GENÉTICA APLICADA TEMA 1: CONCEPTOS BÁSICOS INGENIERÍA GENÉTICA •

GENÉTICA APLICADA
TEMA 1: CONCEPTOS BÁSICOS
• INGENIERÍA GENÉTICA
¿Qué es la ingeniería genética?, es un conjunto de métodos, técnicas y procedimientos destinados al
aislamiento, caracterización, modificación, clonaje y expresión de ácidos nucleicos.
Su objetivo más profundo es el análisis, la modificación y la utilización de la información genética con el fin
de descubrir las reglas del funcionamiento celular, e incluso, reconducir la vida de la célula hacia metas más
programadas.
El objetivo principal es estudiar los ácidos nucleicos, su modificación y la utilización de la información que
hay en ellos. Estudiar como funciona este material hereditario en las células, y después modificarlo para
obtener los resultados que queramos.
La ingeniería genética nace a principios de los años 70, gracias al descubrimiento de las endonucleasas de
restricción, y a las técnicas de secuenciación, de síntesis química y empleo de vectores de clonación.
Pese a todo esto surgen reticencias bélicas, científicas y en relación con la eugenesia.
• APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA.
1.− Investigación:
• Clonación y secuenciación: proporciona herramientas para poder realizar diferentes técnicas.
• Análisis de la función: mutagénesis. Mutar genes concretos o secuencias concretas.
• Genómica, proteómica; permite la secuenciación de genomas concretos o población de proteínas de un tipo
en un determinado momento.
2.− Medicina: para el diagnóstico de enfermedades, para terapia génica.
3.− Biotecnología: implica el uso de organismos vivos (o partes de organismos vivos) para hacer productos o
resolver problemas específicos. Tenemos técnicas tradicionales:
• Técnicas de mejora animal y vegetal tradicionales.
• Empleo de levaduras en la fabricación del pan, vino o cerveza.
Y también hay técnicas actuales: como manipulación genética de organismos para:
• Bioproducción: empleo de bacterias, levaduras, algas, plantas o animales como factorías para la producción
de sustancias de interés.
• Mejora ganadera o agrícola: se mejoran genéticamente plantas y animales para que sean resistentes a
plagas, para tener un mayor o menor tamaño, para acelerar o ralentizar su maduración, etc.
• Biodegradación.
4.− Ecología: se puede aplicar en:
• Biología de la conservación.
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• Estudios de la diversidad genética.
• Transferencia de núcleos.
• Investigación.
• TÉCNICAS BÁSICAS
1.− Recolección y almacenamiento de muestras.
2.− Extracción de ácidos nucleicos.
3.− Separación de aann mediante electroforesis en gel.
4.− Modificación enzimática de aann (generalmente tratamiento con endonucleasas de restricción)
5.− Inmovilización del aann mediante transferencia a soportes sólidos.
6.− Preparación de sondas marcadas.
7.− Hibridación de las sondas con aann inmovilizados.
8.− Otras técnicas: PCR, secuenciación, clonación de ADN.
• EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS
Las fuentes de ácidos nucleicos son variadas:
1.− ADN celular total (cromosómico), en bacterias, células, tejidos,
2.− ADN plasmídico o extracromosómico.
3.− ADN de orgánulos: mitocondrias o cloroplastos. Primero se separa el orgánulo por centrifugación y
después extraer el ADN.
4.− ADN viral.
5.− ARN.
Para hacer la extracción del ADN celular total el primer paso es la lisis celular, tiene que ser suave para que el
ADN no se degrade. Se puede utilizar un detergente como el SDS, utilizando un alcali o hirviéndolo. Tenemos
un extracto que tiene el ADN y más compuestos.
Para separar el ADN del resto de los compuestos se hace una centrifugación concreta y tenemos un extracto
celular con ácidos nucleicos y también otros contaminantes. Después se hace un tratamiento enzimático con
proteasas que degradan algunas proteínas contaminantes.
El siguiente paso es la extracción del ácido nucleico por solubilización diferencial. Se basa en que los ácidos
nucleicos tienen propiedades diferentes a las de las proteínas. Tienen una carga negativa y son hidrofílicos.
Las proteínas son más hidrofóbicas, por eso añadimos al extracto un solvente orgánico, que suele ser el fenol,
mezclamos y en el fenol se quedan retenidas las proteínas porque son hidrofóbicas y los ácidos nucleicos se
quedan en la fase acuosa, que se queda arriba. Debajo está la fase fenólica mas densa, donde están las
proteínas y hay una interfase donde hay proteínas coaguladas.
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Para la concentración de los ácidos nucleicos se añaden sales y etanol absoluto. El ADN precipita y forma una
maraña blanquecina. Con una varilla de vidrio se saca el ADN que tiene mucha afinidad por el vidrio. Se pone
en un tubo con agua y se vuelve a resuspender.
La extracción del ARN es prácticamente igual.
Una vez extraídos los ácidos nucleicos se hace la caracterización de estos. Nos fijamos en tres cosas:
1.− En su concentración.
2.− En su pureza.
3.− En su tamaño.
Para la medida de la concentración se mide la absorbancia a 260 nm. La absorbancia da idea de su
concentración. La relación es que a una absorbancia a 260 nm que sea igual a 1 le corresponde una cantidad
de ADN de cadena doble de 50 µg/ml. Si es ADN de cadena simple o ARN este valor varía.
Para la medida de la pureza se mide la absorbancia a 260 nm y a 280 nm, y se calcula el cociente entre las dos.
Para un valor entre 1,8 y 2 es una muestra pura o con pocos contaminantes. Para valores menores de 1,8
indica que la muestra está contaminada por proteínas. Y para valore mayores que 2 quiere decir que la
muestra está contaminada por ARN.
