidrolizan
estos substratos cromógenos y producen la liberación de paranitrofenol, paranitroanilina o de ortonitrofenol,
coloreados en amarillo (ß-NAG, PRO, ONPG, SGL, GLY) o en azul (α-GLU, PHOS).
• La asimilación de 10 substratos naturales:
- La utilización de azúcares se pone en evidencia por el viraje del púrpura de bromocresol (BCP), del violeta al
amarillo o incluso al incoloro (MDG, TRE, GAL-SAC, MAL, CEL, RAF, LAC).
- La resistencia a la actidiona se revela según el mismo principio (pocillo ACT)
- La hidrólisis de la urea libera amoniaco que alcaliniza el medio y hace virar el rojo de fenol (RP) al rosa fucsia
(pocillo URE)
- La reducción de esculina a esculetina por la esculinasa (ESC) produce un complejo pardo a negro en presencia
de citrato férrico.
• La oxidación de 1 substrato sintético: la actividad de fenoloxidasa en presencia de ácido cafeico produce
una coloración marrón (POX).
Cada galería ELIchrom FUNGI incluye también un pocillo de control positivo (pocillo C+) que pone en evidencia
la asimilación de la glucosa; y un control negativo (C-) para ayudar a la lectura de los pozos SGL y GLY.
4 – REACTIVOS
Estuche de 25 test conteniendo:
- 1 frasco TC FUNGI
- 27 frascos SUSPENSION FUNGI
- 25 galerías ELIchrom FUNGI
Descripción
TC FUNGI : Frasco de 4 mL de solución de sulfato de Bario para el control de turbidez.
SUSPENSION FUNGI : Frasco de 4 mL de solución agarosada que contiene Bacto Agar (0,5 g/L), colimicina
(2,5 mg/L) y vancomicina (0,05 g/L).
ELIchrom FUNGI : Galería de 20 pocillos, lista para usar, que incluye :
C+: Testigo positivo conteniendo glucosa y BCP
ß-NAG: contiene un sustrato cromogénico de α-D-glucosaminidasa
PRO: contiene un sustrato cromogénico de L - prolina amidasa
ACT: contiene actidiona, glucosa y BCP
MDG: contiene metil-α -D-glucopyranosido
ESC: contiene esculina
α-GLU: contiene un sustrato cromogénico de α-D-glucopyranosidasa
PHOS: contiene un sustrato cromogénico de fosfatasa
TRE: contiene trealosa y BCP
ONPG: contiene un sustrato cromogénico de ortonitrofenil-ß-D-galactosidasa
C -: control negativo para la lectura de los pozos SGL y GLY.
SGL: contiene un sustrato cromogénico de peptidasa
GLY: contiene un sustrato cromogénico de glicina-amidasa
URE: contiene urea y PR
POX: contiene un sustrato de fenoloxidasa
GAL-SAC: contiene galactosa, sacarosa y BCP
MAL: contiene maltosa y BCP
CEL: contiene celobiosa y BCP
RAF: contiene rafinosa y BCP
LAC: contiene lactosa y BCP
5 - PRECAUCIONES
• Los reactivos de este estuche son únicamente para uso in vitro por personas autorizadas.
• Las muestras y los reactivos sembrados son potencialmente infecciosos; deben ser manipulados con
precauciones de uso y desecharse a continuación respetando las reglas de higiene y la reglamentación vigente
para este tipo de productos en el país de utilización.
• La galería ELIchrom FUNGI que contiene en algunos pocillos materias primas de origen animal deben ser
manipulados con las precauciones de uso correspondientes.
• No utilice los reactivos pasada la fecha de caducidad.
• No utilice los reactivos deteriorados o mal conservados.
6 - RECOGIDA DE LAS MUESTRAS
La identificación de levaduras debe realizarse a partir de colonias jóvenes (24 horas a 48 horas) y perfectamente
aisladas sobre un medio agarosado preferentemente en placa de Petri. Se recomienda efectuar el aislamiento
sobre medios específicos de levaduras.
7 - CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS
Los reactivos conservados a 2-8 º C en su estado de origen son estables hasta la fecha de caducidad indicada
en el estuche. Los reactivos están listos para su empleo.
Los medios SUSPENSION FUNGI y las galerías se utilizan inmediatamente tras su apertura.
