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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
BIOTECNOLOGIA DE HONGOS
AÑO 2011
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TRABAJO PRÁCTICO N° 1
a) Tema: Elementos a utilizar en el laboratorio de Micología
Técnicas de siembra y aislamiento.
Objetivos

Aislar hongos por los siguientes métodos: siembra espontánea, técnica del
anzuelo queratinoso, diluciones sucesivas y plaqueo directo a partir de diferentes
muestras
Materiales

Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos, papel de
filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V, Tinta china (1:2
con agua destilada), pinza, espátula de Driglasky.

Tubos de ensayo estériles.

Tubos de centrífuga estériles.

Pipetas estériles.

Agua destilada y solución fisiológica estériles.

Tween 80 estéril.

Cloranfenicol (5% P/V en alcohol etílico).

Rosa de bengala (1/150).

Embudo y gasa.

Acido cítrico al 10%.

Ansa calibrada.

Pelos de caballo estériles.

Tubos con Sabouraud glucosa en plano inclinado y en columna.

Tubos con Sabouraud glucosa cloranfenicol en columna.

Erlenmeyers estériles.

Tubos con Agar Papa Dextrosa (APD) en plano inclinado y en columna.


Placas de Petri estériles.
Granos, materia fecal, tierra.
Técnicas
1) Aislamiento de hongos ambientales por siembra espontánea:
Se prepararan placas de Petri con medio de Sabouraud glucosa. Se colocan las
placas abiertas en lugares apropiados. Al cabo de 5 minutos se cierran las placas y se
incuban a 28°C durante una semana. Observar. Efectuar una resiembra (repique) de
las colonias de interés en tubos con agar inclinado para obtener un cultivo puro.
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2) Aislamiento de hongos queratinofílicos por la técnica del anzuelo
queratinoso:
En una placa de Petri estéril se coloca una capa gruesa de la tierra en estudio,
sobre ella se depositan pelos de caballo estériles y se humecta. Se incuba a 28°C
durante 15 a 30 días, aislándose luego los hongos de interés.
3) Aislamiento y recuento de hongos de suelo y alimentos por diluciones
sucesivas:
Se colocan 10 g de suelo cuya población fúngica se desea estudiar en un
erlenmeyer estéril, se agregan a 90 ml de agua destilada y se agita, obteniendo luego
una serie progresiva de diluciones (1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000). En placas de
petri estériles se mezclan 10 ml de APD con 0,1 ml de rosa de bengala y 0,1 ml de
cloranfenicol y se deja solidificar. Sobre las mismas se siembran 0,1 ml de las
diluciones 1/1000, 1/10000, 1/100000, dispersándolas con espátula de Driglasky. Se
incuba a 28°C durante una semana. Se realiza el recuento de colonias (en aquellas
placas que contengan entre 30 y 300 colonias) y el aislamiento de las cepas de
interés.
Esta técnica puede emplearse también para alimento finamente molido sembrando las
diluciones correspondientes en medio DRBC y DG18.
4) Plaqueo directo de alimentos particulados:
Para el aislamiento de cepas fúngicas a partir de alimentos particulados (granos,
semillas, trozos de alimentos) se emplea la técnica de plaqueo directo. Los granos son
desinfectados superficialmente sumergiéndolos 2 minutos en una solución de
hipoclorito de sodio (0.4 % de cloro activo – dilución 1/10 de lavandina de uso
doméstico). Después de escurrirlas, las partículas son colocadas utilizando una pinza
estéril, a razón de 8-10 granos por placa, directamente sobre placas de medio DRBC
(diclorán-rosa de bengala-cloranfenicol-agar) y DG18 (diclorán 18 %-cloranfenicolagar) que se incuban a 25 ºC durante 5 días.
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b) Tema: Macromorfología de las colonias fúngicas
Micromorfología del desarrollo fúngico vegetativo
Técnicas de siembra de cepas fúngicas
Objetivos

Describir macromorfológicamente las colonias fúngicas.

Identificar estructuras micromorfológicas básicas del desarrollo vegetativo de un
hongo.
Materiales

Caja de trabajo.

Placas de Petri con desarrollos de hongos filamentosos y levaduriformes crecidos
en distintos medios de cultivo sólido.

Placas de Petri estériles.

Placas de Petri con medio de cultivo Sabouraud.

Soportes en V.

Agua destilada estéril.

Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o líquido de
montar para observación de su micromorfología.
Técnicas
1) Descripción macromorfológica de colonias fúngicas:
Observar distintas colonias fúngicas ya desarrolladas en los medios de cultivo
apropiados. Describir sus características macromorfológicas como color, forma,
aspecto, consistencia, velocidad de crecimiento, etc. como parte del estudio
taxonómico de un hongo.
2) Observación microscópica de desarrollos fúngicos:
Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas
con Gueguén o líquido de montar de desarrollos vegetativos de hongos levaduriformes
y filamentosos (tabicados y no tabicados) hialinos y dematiáceos. Relacionar las
características micromofológicas con la macromorfología que presentan las colonias
fúngicas.
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CARACTERÍSTICAS MACROMORFOLOGICAS DE COLONIAS FÚNGICAS
COLOR


ANVERSO
REVERSO
producción de pigmento difusible
SUPERFICIE






LISA
ACUMINADA
CRATERIFORME
RADIADA
UMBILICADA
CEREBRIFORME
BORDE




LISO
RADIADO
FESTONEADO
LOBULADO
CONSISTENCIA




BLANDA
FILANTE
ADHERENTE
LEÑOSA
ASPECTO






CREMOSO
YESOSO
CEREBRIFORME
ALGODONOSO
AFELPADO
ATERCIOPELADO
DESARROLLO



.
POBRE
REGULAR
ABUNDANTE
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TRABAJO PRÁCTICO N° 2
Tema: Reproducción asexual. Conidiogénesis tálica y blástica.
Reproducción sexual.
Objetivos

Reconocer micromorfológicamente las formaciones de esporas asexuales y
conidios más comunes de la reproducción asexuada tálica y blástica y las
estructuras producto de una reproducción sexual.
Materiales


Caja de trabajo.
Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Gueguén o líquido de
montar para observación de su micromorfología.
Técnicas
1) Observación microscópica de elementos de conidiación tálica y blástica:
Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas
con Gueguén o líquido de montar de esporas asexuales y elementos de reproducción
tálica: clamidoconidios, macroconidios, microconidios, artroconidios (holo y
enteroártricas) y elementos de reproducción blástica: holo o enteroblásticas a partir de
células conidiogénicas determinadas o indeterminadas, tratando de caracterizar los
elementos observados de acuerdo a los criterios de clasificación.
2) Observación microscópica de elementos de reproducción sexuada:
Observar microscópicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones montadas
con Gueguén o líquido de montar de elementos de reproducción sexuada:
cleistotecios, peritecios, apotecios, ascos desnudos, zigosporas, etc.
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TRABAJO PRÁCTICO N° 3
a) Tema: Dimorfismo fúngico
Objetivos


Reconocer las características macro y micromorfológicas de algunos hongos
dimórficos.
Observar la micromorfología de levaduras utilizando el medio de agar harina de
maíz.
Materiales

Caja de trabajo

Tubos de hemólisis con suero estéril

Colonias y preparados de cultivos de diferentes hongos dimórficos

Placas de Petri con medio de cultivo AHM (agar harina de maíz).
Técnicas
1) Producción de tubos germinativos
Inocular 0,5 ml de suero estéril con una pequeña cantidad de levadura con aguja.
Incubar a 37°C, observar microscópicamente una gota de la suspensión cada 30
minutos, hasta las 3 horas. La presencia de tubos germinativos permite la
identificación rápida de Candida albicans y Candida dubliniensis.
2) Observación macro y micromorfológica de cultivos de hongos dimórficos:
Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum
3) Siembra de levaduras en AHM:
Dividir una placa de Petri conteniendo medio de cultivo AHM en cuatro secciones.
En cada cuadrante sembrar con ansa una levadura a partir de un cultivo puro. Efectuar
la siembra realizando tres estrías paralelas, con una separación de 5mm
aproximadamente y con un largo mayor a 20 mm. Colocar sobre ellas un cubreobjetos
previamente flameado y enfriado. A las 48 hs. observar las caracteristicas
micromorfológicas del desarrollo.
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b) Tema: .Pruebas bioquímicas
Objetivos

Interpretar pruebas bioquímicas útiles para la identificación de hongos.
Materiales

Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos, papel de
filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V, Tinta china (1:2
con agua destilada), pinza
Técnicas
1) Interpretación de pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de
cepas fúngicas

Asimilación de hidratos de carbono y sustancias nitrogenadas (auxonograma)

Fermentación de sustancias hidrocarbonadas (zimograma)

Desarrollo de levaduras en medio CHROMagar Candida

Desarrollo de levaduras en medio Agar Semillas de Girasol

Equipo API 20C para identificación de levaduras.