La absorbancia a 280 nm da una idea de las cantidades de proteínas que hay en la muestra. A una relación de
1,5 le corresponde una contaminación de proteínas del 30%.
Para medir el tamaño, se mide con la electroforesis.
• ELECTROFORESIS EN GEL.
Las moléculas de ácidos nucleicos tienen carga negativa, y si se someten a un campo eléctrico se mueven del
polo negativo al positivo, y este movimiento depende de dos factores:
1.− La forma de la molécula.
2.− La relación carga/masa.
En solución todas las moléculas de ADN tienen la misma forma. La relación carga/masa también es
equivalente entre todas las moléculas. Se ponen moléculas diferentes en solución y se mueven todas igual y no
se pueden separar en tamaños.
Necesitamos un factor que nos permita que las moléculas se separen en función a su tamaño, o sea, una
matriz. Esta puede ser de Acrilamida o de Agarosa.
La acrilamida nos permite separar moléculas de ácidos nucleicos con pesos muy parecidos. La agarosa tiene
mayor resolución para moléculas más grandes.
En una matriz el ADN migra en función de su forma, su relación carga/masa y de su tamaño.
La matriz de agarosa está formada por polímeros de arabinosa. Un vez que se gelifica se van quedando poros,
y por esos poros es por donde migra el ADN. Las moléculas pequeñas se mueven más rápido que las
moléculas más grandes. Para poder ver el ADN hay que teñir el gel con un colorante intercalar, es una
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sustancia que se mete entre las dos hebras de ácidos nucleicos (por eso son altamente cancerígenos). Si no hay
ácidos nucleicos no hay colorante. Estos colorantes se pueden excitar con luz ultravioleta y emiten
fluorescencia.
Para averiguar el tamaño de la molécula hay que utilizar un marcador de peso molecular, que son soluciones
de ADN lineal de cadena doble que tienen tamaño conocido.
Hay diferentes factores que afectan a la migración del ADN:
• Tamaño de la molécula; la relación que hay entre el tamaño y la migración no es lineal, la distancia es
inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula (y se hace lineal). Se calcula la gráfica
para el marcador que hemos puesto en el gel con la muestra. Medimos la distancia que ha recorrido nuestra
muestra y en la gráfica extrapolamos. Todo esto teniendo en cuenta que el marcador y la molécula muestra
tienen que ser del mismo tipo, porque hay otros factores que afectan a la migración del ADN.
• Concentración de la agarosa; cuanto mayor es la concentración de la agarosa los huecos que quedan para
que pase el ADN es mucho menor. Si está muy concentrado, las moléculas muy pequeñas se pueden mover
más fácilmente que las grandes, de manera que nos permite mayor resolución en las moléculas más
pequeñas. Cuando la agarosa está muy diluida o si está muy concentrada no nos da una buena separación.
La agarosa muy concentrada es para separar fragmentos mas pequeños, si está menos concentrada separan
fragmentos mas grandes.
• Conformación del ADN; una molécula de ADN puede ser lineal, circular y circular enrollada. Estas tienen
el mismo tamaño y todas se deberían mover igual. En general se cumple que el ADN superenrrollado va
mas rápido que el ADN circular y este mas rápido que el lineal. Si la agarosa esta muy diluida puede ser
que la lineal sea más rápida que la circular.
• Presencia de colorantes intercalares; al meterse entre las hebras de ADN afectan a su movilidad en un gel
de agarosa. Normalmente primero se hace la electroforesis y después se añade el bromuro.
• Composición del tampón de electroforesis; hay dos tampones básicamente, el TAE y el TBE. El TBE tiene
mejor capacidad de tamponamiento, pero normalmente tiene más inconvenientes. El TAE tiene mejor
resolución en moléculas de peso molecular bajo, en relación al TBE que es mejor para moléculas de mayor
tamaño.
• Voltaje; si el voltaje es muy alto no se da tiempo a las moléculas a que se separen en función de su tamaño.
Para moléculas de alto peso molecular hace falta voltajes muy pequeños.
• Dirección del campo eléctrico; hay veces en las que conviene ir cambiando la dirección del campo eléctrico
y nos permite separar moléculas de alto peso molecular.
• APLICACIÓNES DE LA ELECTROFORESIS EN GEL.
1.− Aplicación analítica: para calcular el tamaño de ADN por comparación con un marcador de peso
molecular hay que correr el marcador junto con el ADN, se representa el tamaño en relación con la distancia
recorrida del marcador, y después se compara con las distancias. Si se representa el logaritmo del tamaño
frente al tiempo sale una recta.
2.− Averiguar la calidad de la muestra de ADN. Si está degradada, si está contaminada con ARN, como de
concentrada está, etc.
3.− Estudio de interacciones entre moléculas de ácidos nucleicos o entre ácidos nucleicos y proteínas. Si hay
interacción de la proteína con el ADN se pega a él y el ADN ya no migra igual, migrará mucho menos que las
moléculas que no están unidas a proteínas, es el análisis de retardo en gel de agarosa, que es para estudiar este
tipo de interacciones.
4.− Aislamiento de moléculas de tamaño determinado. Queremos separar de un plásmido un fragmento de
este que nos interesa, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina. Cortamos los fragmentos y lo tenemos
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todo mezclado en un tubo de ensayo, hacemos electroforesis y cortamos el fragmento del gel que nos interesa
y hacemos una solución.
TEMA 2: RESTRICCIÓN Y LIGAMIENTO DEL ADN IN VITRO
• INTRODUCCIÓN
Hasta los años 70 la fragmentación de los ácidos nucleicos era inespecífica, o sea, un corte al azar de forma no
precisa y no reproducible. La fragmentación al azar no sirve prácticamente para nada.