8 - REACTIVO Y MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO
• ELIchrom FUNGI Codebook (REF 44329)
• Estufa a 30 ºC
• Pipetas Pasteur
• Recipiente para desechos contaminados
9 - PROCEDIMIENTO
Llevar los reactivos a temperatura ambiente (18-25 ºC) antes de su empleo
9.1. Examen de las colonias aisladas
El examen macroscópico y microscópico de las colonias se efectúa antes de la inoculación de la galeria.
9.2. Preparación del inóculo
Tomar 2 o 3 colonias aisladas idénticas con ayuda de un ansa o de una pipeta Pasteur tapada.
Después descargarlas en un frasco SUSPENSION FUNGI.
Homogeneizar.
La estandarización de la inoculación puede realizarse de diferentes formas:
• Comparando con el frasco TC FUNGI
Ajustar la opacidad del medio sembrado con la del control de turbidez TC FUNGI ayudándose de las rayas
negras de las etiquetas del frasco.
Si el medio es mas claro (inoculación insuficiente), resembrar el frasco hasta la obtención de una opacidad igual
a la del frasco de control de turbidez.
Si el medio es mas turbio ( inoculación muy rica), diluir con ayuda de un nuevo frasco SUSPENSION FUNGI
hasta la obtención de una opacidad correcta.
• Con ayuda de un densitómetro
Verificar con ayuda de un densitómetro que la turbidez del medio sembrado es igual a 2 Mac Farland. Si es
necesario, actuar como se ha indicado precedentemente para ajustar la turbidez.
9.3. Inoculación de la galería
Levantar el adhesivo que recubre la galería.
Inocular los 20 pocillos con 100 µL de SUSPENSION FUNGI sembrado.
Volver a colocar el adhesivo sobre la galería.
9.4. Incubación
Poner en la estufa a 30 ºC máximo durante 24 a 48 horas.
Leer la galería cuando el pocillo testigo positivo ha virado del violeta al amarillo / incoloro.
10 - LECTURA E INTERPRETACION
10.1 Lectura de la galeria
Lectura del pocillo C+
Leer el pocillo C+, si permanece de color violeta prolongar el tiempo de incubación. Si el pocillo C+ se ha vuelto
amarillo o incoloro, leer según el cuadro de colores incluido en el estuche.
Lectura del pocillo C- e interpretación de los pocillos SGL y GLY
Después de la incubación, el pocillo C- es de color amarillo o incoloro. La aparición de un color amarillo en los
pocillos SGL y/o GLY, con una intensidad más alta que el pocillo C- se interpreta como positivo. Si una
intensidad de tinción igual o inferior es visible, incluso presencia de turbidez en los pocillos de SGL y / o GLY,
estos caracteres son considerados negativos.
10.2 Identificación
La interpretación de la galería ELIchrom FUNGI se realiza por un sistema de códigos o por el cuadro de
identificación. Si después de 24 horas de incubación, el código obtenido no esta referenciado, continuar la
incubación 24 horas suplementarias. Si después de estas 48 horas de incubación el código obtenido sigue sin
estar referenciado referirse al cuadro de identificación. Para una levadura, todos los caracteres mayores
indicados en este cuadro tendrán que ser imperativamente positivos salvo en el caso en el que un porcentaje de
positividad se menciona.
Para establecer el código los caracteres se agrupan en tripletes, cuatrupletes o quintupletes:
- ß-NAG, PRO, ACT
- MDG, ESC, α-GLU
- PHOS, TRE, ONPG
- SGL, GLY, URE, POX
- GAL-SAC, MAL, CEL, RAF, LAC
A cada carácter se atribuye un valor cero si el elemento es negativo. Si el elemento es positivo su valor depende
de su posición en en tripletes, cuatrupletes o quintupletes
- 1 para posición 1
- 2 para posición 2
- 4 para posición 3
- 8 para posición 4
- 16 para posición 5
En un mismo grupo, los valores se suman, se obtiene así un numero de 7 cifras. Este código se busca en el
libro de codificación.
Ejemplo: Codigo 7-5-2-00-03 ; en la lista, este código corresponde a Candida albicans
11 - CONTROL DE CALIDAD
Con el fin de verificar la estandarización del método, se recomienda realizar un control de calidad en forma
periódica utilizando las cepas de referencia Candida albicans ATCC 90028 (1) y Candida krusei ATCC 6258 (2).
Lectura en las 24 horas
12 - CAUSA DE ERRORES
• Manipulación en atmósfera no estéril.
