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Avances en el diagnóstico molecular de Salmonella
PCR aplicada a la avicultura y a la microbiología de los alimentos.
Incidencia, Adquisición y Modos de transmisión de Salmonella
El Género Salmonella (S), agente etiológico de la salmonelosis, afecta a aves de corral,
vacunos, porcinos y ovinos, entre otras especies. Estas bacterias, son los más frecuentes agentes
causales de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs). En el período 1995-1999 fueron el
segundo grupo bacteriano más importante causante de ETA en Latinoamérica y el Caribe. La carne de
aves, huevos y productos derivados son alimentos que, muy frecuentemente, ocasionan brotes de
ETAs.
Estudios epidemiológicos, indican que las aves constituyen un importante reservorio y son
fuente de contaminación de los alimentos. La infección de poblaciones de aves de corral fue notificada
por primera vez a finales de la década de 1970, y luego durante la década de 1980 se expandió
rápidamente a través del Reino Unido, Estados Unidos, América del sur y otras áreas. Durante este
período, la proporción de casos de salmonelosis atribuidos a S. serovar (sv) Enteritidis se incrementó
sustancialmente.
El Género Salmonella, no es parte de la flora intestinal normal de las aves, sino que lo
adquieren en el ambiente en que viven de insectos, roedores, aves silvestres y el hombre, así como
por medio del alimento balanceado y por condiciones predisponentes cuando se crían en forma
intensiva. Las salmonellas colonizan el tracto entérico de las aves y posteriormente su materia fecal,
la cual contamina la cáscara de los huevos durante su pasaje a través de la cloaca y las salmonellas
depositadas en las cáscaras pueden penetrar en la albúmina o clara a través de los poros, donde
permanecen latentes. Esta penetración se produce por un proceso de succión debido a la diferencia
térmica existente entre el huevo recién puesto y el ambiente. Este proceso ocurre más
frecuentemente en gallinas mayores de 1 año, debido a que los poros de la cáscara son de mayor
tamaño. Luego, a medida que el huevo envejece, el hierro contenido en la yema difunde a la albúmina
y al mismo tiempo esta clara de huevo disminuye su contenido de lisozima, permitiendo así la
multiplicación de las salmonellas que estaban latentes dentro del contenido del huevo.
La materia fecal también puede contaminar a las carcasas durante el procesamiento en
los peladeros de aves. Si bien la carne de las aves sanas recientemente sacrificadas es estéril, el tipo
de procesamiento que se lleva a cabo en los peladeros puede influir y causar su contaminación. Las
condiciones del transporte pueden alterar la flora bacteriana que coloniza el intestino y combinados
con el estrés y el hacinamiento que sufren las aves se puede producir un aumento de las salmonellas
justo antes de su faena. Después de la faena es muy importante mantener la cadena de frío durante
todas las etapas de la comercialización.
Finalmente las medidas de higiene y normas sanitarias en la cocina y los
consumidores son fundamentales. Debido a esto, la calidad bacteriológica de la carne de ave
depende de distintos factores, algunos de ellos relacionados al transporte, sacrificio del animal y a su
comercialización, siendo también muy importante considerar ambos extremos de esta compleja
cadena, desde el modo de crianza del ave hasta las normas de higiene de los cocineros y
consumidores.
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La carne de pollo y los huevos son una de las mayores fuentes de toxiinfección
alimentaría en el hombre, siendo Salmonella uno de los principales agentes etiológicos. Datos
estadísticos aportados por distintos países señalan que entre el 50 al 90% de las carcasas de pollo
pueden estar contaminadas con Salmonella. Sin embargo, es importante destacar que mediante la
aplicación de medidas preventivas en la crianza de las aves y en el procesamiento y manejo comercial
de los productos alimenticios y sus derivados, aunadas a una educación sanitaria de la población para
el manejo correcto de los alimentos, para su almacenamiento y elaboración, es posible reducir
considerablemente el grado de contaminación con Salmonella. El conocimiento y la comprensión de las
principales fuentes de infección de este patógeno son importantes para el diseño de las medidas de
prevención y de control de las infecciones. La epidemiología de la transmisión puede variar para cada
serotipo y la importancia de las distintas fuentes de infección varía para cada uno de ellos. Sin
embargo, independientemente del serotipo de Salmonella implicado las acciones preventivas y de
control deben considerar la importancia de las transmisiones vertical y horizontal.