Entre la fragmentación inespecífica podemos encontrar métodos físicos como pasar el ADN por una jeringa
con una aguja muy fina. También hay procedimientos químicos, por ejemplo sometiendo al ADN a pH ácido,
primero se rompe el enlace entre la base y se van perdiendo bases al azar, normalmente donde hay purinas
(depurinación), si tarda mucho se rompe el enlace fosfodiester. También puede ser mediante enzimas, como
las nucleasas que degradan ácidos nucleicos de forma inespecífica.
A partir de los años 70 se descubre la fragmentación específica mediante Endonucleasas de Restricción, que
son enzimas capaces de cortar una molécula de ADN de cadena doble por sitios específicos, y que fueron
descubiertas gracias al fenómeno de restricción controlada por el hospedador.
La restricción controlada por el hospedador se basa en que las bacterias han desarrollado un sistema de
defensa frente a la entrada de ADN exógeno, y este sistema de defensa está basado en dos componentes:
1.− Componente 1: son enzimas que reconocen secuencias específicas en el ADN y las cortan. Por lo que
pueden destruir el ADN exógeno.
2.− Componente 2: para asegurar que sólo el ADN viral será degradado, modifican el ADN propio en los
sitios reconocidos por su enzima de restricción, de manera que al reconocerlos no los degradará (suele ser
mediante una metilación). Es una manera de proteger el ADN propio.
La restricción controlada por el hospedador es un fenómeno que fue descubierto por Werner Arber al estudiar
la capacidad del fago para infectar distintas cepas de E. coli. Cada cepa tiene su propia endonucleasa de
restricción que degrada cualquier molécula de ADN que no tenga el patrón de modificación de la misma. La
modificación se lleva a cabo mediante la metilación del ADN.
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• RESTRICCIÓN DEL ADN IN VITRO
• Sistemas de modificación − restricción (M − R).
¿Qué son?
Las endonucleasas de restricción son enzimas nucleolíticas que catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiester
internos en las dos hebras de una molécula de ADN bicatenario, mayoritariamente por sitios específicos
(dianas o sitios de restricción), y que en la naturaleza se encuentran formando parte de los sistemas de
restricción − modificación bacterianos.
Estos sistemas desempeñan en la célula bacteriana una función de protección genética, dirigida a impedir el
establecimiento en su interior de material genético exógeno que pudiera codificar productos capaces de alterar
la vida celular. Algunos sistemas R−M están codificados en genes cromosómicos, otros en plásmidos e
incluso en bacteriófagos.
¿Cómo funcionan?
Básicamente, el sistema incorpora dos actividades enzimáticas: una metilasa y una endonucleasa, ambas con
una misma especificidad de secuencia. El sitio o diana de reconocimiento es una corta secuencia de pares de
bases, constituido por lo tanto por las dos hebras. Ambas actividades van a reconocer la misma secuencia en
su ADN sustrato, luego actuará una u otra en función del estado de metilación de la diana:
• Si no está metilada, la endonucleasa, más potente, cataliza la rotura de las dos hebras del ADN.
• Si está metilada en ambas hebras, la nucleasa no actúa; la metilación protege al ADN haciendo que los
sitios específicos sean resistentes a su acción.
• Si está metilada únicamente en una de las dos hebras (hemimetilada), es igualmente inmune a la rotura por
parte de la nucleasa; entonces la metilasa catalizará la metilación de la hebra no metilada.
La metilación es una forma de señalizar el material genético de la bacteria y evitar su rotura por el propio
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sistema de restricción. Cuando el ADN cromosómico es replicado, las dianas de restricción de las moléculas
hijas están metiladas sólo en la hebra parental (dianas hemimetiladas); en ese estado se encuentran protegidas
contra la nucleasa. Cuando estos sitios son reconocidos por el sistema R−M, la nucleasa no actúa, pero sí la
metilasa que modifica la hebra aún no metilada para producir una diana ya metilada en ambas hebras. En los
casos de invasión por ADN exógeno, por ejemplo tras la infección por un bacteriófago, el sistema R−M lo
investigará y reconocerá en él una o varias dianas específicas del sistema, que normalmente no estarán
metiladas en ninguna de las dos hebras, entonces la acción de la nucleasa se impone a la metilasa y el ADN
del fago resultará degradado.
La presencia de un sistema R−M es muy normal entre bacterias; incluso no es raro que una estirpe posea más
de uno. Sin embargo, algunos bacteriófagos han desarrollado mecanismos para evitar las defensas bacterianas,
tales como metilasas con la misma especificidad que el hospedador, inhibidores de la endonucleasa celular o
eliminación de su genoma de los sitios reconocidos por el sistema R−M bacteriano. Además, en raras
ocasiones, el ADN invasor puede escapar a la acción de la restricción celular por fallo del sistema. En estos
casos, el ADN extraño resulta metilado en las dianas específicas de la célula y, a partir de ese momento, tanto
él como las copias que resulten de su replicación se encontrarán modificados según el patrón de metilación
propio de la célula y serán capaces de sobrevivir en ella. El sistema R−M es específico de estirpe y por ello no
impide la transferencia de ADN entre células de la misma estirpe, por ejemplo mediante conjugación; en este
caso, el ADN transferido vendrá metilado según el mismo patrón que existe en la célula receptora.
• Tipos:
Hoy en día se conoce un gran número de sistemas R−M, que, según una clasificación probablemente
provisional, se suele agrupar en tres tipos:
• Los sistemas R−M tipo I; son estructuralmente complejos e incorporan tres tipos de subunidades:
• La subunidad R, responsable de la restricción.
• La subunidad M, que cataliza la metilación.
• La subunidad S, que marca la especificidad de sustrato y es la encargada de reconocer la secuencia
específica de la diana.