Determinación de la producción de ureasa en medio de Christensen

Tests nutricionales para la diferenciación de especies del género Trichophyton

Crecimiento en medio con Agar Púrpura de Bromocresol – leche - glucosa.
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LÍQUIDOS DE MONTAJE DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS
COLORANTE GUEGUÉN (Azul de algodón)
Ácido láctico.............................................100 g
Sudán III..................................................0.10 g
Azul de algodón.......................................0.10 g
Solución alcohólica de Yodo..............10-20 gotas.
LÍQUIDO DE MONTAR
Glicerina....................................................40 g
Ácido láctico..............................................20 g
Fenol cristalizado......................................20 g
Agua destilada..........................................20 ml
MEDIOS DE CULTIVO
AGAR SABOURAUD GLUCOSA
Medio utilizado para el aislamiento, identificación y mantenimiento de la gran mayoría
de los hongos patógenos
Peptona......................................................10 g
Glucosa......................................................20 g
Agar-agar...................................................20 g
Agua destilada........................................1000 ml
Ajustar el pH a 5.6. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C.
Para preparar Sabouraud Glucosa Cloranfenicol agregar a la preparación anterior
100 ml de solución de cloromicetina (cloranfenicol) 0.5 %P/V (en etanol) antes de
esterilizar.
AGAR PAPA DEXTROSA
Extracto de papa......................................500 ml
Glucosa......................................................20 g
Carbonato de calcio..................................0.2 g
Sulfato de magnesio heptahidratado........0.2 g
Agar-agar...................................................15 g
Agua destilada.........................................500 ml
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Extracto de papa: Pelar la papa y cortarla en trozos pequeños. Poner a hervir con 500
ml de agua destilada. Filtrar a través de una gasa y reponer el volumen anterior.
Añadir los otros componentes. Disolver por calentamiento. Esterilizar durante 15
minutos a 121°C.
DICLORAN – ROSA DE BENGALA – CLORANFENICOL – AGAR (DRBC)
Glucosa.....................................................10 g
Peptona.......................................................5 g
KH2PO4...................................................…..1 g
MgSO4.7H2O.............................................0.5 g
Agar-agar…................................................15 g
Rosa de Bengala......................................25 mg
(soluc. 5% p/v en agua, 0.5 ml)
Diclorán.......................................................2 mg
(soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml)
Cloranfenicol............................................100 mg
Agua destilada..............................................1 l
Después de agregar todos los ingredientes, esterilizar por autoclavado a 121 °C
durante 15 minutos. PH final entre 5.5 – 5.8. Almacenar el medio ya preparado lejos de
la luz ya que fotoproductos del rosa de bengala son altamente inhibitorios de algunos
hongos, especialmente levaduras. En la oscuridad el medio es estable por más de un
mes a 1-4 °C. Las soluciones stock de rosa de bengala y cloranfenicol no necesitan
esterilización y también son estables por largos períodos.
DICLORAN 18% GLICEROL AGAR (DG18)
Glucosa......................................................10 g
Peptona........................................................5 g
KH2PO4...................................................…..1 g
MgSO4.7H2O.............................................0.5 g
Agar-agar…................................................15 g
Glicerol.....................................................220 g
Diclorán.....................................................2 mg
(soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml)
Cloranfenicol..........................................100 mg
Agua destilada...............................................1 l
Agregar los componentes minoritarios y el agar a aproximadamente 800 ml de agua
destilada. Calentar para disolver el agar y completar a 1 litro con agua destilada.
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Agregar el glicerol. Notar que la concentración final del glicerol es 18% p/p. Esterilizar
por autoclavado a 121 °C durante 15 minutos. PH final 5.5 – 5.8, Aw: 0.955.
AGAR HARINA DE MAÍZ
Harina de maíz amarillo.............................40 g
Agar-agar...................................................15 g
Agua destilada........................................1000 ml
Disolver la harina de maíz en 500 ml de agua destilada. Calentar hasta disolución
completa. Filtrar a través de gasa y reconstituir el volumen anterior. Añadir el agar
disuelto en los 500 ml de agua destilada restantes. Volver a calentar hasta disolver
todos los componentes. Filtrar hasta obtener un líquido transparente. Esterilizar
durante 15 minutos a 121°C.
AGAR SEMILLAS DE GIRASOL
Extracto de semillas de girasol...............200 ml
Glucosa.....................................................10 g
Agar-agar..................................................20 g
Agua destilada........................................800 ml
Autoclavar 15 minutos a 121 °C.
Preparación de extracto de semillas de girasol: Moler a polvo 70 g de semillas de
girasol con cáscara, agregar 350 ml de agua destilada. Autoclavar 15 minutos a 121
°C y filtrar a través de gasa estéril.
AGAR PÚRPURA DE BROMOCRESOL – LECHE – GLUCOSA
Solución A
Leche en polvo descremada……………….20 g
Soluc. Alcohólica de PBC………………….0.5 ml
Agua destilada..........................................250 ml
Disolver todos los componentes
Solución PBC
Púrpura de Bromocresol……………………1.6 g
Alcohol………...........................................100 ml
Solución B
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Glucosa………………………………………10 g
Agua destilada............................................50 ml
Disolver todos los componentes
Solución C
Agar…………………………………………..7.5 g
Agua destilada...........................................200 ml
Ajustar el pH a 6.6
Una vez disueltos todos los componentes esterilizar por separado y luego mezclar
todas las soluciones en una.