Paratifosis, Tifosis y Pullorosis
Perteneciente al Género Salmonella, S. enterica sv. Enteritidis es una de las más
importantes paratifosis de las aves por la alta difusión entre los animales y su patogenicidad para el
hombre. La sv. Enteritidis se difunde, principalmente, por transmisión horizontal entre las aves
enfermas y en menor grado por trasmisión vertical a través del huevo a la progenie. En el primer caso
la infección horizontal se propaga, por excreción fecal, aerosoles y contacto, en los criaderos, plantas
de incubación, granjas y plantas de matanza. En el segundo caso, la transmisión vertical involucra
tanto a reproductores que contaminan sus progenies de pollitos BB e indirectamente a las plantas de
incubación como también a líneas de ponedoras que pueden producir algunos huevos infectivos por
contaminación de la cáscara en el momento de mayor excreción fecal de salmonellas. Este es el modo
más frecuente de contaminación de los huevos. Además, y sólo excepcionalmente (1 de cada 1.000
huevos analizados), puede contaminarse en forma directa la yema de los huevos en gallinas que
sufren septicemia y peritonitis. El manejo de los huevos puede aumentar considerablemente la
contaminación cruzada por la re-utilización de maples contaminados y el empleo de huevos mal
conservados o viejos.
Las aves adultas son siempre portadoras asintomáticas y pueden transmitir trans-ovo la
infección a sus progenies, siendo los pollitos BB los potenciales manifestantes de síntomas, lesiones y
mortandad en grado variable, según el nivel de inmunidad maternal heredada de sus padres a través
del vitelo. La dispersión sistémica genera transmisión vertical y la excreción fecal extensiva produce
contaminación ambiental difícil de eliminar. Con referencia a la importancia e implicancias de
Salmonella spp. Y especialmente de Salmonella Enteritidis, grupos de trabajo pertenecientes a la
Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización
Mundial de la Salud (OMS) examinaron con detenimiento documentos técnicos sobre la identificación,
caracterización y evaluación de los peligros de la exposición de Salmonella spp. En pollos de engorda
(parrilleros) y huevos.
http://www.fao.org/DOCREP/005/Y4392E/Y4392E00.htm
http://www.fao.org/DOCREP/005/Y4393E/Y4393E00.htm
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Asociados a los riesgos para la salud, estos patógenos tienen un significativo impacto
económico sobre la industria del huevo. La S. sv. Enteritidis suele causar una infección asintomática
en aves adultas y los síntomas de la enfermedad sólo se manifiestan en aves muy jóvenes. En cambio,
S. sv. Gallinarum, con sus biovariedades gallinarum y pullorum, causan la Tifosis y Pullorosis
respectivamente, las cuales son enfermedades mucho más graves para las aves, tanto adultas como
jóvenes, pero no constituyen peligro para el ser humano, ya que el hombre no es susceptible a dichos
serovares. Ambas enfermedades han sido erradicadas de los criaderos industriales de la mayoría de
los países desarrollados aunque aún persisten en países en desarrollo, incluyendo varios de América
Latina. Por este motivo, estas enfermedades si bien no constituyen una zoonosis, deben ser tenidas en
cuenta para su diagnóstico diferencial en la región. Además, la Paratifosis y la Tifosis pueden
presentarse en forma conjunta en los criaderos de aves, afectando a los mismos individuos en forma
simultánea.
Salmonella en alimentos
En América Latina y el Caribe, la incidencia de las infecciones de origen alimentario
produce una tasa de mortalidad por diarrea en menores de 5 años de 0.13 ‰ en Trinidad y Tobago,
0.18 ‰ en Cuba y 9.83 ‰ en Nicaragua. Debido a la falta de reportes, no se poseen datos
estadísticos de muchos países de Latinoamérica.