El agregado multinumérico cataliza tanto la metilación como la restricción. Requiere iones Mg2+,
ATP, y S−adenosilmetionina como cofactores. El sitio de reconocimiento de estos sistemas consiste
en una secuencia específica de 3 pb, separada una cierta distancia de otra secuencia específica de 4
pb; la secuencia de la región central es intranscendente, pero su longitud es importante porque hace
que las regiones específicas aparezcan en el mismo costado de la doble hélice del ADN, lo que nos
dice que es una diana bipartida y asimetrica. El sitio de la rotura catalizada por su actividad de
restricción se localiza a más de 1000 pb del sitio de reconocimiento y no implica ninguna secuencia
específica, esta distancia implica que disminuya mucho el interés por su utilización.
• Los sistemas R−M tipo II; son los más comunes en el mundo bacteriano. Su estructura proteica es
sencilla. Quizá lo más interesante de este tipo de sistema es que las actividades de metilación y
restricción se localizan en entidades enzimáticas separadas. Las dos actividades enzimáticas
constituyentes de la enorme mayoría de los sistemas tipo II actúan en la misma diana de
reconocimiento, bien metilando ciertas bases, bien cortando ciertos enlaces. En este caso, la rotura se
da por sitios específicos y definidos, lo que permite su utilización en trabajos con fines analíticos y en
el diseño de una gran variedad de experimentos. En este caso como vemos la nucleasa y la metilasa
están separadas, por lo tanto las reacciones están también separadas. Su diana es simétrica
(palindrómica), y el sitio de corte es en la misma diana.
• Los sistemas R−M tipo III; son bastante raros. Presentan dos tipos de subunidades, la R, responsable
de la restricción, y la MS, responsable tanto de la metilación como del reconocimiento del sitio
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específico de acción. Ambas actividades requieren Mg2+, ATP y S−adenosilmetionina. La metilación
se da en residuos de adenina en el propio sitio de reconocimiento, pero la restricción se produce fuera
de este, a unos 24 o 26 pb. Esto reduce mucho su aplicación para el análisis y manipulación de ADN.
♦ Otros sistemas que cortan o mutilan el ADN.
♦ Sistemas de restricción dependientes de metilación; cortan si la secuencia está metilada.
♦ Sistemas de modificación del ADN; enzimas que mutilan determinadas secuencias diana.
◊ Sistemas M−R tipo II.
1.− Nomenclatura.
Son tres letras, que corresponden, la primera, a la inicial del género y las otras dos a
las iniciales de la especie bacteriana de donde se ha aislado. Una cuarta letra, en
algunos casos, que identifica la estirpe o el tipo celular origen de la actividad. Un
número, en romano, que indica el número de orden de su aislamiento a partir de una
cepa que posea varios sistemas R−M. Las tres primeras letras van en cursiva. En caso
de ambigüedad, si es una enzima de modificación se coloca delante una M·, y si es
una enzima de restricción una R·.
EcoRI
M·EcoRI
R·EcoRI
2.− Sitios diana y frecuencia de distribución.
El sustrato de estas actividades es un dsADN: catalizan la hidrólisis simultánea de las
dos hebras de un ADN bicatenario y no actúan sobre estructuras en monohebra. La
diana o sitio de reconocimiento de estas endonucleasas está constituida por una
secuencia específica de algunos pares de bases, normalmente de cuatro a ocho.
La complejidad del sitio depende de su longitud y, en teoría, la probabilidad de que
una cierta diana esté presente en la secuencia de un ADN varía en función inversa a
aquélla: la probabilidad de que en una determinada posición aparezca una
determinada base es de 1 en 4; la probabilidad de que se dé una secuencia de cuatro
pares de bases es (1/4)4, o sea, 1/256; y así sucesivamente. Aunque la realidad
siempre se desviará de estos números, es importante tenerlos en cuenta a la hora de
plantear un experimento: si se digiere un ADN largo con una enzima de restricción
que reconoce un sitio de seis pares de bases se obtendrán fragmentos de un tamaño
que varía alrededor de 4000 pb, mientras que si se usa una enzima que rompe por
sitios de ocho pares de bases, la media de los fragmentos producidos será de más de
65 kb. Para estos cálculos conviene tener en cuenta el contenido en pares de GC de la
diana y del ADN que se quiere fragmentar (si se conoce); en la mayoría de los casos,
este último es menor del 50%, por lo que la probabilidad de que contenga un sitio
rico en GC, es menor que la teórica.
La estructura del sitio presenta simetría rotacional. Salvo raras excepciones, las
dianas de las endonucleasas del tipo II, son simétricas, presentan secuencias
palindrómicas en ambas hebras. Esta característica estructural es muy peculiar; podría
estar relacionada con la capacidad de las secuencias palidrómicas para formar
estructuras especiales (cruciformes) que fueran la base del reconocimiento por parte
de estas endonucleasas, aunque, de momento, no se dispone de ninguna explicación
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de peso para este hecho.
3.− Tipos de extremos tras el corte con endonucleasas de restricción.
Los puntos de rotura concretos son dos enlaces fosfoéster, localizados uno en cada
hebra, que se encuentran dispuestos simétricamente según el mismo eje que marca la
simetría de la secuencia de las hebras en la diana. Quizá esto es el reflejo de todo un
mecanismo de reconocimiento y rotura basado en la simetría del sitio. La hidrólisis de
los enlaces fosfoéster suele dejar al resto de fosfato esterificando al OH en posición
5´ de una desoxirribosa y un OH libre en la posición 3´ de la desoxirribosa contigua.
Así como el corte es simétrico podemos encontrar extremos romos, extremos
cohesivos 5´ prominentes, y extremos cohesivos 3´ prominentes, según la estructura
de la diana.
4.− Isoesquizómeros.