• Preparación del inóculo a partir de una mezcla de cultivos.
• Inoculo inferior a Mac Farland 2, puede provocar un resultado falsamente negativo en particular para ESC y RAF.
• Evaporación del contenido de los pocillos debido a que la película adhesiva de la galería no queda bien
adherida durante la incubación.
• Galería incubada a 37 °C en lugar de 30°C.
• Galería leída antes del viraje del testigo de crecimiento.
• Galería no leída después de 24 ó 48 horas de incubación cuando el testigo de crecimiento era positivo.
Y, en forma general, el incumplimiento de las recomendaciones de las presentes instrucciones de uso.
13 - LÍMITES DEL MÉTODO
• El método ELIchrom FUNGI sólo permite identificar las especies presentes en la base de datos.
• Para ciertas cepas, la identificación con la prueba ELIchrom FUNGI debe estar realizada paralelamente al
estudio de los caracteres morfológicos habituales.
14 - PERFORMANCES
La evaluación de las performances se ha realizado utilizando 10 cepas de referencia y 190 cepas recientemente
aisladas de muestras micológicas (43 Candida albicans, 27 Candida dubliniensis, 28 Candida glabrata, 5 Candida
guillermondii, 7 Candida krusei, 7 Candida lusitaniae, 3 Candida kefyr, 21 Candida parapsilosis, 4 Candida rugosa, 13
Candida tropicalis, 1 Candida catenulata, 1 Candida colliculosa, 4 Candida famata, 1 Candida inconspicua, 1 Candida
lipolytica, 1 Candida membranifaciens, 1 Candida nivariensis, 1 Candida palmioleophila, 2 Candida pararugosa, 2 Candida
pelliculosa, 2 Candida zeylanoïdes, 2 Cryptococcus albidus, 1 Cryptococcus laurentii, 5 Cryptococcus neoformans, 3
Rhodotorula mucilaginosa / rubra, 5 Saccharomyces cerevisiae, 3 Trichosporon asahii, 2 Trichosporon cutaneum / mucoïdes,
1 Geotrichum candidum, 1 Geotrichum capitatum, 1 Pichia farinosa, 1 Rhodotorula glutinis). El estudio comparativo ha
sido efectuado en forma paralela a las galerías Auxacolor 2 (Biorad). El porcentaje de concordancia fue del 86%. Entre
las discordancias solamente dos han sido confirmadas para la prueba ELIchrom FUNGI. Finalmente la sensibilidad del test
fue del 98.59 % et la especificidad fue del 99 %.
93.5 % de las cepas fueron identificadas tras 24 horas de incubación.
15 - ELIMINACIÓN DE LOS DESECHOS
Los desechos deben ser eliminados respetando las reglas de higiene y la reglamentación en vigor para este tipo
de productos en el país de utilización.
16 - BIBLIOGRAFIA
CASAL M. and M.J. LINARES. 1983. Contribution to the study of the enzymatic profiles of yeast organisms with medical
interest. Mycopathol. 81: 155-159.
CONTANT G., C. CROUZIER and M. DEBRUYNE. 1993. A new colorimetric system: FUNGICHROM® for medical yeast
identification. In “C.E.M.M.”, Paris, 26th november.
HEALY M.E., C.L. DILLAVOU and G.E. TAYLOR. 1977. Diagnostic medium containing inositol, urea, and caffeic acid for
selective growth Cryptococcus neoformans. J. Clin. Microbiol. 6: 387-391.
PERRY J.L. and G.R. MILLER. 1987. Umbelliferyl-labeled galactosaminide as an aid in identification of Candida albicans. J.
Clin. Microbiol. 25: 2424-2425.
PINCUS D. H. ,D. C. COLEMAN, W. R. PRUITT, A. A. PADHYE, I. F. SALKIN, M. GEIMER, A. BASSEL, D. J. SULLIVAN,
M. CLARKE, AND V. HEARN.1999. Rapid Identification of Candida dubliniensis with Commercial Yeast Identification
Systems. J. Clin. Microbiol. 37: 3533-3539.
WALLER J., G. CONTANT, C. CROUZIER, M. DEBRUYNE and H. KOENIG. 1995. Evaluation of a new yeast identification
system FUNGICHROM® based on chromogenic substrate hydrolysis and a carbohydrate assimilation. J. Mycol. Med. 5: 9297.
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