En el período 1995-1999, Salmonella fue el segundo agente causal más importante
(35,3%) de brotes de ETA en América Latina y el Caribe. Durante el período 1993-2002 se han
registrado en Latinoamérica 1256 brotes de salmonelosis, que afectaron a 48334 personas y
produjeron 15 muertes. El 29,2 % de los casos fue consecuencia del consumo de huevos o productos
derivados y el 9,4 %, fue debido a la ingesta de carne de aves. El 9,8 % de los brotes fue causado por
Salmonella sv Enteritidis y en el 85 % de los casos no se pudo determinar la serovariedad implicada.
Con relación a los alimentos involucrados en dichos brotes el 25% correspondió a derivados de huevo,
mayonesa y carne de aves.
Un alto porcentaje de los casos notificados no puede ser asociado con algún alimento en
particular o el patógeno responsable no puede ser identificado. Esto ocurre debido a que con
frecuencia los resultados de los análisis bacteriológicos demoran y el alimento implicado ya no se
encuentra disponible para su análisis. Por ello, la real frecuencia de los aislamientos no siempre se
conoce y las publicaciones disponibles reportan muchos menos casos que los existentes. Estos datos
apuntalan la necesidad de lograr la rápida detección de Salmonella y otros contaminantes en
alimentos. Debido a esto, uno de los principales objetivos en microbiología alimentaría es la
identificación del agente causal por procedimientos cada vez más rápidos y seguros. Este
hecho exige realizar un control de la calidad bacteriológica de los alimentos que incluye la
investigación de especies, familias o grupos bacterianos cuya presencia refleja sus condiciones
higiénico-sanitarias. Asimismo, la detección del microorganismo contaminante, directamente en el
alimento, prevendría la ocurrencia de enfermedad y las consecuencias que ésta acarrea.
Actuales Técnicas de Diagnóstico
La detección e identificación de los patógenos implicados en las enfermedades
transmisibles es un componente fundamental de la vigilancia epidemiológica. Debido a esto es
necesario estandarizar técnicas de detección para implementar la vigilancia y el control de dichos
microorganismos y prevenir las enfermedades que estos producen en el ámbito nacional, regional y /o
mundial. Los métodos clásicos de diagnóstico bacteriológico son laboriosos, requieren tiempo y no
todas las cepas aisladas pueden ser identificadas, por lo cual la información que brindan es limitada y
dificulta la toma de decisiones. La temprana detección de los microorganismos, prevendría la aparición
de muchos brotes y permitiría implementar controles previos a la ocurrencia de enfermedad.
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Hasta el momento, el aislamiento y la identificación de Salmonella se realiza mediante
métodos de cultivo tradicionales, que consisten en las siguientes etapas:
1.
2.
3.
4.
5.
Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo;
Enriquecimiento en medios líquidos selectivos;
Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos;
Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas; y
Confirmación serológica de dichas colonias.
Todos los medios se incuban en aerobiosis a 37ºC y deben examinarse a las 24 horas. La
utilización de sustratos bioquímicos es la base para la identificación del Género Salmonella. Según el
método bacteriológico de cada laboratorio las colonias pueden ser inicialmente seleccionadas por
algunas pruebas bioquímicas antes de proceder a su biotipificación completa. La confirmación de estas
colonias requiere tiempo y la mayoría de ellas no son Salmonella, sino otros géneros relacionados,
tales como Proteus o Citrobacter.
http://www.who.int/emc/diseases/zoo/SALMSURV/pdfs/Level%201_Protocol.pdf
Asimismo, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) reconoce la
importancia y la necesidad de la existencia de métodos de diagnóstico precisos que caractericen
los aislamientos de Salmonella hasta el nivel de serovariedad.