Dos o varios enzimas de modificación−restricción son isoesquizómeros cuando
reconocen la misma secuencia diana. Estos pueden cortar en la misma posición o en
posiciones diferentes y en ambos casos siguen siendo isoesquizómeros.
5.− Actividad estrella.
Es la actividad que presentan algunas enzimas de tipo II en condiciones no óptimas
(pH, fuerza iónica, presencia de contaminantes), caracterizada por un descenso en la
especificad del sitio de reconocimiento.
• Aplicaciones de las endonucleasas de restricción tipo II.
1.− Corte del ADN in vitro en sitios específicos.
Se hace una reacción con los siguientes componentes:
◊ ADN a digerir.
◊ Enzima de restricción.
◊ Tampón (pH).
◊ Iones Mg+2 (cofactor).
◊ Sales.
◊ Agentes reductores.
◊ Otros componentes como BSA o detergentes.
Se incuba a temperatura óptima (normalmente 37ºC) y se detiene la reacción. Para
cortar el ADN hacemos una digestión parcial en contraposición a la digestión total, si
las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción no son las óptimas no se
producirá el corte en todas las dianas existentes, efecto conocido como digestión
parcial, y se consigue hacer jugando con la concentración de enzimas y con el tiempo
de reacción. También haciendo una digestión doble en contraposición a una simple,
se produce la digestión empleando dos o más enzimas al mismo tiempo si es posible,
y si no es posible se hace en reacciones secuenciales. Si las dos actúan en condiciones
iguales se pueden utilizar conjuntamente, sino se trabaja con una y después con otra.
2.− Elaboración de mapas de restricción.
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Un mapa de restricción es una representación gráfica de las posiciones o de los sitios
de corte para diferentes endonucleasas de restricción en una misma molécula de
ADN. Se pueden elaborar:
◊ Con digestiones parciales: se marcan los extremos 5´ con fósforo radiactivo (se
elimina el fósforo en 5´ y se añade fósforo radiactivo). Queremos una molécula
marcada en un solo extremo, para esto digerimos con una endonucleasa de restricción
que genere fragmentos de diferentes tamaños. Se generan extremos 5´ sin marcar. Se
hace el mapa con todos los fragmentos y después pegamos los resultados, esto si
tienen diferentes tamaño, si tienen el mismo tamaño no los podemos separar. Se hace
una digestión parcial de cada uno de los fragmentos con nucleasas de restricción a
localizar, después se hace una electroforesis. El resultado de está se ve mediante
autorradiográfia. Si se provoca solo un corte obtenemos una parte marcada y la otra
no. Si se producen varios cortes solo veremos los bordes correspondientes a los 5´
marcados.
◊ Con digestión doble: se hacen las digestiones simples totales por separado y luego se
hacen las digestiones dobles. No hace falta marcar porque los fragmentos dicen como
es el enzima de restricción. Se hacen digestiones simples de cada uno y después se
hace la doble. Después se corren todas en un gel.
3.− RFLP´s.
Es el polimorfismo para la longitud de los fragmentos de restricción. Hacen
referencia a variaciones existentes en los individuos para la longitud de los
fragmentos de restricción. Se pueden utilizar para el diagnostico de enfermedades,
identificación de individuos y otras aplicaciones.
Tenemos ADN de individuos diferentes y lo sometemos a digestión con enzimas de
restricción. El individuo 1 tiene dos dianas y como es diploide, el otro también tiene
las mismas dianas. El 2 también es diploide y también tiene las mismas dianas, pero
en una de las cadenas tiene otra diana para el mismo enzima. Lo corremos en un gel y
el individuo 1 sale una banda, el individuo 2 tiene 3. No todos los individuos en una
especie tienen el mismo patrón de bandas.
• Aplicaciones de los sistemas de modificación de tipo II.
1.− Protección de secuencias diana para endonucleasas de restricción.
Las enzimas van por parejas, una corta la secuencia no metilada y el otro metila la
secuencia no metilada. Podemos proteger una secuencia diana, para ello se metila con
enzimas de modificación.
2.− Crear sitios de corte para enzimas de restricción dependientes de modificación o
de metilación.
Utilizando enzimas de modificación tipo II podemos crear un patrón de modificación
en una determinada sección de ADN que no puede ser reconocido por una
endonucleasa de restricción y esta corta al estar metilada (son otras endonucleasas
diferentes a las anteriormente vistas).
⋅ LIGAMIENTO DEL ADN IN VITRO
Para pegar el ADN se utilizan las ligasas de ADN que catalizan la formación de un
enlace fosfoéster entre un extremo 5´P y otro 3´OH.
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Hay dos ligasas que se utilizan fundamentalmente, la ligasa de T4 y la ligasa de E.
coli, son capaces de unir moléculas de ADN con extremos cohesivos, pero solo la
ligasa de T4 es capaz de unir moléculas con extremos romos y cohesivos, esta
necesita ATP como cofactor y la ligasa de E. coli sólo une extremos cohesivos y
necesita NAD como cofactor.
En extremos romos para que se produzca el ligamiento necesitamos un extremo 3´OH
y otro 5´P.
En extremos cohesivos compatibles se pueden autoaparear y la ligasa aprovechando
esto cataliza el enlace.
En extremos cohesivos incompatibles no podrían unirse en principio. En ocasiones se
pueden unir mediante una técnica. Si tienen algún nucleótido compatible se pueden
rellenar los que no sean compatibles con otros nucleótidos compatibles. Incubando
cada molécula de ADN con los nucleótidos que necesita se hacen compatibles y se
pueden ligar.
TEMA 3: MODIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS IN VITRO
⋅ TRANSFERASA TERMINAL
Es un dímero de 80 + 26 kDa.
1.− Como funciona:
Utiliza como sustrato extremos 3´OH de moléculas de ADN, tanto de cadena simple
como doble, pero es mucho más eficiente el de cadena simple.
Este enzima adiciona desoxirribonucleótidos del medio al extremo 3´OH de una
molécula de ADN. Esta adicción se produce sin necesidad de molde. La secuencia
que se va añadiendo depende de los nucleótidos que haya en el medio.
Hay diferentes técnicas para hacer creer al enzima que la cadena doble de ADN es
simple:
◊ Utilizar una exonucleasa que digiera el ADN en dirección 5´−3´. Hay varios tipos de
exonucleasas. Después de la acción de la enzima tenemos ADN doble pero con
extremos de cadena simple y ahora la transferasa funciona con mas eficiencia.
◊ Utilizar condiciones ligeramente desnaturalizantes. La molécula de ADN solo se
desnaturaliza en los extremos. Después de esto tenemos la cadena doble con los
extremos separados (cadena simple).
2.− Aplicaciones:
Creación de regiones (colas) de homopolímeros en fragmentos de ADN que van a ser
ligados entre sí. Este fue el método seguido para la construcción de las primeras
moléculas de ADN recombinante artificial.
Marcaje de los extremos 3´ de un ADN por incorporación de dNTPs, ddNTPs o NTPs
marcados.
⋅ POLI−A POLIMERASA
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Es un monómero de 58 kDa.
1.− Como funciona:
Utiliza como sustrato únicamente ARN y cataliza la adicción de ATP al extremo
3´OH de molécula de ARN sin necesidad de molde. Se usa para generar moléculas de
ARN con colas de poli−A.
Sobre un buen sustrato, es capaz de incorporar hasta 2000 restos de AMP.
2.− Aplicaciones:
Marcaje de moléculas de ARN por adición de una cola de nucleótidos marcados.
Creación de una cola poli(A) en moléculas de ARN para permitir el cebado con
oligo(dT) con el fin de sintetizar ADNc.
⋅ FOSFATASA (FOSFOMONOESTERASA)
1.− Como funciona:
Utiliza como sustrato tanto moléculas de ADN y de ARN, hidroliza los grupos
fosfato tanto en 3´ como en 5´. Lo normal es en 5´. En condiciones normales si actúa
la fosfatasa, elimina los grupos fosfato excepto si tiene una mella en el interior. En
condiciones desnaturalizantes si quitamos los de la mella.
2.− Aplicaciones:
Se utiliza para evitar autoapareamientos no deseados en moléculas de ADN. También
para marcaje de moléculas en 5´, se quita el fosfato 5´ y se pone marcado con la
quinasa.
⋅ QUINASA
1.− Como funciona:
Usa como sustrato ARN o ADN de cadena simple o de cadena doble. Fosforila
extremos 5´OH prominentes en caso de cadena doble en ADN y 5´OH de cadena
simple de ARN.
2− Aplicaciones:
Se usa para marcaje de extremos 5´.
TEMA 4: SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS IN
VITRO
⋅ DEGRADACIÓN
1.− Degradación química.
A pH muy bajos (1 ó menos) se produce una hidrólisis de los grupos fosfodiéster,
tanto en la molécula de ADN como en la de ARN, acompañada de la ruptura de
enlaces N−glucosílicos entre las bases y azúcares. Este tipo de degradación se utiliza
cuando se quiere determinar la composición de bases de un ácido nucleico.
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A pH 4 aproximadamente se produce una depurinización por ruptura de los enlaces
N−glucosílicos entre el azúcar y las purinas, afectando más a la molécula de ADN
que a la de ARN. A pH neutro se invierte la tendencia y el ADN se hace unas 200
veces más resistente a la hidrólisis que el ARN; a pH aún más alto el ADN es
prácticamente resistente a la hidrólisis, pero no así el ARN, que a pH 11 y 37ºC se
hidroliza totalmente en pocos minutos a una mezcla de nucleótidos 3´ y 2´. El ADN
depurinizado también es sensible a pH elevado y se rompe por el enlace fosfodiéster
5´ correspondiente a la desoxirribosa del lugar donde falte la purina.
2.− Degradación enzimática.
Las enzimas que degradan los ácidos nucleicos se denominan en general nucleasas y
pueden ser de dos tipos dependiendo de si actúan a partir de los extremos
(exonucleasas) o dentro de la cadena (endonucleasas).
El sustrato puede ser ADN, ARN ó ambos, ya sean de cadena simple ó cadena doble.
Para las exonucleasas se necesitan extremos libres, mientras que para las
endonucleasas no son necesarios. Y el punto de hidrólisis es en extremos 5´−P y en
extremos 3´−P.
3.− Ejemplos de degradación enzimática:
◊ ADNasa I (endonucleasa I de E. coli). Es una endonucleasa que hidroliza ADN de
cadena simple y doble. Prefiere cortar detrás de pirimidín nucleótidos. En presencia
de Mg+2 ataca al azar cualquiera de las dos hebras y produce mellas. En presencia de
Mn+2 corta ambas hebras, aproximadamente, en el mismo lugar.
◊ Exonucleasa III de E. coli. Actúa sobre extremos 3´ OH de AND de hebras dobles,
lineares o circulares. No degrada ADN de hebra sencilla.
◊ Nucleasa S1. Degrada ADN de hebra sencilla y ARN (es exo y endo). En grandes
dosis también degrada ADN de hebra doble. Requiere Zn+2 y actúa a pH bajo (4), lo
que es un inconveniente, ya que a este pH hay depurinación de las bases de ADN.
◊ Nucleasa BAL31. Es preferentemente una exonucleasa que elimina mononucleótidos
a partir de extremos 3´OH, pero también es endonucleasa, por lo que elimina las
hebras sencillas creadas por la acción exonucleásica. La reacción es totalmente
dependiente de calcio por lo que se puede controlar el grado de degradación
eliminando éste, a tiempos determinados, con agentes quelantes como el EGTA.