Las aves infectadas con S. gallinarum y S. pullorum pueden ser detectadas en las granjas
con un método serológico rápido utilizando sangre total y un antígeno coloreado en una prueba rápida
de aglutinación en placa, aunque las infecciones identificadas mediante este método deben ser
confirmadas mediante una técnica bacteriológica clásica. También existen métodos de aglutinación,
tales como las técnicas de ELISA, principalmente usada para detectar a S. Enteritidis. La ventaja de
los exámenes serológicos es que se detecta la persistencia de los anticuerpos IgG circulantes, aunque
el principal inconveniente es que las concentraciones séricas de IgG pueden ser bajas al principio de la
infección y por ende indetectables, mientras que la excreción fecal es elevada. Otra ventaja de la
prueba de ELISA consiste en su facilidad de aplicación para la detección en gran escala de aves
infectadas. Este enfoque ha sido reconocido por la Unión Europea y la Organización Mundial de la
Salud (OMS) para S. Typhimurium y S. Enteritidis. También es factible, que dicha técnica reemplace a
la prueba rápida de aglutinación en placa para S. gallinarum y S. pullorum.
Nuevo Método de Detección Molecular desarrollado por Maplica y
Diagmo
Debido al incremento de la prevalencia de S. sv Enteritidis y su complejo ciclo de vida, la
existencia de métodos de detección rápidos y efectivos son importantes como base de las estrategias
de control. La técnica molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del
inglés Polymerase Chain Reaction) ha revolucionado el diagnóstico molecular de las enfermedades
infecciosas. A diferencia de los métodos tradicionales, que requieren 6 o 7 días para dar un resultado
definitivo, por el método de PCR esto mismo se logra en sólo 1 a 3 días, dependiendo de diversas
modificaciones
en
el
protocolo
de
trabajo.
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La técnica de PCR, es un método rápido que posee ventajas inherentes que la caracterizan
y por ende es un excelente método aplicable a la detección e identificación de Salmonella y de otros
patógenos. Además, las cepas carentes de antígenos somáticos (O) y/o flagelares (H) (cepas
rugosas), que sólo son reconocidas como Salmonella spp. Por el método tradicional de serotipificación
pueden ser identificadas mediante PCR, debido a que esta técnica detecta secuencias específicas de
DNA y no es alterada por variaciones fenotípicas, que se pueden evidenciar por patrones bioquímicos.
Nueva Propuesta para el diagnóstico rápido de la Tifosis, Pullorosis y
Paratifosis de las aves
Considerando la importancia del tema y la necesidad de lograr una detección rápida de las
aves infectadas, el Maplica y Diagmo, trabajaron en dicho proyecto conjunto fueron los siguientes:
1.
2.
Estandarizar la técnica de PCR para su aplicación en la detección del Género Salmonella, de
cepas virulentas (portadoras del plásmido spv, que les confiere la virulencia) y en la
subtipificación molecular del sv. Enteritidis; y
Implementar un servicio de diagnóstico expeditivo y práctico para el envío de muestras a
distancia sin la utilización de soportes de vidrio o medios líquidos.
Para cumplimentar estos objetivos se utilizaron 70 cepas representativas de 25 serovares
de Salmonella y de otros 20 Géneros bacterianos y “primers” específicos del Género Salmonella, del
serovar Enteritidis y del citado plásmido de virulencia distintivo de algunos serovares de Salmonella
patógenos, entre los que se encuentran, Gallinarum, Enteritidis, Dublin, Typhimurium y Choleraesuis.
De este modo, se podría predecir la aparición de brotes, puesto que varios estudios evidencian que
este plásmido es responsable de la virulencia de las salmonellas en las enfermedades humanas y se
ha comprobado que el mismo es esencial para que la bacteria produzca enfermedad sistémica en
animales oralmente inoculados.
En la técnica de PCR que aquí se menciona, se incluye el mencionado “primer” específico
de virulencia que identifica cepas de Salmonella potencialmente patógenas por ser portadoras del
plásmido spv, un segundo “primer” que detecta específicamente a S. Enteritidis y un tercer “primer”
que detecta específicamente y en general a cepas de Salmonella spp.