Degrada bastante más rápido secuencias ricas en AT que en CG. También degrada
con poca eficiencia ARN. Dado que produce terminales de distintos tamaños, algunos
de hebra sencilla, será necesario reparar la molécula antes de su posterior utilización
con alguna polimerasa que rellene regiones de hebra sencilla.
⋅ SÍNTESIS
1.− Síntesis química.
Tiene dos utilidades, una es la síntesis de oligonucleótidos. Y la segunda utilidad es el
desarrollo e estrategias para la síntesis de moléculas largas.
2.− Síntesis enzimática.
Es llevada a cabo por enzimas conocidas como Polimerasas. Pueden ser de dos tipos:
◊ ADN−polimerasas: sintetizan ADN a partir de un molde (generalmente ADN) y un
cebador.
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◊ ARN−polimerasas: sintetizan ARN a partir de una secuencia promotora en el ADN.
3.− Ejemplos de síntesis enzimática:
◊ ADN polimerasa I de E. coli. Consta de una cadena polipeptídica que funciona como
polimerasa y exonucleasa en la dirección 5´−3´ y exonucleasa 3´−5´. También tiene
actividad de ARNasa H, que es esencial para la viabilidad de la enzima pero no se
utiliza mucho in vitro. Esta polimerasa se emplea en le proceso de marcaje radiactivo
denominado traslado de la mella, que es uno de los procesos más comunes de
sustituir un ADN por su copia radiactiva. También se pueden utilizar marcajes no
radiactivos empleando biotina o el hapteno esteroideo digoxigenina (DIG) en alguno
de los precursores. El producto se detecta por luminiscencia o color. El procedimiento
se basa en el tratamiento de un ADN de hebra doble con una pequeña cantidad de
ADNasa I para que se produzcan algunas mellas al azar que sirvan de enganche a la
ADN pol I. en presencia de magnesio y deoxinucleótidos trifosfato (dNTF), la ADN
polimerasa va digiriendo nucleótidos en el sentido 5´ 3´ (exonucleasa) y
sustituyéndolos por los dNTF del medio. Uno o más de estos dNTF pueden ser
radiactivos, con lo que marcaríamos el ADN sintetizado, facilitando su utilización
como sonda en experimentos de hibridación de ácidos nucleicos.
⋅ Fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. Representa la
holoenzima a la que se le ha eliminado la actividad exonucleasa 5´−3´. La
actividad exonucleásica de la holoenzima es muy activa y muchas veces
elimina los fosfatos 5´ de los extremos de moléculas de ADN que se
pensaban utilizar como sustratos para uniones con la enzima ligasa, la cual no
podrá utilizarlos sin el fosfato 5´. Por otra parte, esta actividad exonucleásica
se puede eliminar con relativa facilidad por tratamiento proteolítico de la
holoenzima sin afectar la actividad polimerasa. Sintetiza ADN en huecos o
terminales de hebra sencilla. Una de las reacciones más utilizadas con esta
enzima es la de extensión del iniciador o iniciación al azar; el método utiliza
ADN circular o lineal de banda doble o sencilla, y consiste en realizar el
ADN mezclado con un exceso molar de moléculas iniciadoras o cebadores.
La reacción, en este caso, se lleva a cabo a pH 6´6 porque a este pH la
actividad exonucleasa 3´ 5´ es muy débil y no se corre peligro de degradar los
oligonucleótidos utilizados como iniciadores o cebadores. La enzima Klenow
se utiliza también en la síntesis de la segunda hebra del ADNc (ADN copia),
en secuenciación del ADN por el método de terminación de cadena por
di−deoxinucleótidos y en experimentos de mutagénesis dirigida.
⋅ ADN polimerasa de T7. La primera se induce en E. coli después de la
infección del fago T7. En realidad, es un complejo formado por dos proteínas
íntimamente unidas: la proteína del gen 5 del bacteriófago y la tiorredoxina
del huésped. Es la polimerasa más eficiente de todas las conocidas y la que
sintetiza cadenas más largas. Posee actividades 5´−3´ y 3´−5´ (correctora de
errores), al ser más potente que la de otras polimerasas, pone en peligro la
estabilidad de los cebadores que en muchos casos son sintéticos y no aparean
con perfección total. La actividad exonucleasa 3´−5´ radica en el extremo
amino de la molécula y se puede inactivar incubando la enzima durante
varias horas con un agente reductor (oxígeno molecular) a concentraciones
bajas del ión de hierro. La enzima sin actividad exonucleásica se denomina
secuenasa. También se obtiene secuenasa por ingeniería genética, eliminando
del gen los nucleótidos responsables de la actividad exonucleásica.
⋅ Taq polimerasa. Es termoestable, y aunque originariamente se aislaba de
Thermus aquaticus, hoy se sintetiza por ingeniería genética. Su temperatura
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óptima es entre 75−80ºC; a 60ºC retiene sólo la mitad de su actividad, y a
37ºC, una décima parte. Requiere Mg+2 y posee actividad exonucleásica
5´−3´, pero carece de la exonucleásica 3´−5´ correctora de errores. Se utiliza
sobre todo para amplificar secuencias en la reacción en cadena de la
polimerasa (RCP). Su molde es ADN de cadena sencilla y el cebador un
extremo 3´− OH libre.
⋅ Otras polimerasas termoestables:
Nombre
3´5´ Exo
Origen
Propiedades
Vida media a
Thermus
95ºC 100 min.