Además está implementado el sistema de diagnóstico por PCR para Salmonella mediante
la utilización de papeles absorbentes especiales para el envío de muestras a distancia por correo
postal. Una característica innovadora y práctica del servicio que brindamos, consiste en que las
muestras (hisopados de materia fecal, macerados de órganos, etc.) son embebidas en
papeles absorbentes que actúan como matrices de soporte. De este modo se evita la utilización
de medios de cultivo en tubos o frascos, reemplazando dichos materiales por el simple despacho de un
sobre conteniendo los papeles con las muestras a analizar. Todo el material necesario para la
recolección de las muestras es provisto por nuestro laboratorio y el envío de los sobres se realiza por
correo postal a la EEA de Balcarce.
Aplicaciones en la avicultura, la comercialización de sus productos y en
la microbiología de los alimentos
Una aplicación importante de esta técnica es la rápida verificación y contralor de la
salmonelosis en huevos y pollitos BB que se comercializan entre distintos países, dado que son
materiales que requieren un diagnóstico rápido y preciso en las aduanas. Debido a la expansión del
comercio internacional es necesario fortalecer las medidas de control sanitario para de este modo
evitar la diseminación de numerosos agentes infecciosos entre distintas regiones. Dentro del área de
la microbiología de los alimentos, la técnica de PCR puede hacerse extensible a cualquier matriz de
alimentos que se desee analizar, tales como muestras de leche y carne vacuna entre otras.
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La importancia y la utilidad de las técnicas moleculares está evidenciada por el interés de
crear en Latinoamérica una Red de sub-tipificación molecular para la vigilancia de los patógenos
transmitidos por alimentos.
Asimismo, en Europa ha sido creada Enter-net, red internacional para la vigilancia de
Infecciones gastrointestinales en el hombre. Esta red monitoriza fundamentalmente Salmonella y
Escherichia coli O157 y uno de sus principales objetivos es establecer una base de datos internacional
de casos de Salmonella con actualización periódica.
http://www.eurosurveillance.org/em/v04n05/0405-322.asp
Otra importante Red Europea es Salm-Net, cuyo objetivo es prevenir las salmonelosis
humanas en la Unión Europea mediante el refuerzo de la vigilancia internacional con la creación de
laboratorios y de una base de datos disponible a todos los participantes. Salm-Net está financiada por
el programa BIOMED 1 de la DG XII de la Comisión Europea y es precursora de Enter-Net. La red está
compuesta por microbiólogos y epidemiólogos responsables de la vigilancia nacional de la
salmonelosis en 14 países europeos. Además Salm-Net tiende a armonizar los métodos de tipificación
de fagos de Salmonella Enteriditis, S. Typhimurium y S. Virchow
http://www.eurosurveillance.org/em/v00n00/0000-325.asp
Una interesante e importante pregunta a responder es ¿Qué acciones son necesarias y
deberían ser implementadas para combatir los desafíos constantes que presentan las
salmonellas?, Varios expertos del tema han reconocido al respecto que es preciso garantizar una
especialización epidemiológica suficiente que permita aprovechar los avances en microbiología
molecular y estar siempre al día en este campo que evoluciona a una gran velocidad.
http://www.eurosurveillance.org/em/v08n02/0802-321.asp.
De este modo dichos especialistas enfatizan la utilidad y la necesidad de la aplicación de
técnicas moleculares tales como la técnica de PCR.
Sólo de esta forma podrá asegurarse el control que requiere la industria alimenticia para
conocer la calidad bacteriológica de la materia prima que utiliza en la elaboración de sus productos,
así como en las etapas intermedias hasta la obtención del producto terminado. Sólo así, se podrá
proporcionar a los consumidores seguridad higiénico-sanitaria.
Para obtener más información contactarse con:
Julio Rubin C. – [email protected]
Juan Pablo Navarro – [email protected]
Microbiología Aplicada, S.A. de C.V.
www.maplica.com
Huertas No 107 – 1005 México D.F. Tel. 5534 3300 con 3 líneas
Ciencias No 2761 Guadalajara Jal. Tel. 3665 1001 con 5 líneas
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Avances en el diagnóstico molecular de Salmonella