Taq
No
aquaticus
Alta tasa de error
(10−4 a 2·10−5)
Baja tasa de error
Pyrococcus
Pfu
Si
(1−2 · 10−6 por
furiosus
pb)
Vida media a
Thermococcus
95ºC aprox. 7
Vent (Tli)
Si
litoralis
horas
⋅ Transcriptasa inversa. Sintetiza ADN utilizando como molde ARN. También
necesita un cebador que provea un extremo 3´OH donde engancharse para
iniciar la síntesis. Carece de actividad exonucleasa 3´−5´, que es la correctora
de errores en otras polimerasas, por lo que acumula los fallos que produce;
incorpora una base equivocada cada 500 bases aproximadamente. Posee
actividad ARNasa H que puede degradar el ARN en forma de híbrido
ARN−ADN. Durante mucho tiempo se empleó la transcripatasa inversa
aislada del virus que produce la mieloblastosis en las aves, pero su poderosa
actividad ARNasa interfería muchas veces con la estabilidad del ARN molde
antes de que se llegara a completar la copia del mismo. Actualmente se
utiliza preferentemente la transcriptasa inversa obtenida por ingeniería
genética a partir del gen clonado del virus Molones que produce la leucemia
de ratón; esta última enzima posee una ARNasa H mucho más débil.
⋅ ARN polimerasas. Enzimas que reconocen secuencias promotoras específicas
e inician la síntesis de ARN a partir de las mismas utilizando como molde la
molécula de ADN. Sirven para la síntesis de sondas de ARN. Hay de tipo
SP6, T3 y T7.
TEMA 5: IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS ESPECÍFICAS
Es la detección de una secuencia CONCRETA entre un grupo de moléculas
de ácidos nucleicos con secuencias diversas.
• MATERIAL DE PARTIDA
1.− ADN o ARN en solución.
2.− Colonias (en bacterias) o calvas (en fagos).
3.− Cromosomas metafásicos.
4.− Geles de agarosa.
5.− ARN tejidos enteros.
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6.− ARN en cortes.
En función de cómo esté el material de partida hay que hacer una cosa u otra.
• PASOS A SEGUIR
1.− Trasnferencia de ácidos nucleicos de cadena simple a soporte sólido,
como una membrana de nailon (cuando sea necesario).
2.− Obtención de sondas, que son moléculas de ácidos nucleicos con
secuencia complementaria a la que estamos buscando.
3.− Hibridación.
4.− Revelado, que pone de manifiesto la presencia o la ausencia de la sonda.
Si la sección de interés está pegada al filtro detectaremos la sonda porque se
pega al filtro.
• TRANSFERENCIA A SOPORTE SÓLIDO
1.− ADN en forma de cadena simple. Para que se peguen a la sonda no es
necesario ningún tratamiento. Si los ácidos nucleicos están en forma de
cadena doble se da una desnaturalización que puede ser antes o después de la
transferencia, para que al final tengamos ácidos nucleicos en cadena simple.
2.− ADN en forma de cadena doble. Hay que desnaturalizar antes de la
transferencia o después de la transferencia.
3.− ADN o ARN en solución. Hay dos métodos, en ambos la
desnaturalización se hace antes de la transferencia. Los dos métodos son:
⋅ Método Dot−blot; poner gotas en la membrana de nailon.
⋅ Método Slot−blot; se utilizan unos aparatos con unos agujeros en forma de
malla. Tiene una cámara de vacío, encima la membrana de nailon y encima la
tapadera con los agujeros, por ahí se echa la solución en la membrana de
nailon y tenemos el ADN justo en las mallas.
4.− ADN o ARN en bacterias (colonias) o fagos (calvas). Se hace la
desnaturalización después de la transferencia. Se coge la membrana y se pone
encima de la placa de Petri con las colonias o las calvas. Cuando pasan unos
cinco minutos se levanta con unas pinzas la membrana de nailon y en esta se
han pegado las colonias o las calvas en la misma posición que están en la
placa. Esta membrana ahora se lisa colocándola en una solución de lisis y las
bacterias o fagos se lisan y el ADN sale, pero se queda en la misma posición
que está la colonia o la calva. La misma lisis se utiliza para desnaturalizar el
ácido nucleico.
5.− ADN en cromosomas metafásicos. En este caso la desnaturalización se
hace después de la transferencia.
6.− ADN o ARN en geles de agarosa. La desnaturalización se hace antes de
la transferencia. Una vez que el ADN está en el gel de agarosa se puede
clasificar en diferentes tipos dependiendo del ácido nucleico de partida:
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• Si es ADN la técnica es Southern−blot.
• Si es ARN la técnica de transferencia es Northern−blot.
• Si son proteínas la técnica es Westhern−blot.
En función de los mecanismos para que el ácido nucleico pase a la membrana
de nailon se diferencian:
⋅ Transferencia por capilaridad; se coge un recipiente y se coloca un soporte
dentro para que nos mantenga en alto lo que vamos a meter. Encima del
soporte metemos un papel de filtro que llegue hasta el fondo del contenedor.
Encima del papel de filtro ponemos el gel de agarosa con el ácido nucleico en
cadena simple. Encima la membrana de nailon. Ponemos papel de filtro
encima, una columna, encima papeles absorbentes, encima un soporte de
vidrio y encima una pesa de un kilo. Los papeles absorbentes son para
aumentar la capilaridad. Echamos al recipiente la solución de transferencia.
Esta solución sube hasta los papeles y el ácido nucleico pasa a la membrana
arrastrado por la solución mediante capilaridad. El ácido nucleico se queda en
la membrana porque llega a cargas positivas y ya no sube más.
⋅ b)Transferencia por vacío; partimos de una cámara de vacío con dos salidas,
una que se conecta a una bomba de vacío y la otra a un tubo donde se
desaguan las soluciones. La parte de arriba está cerrada con material poroso,
encima de este material poroso ponemos la membrana de nailon, encima el
gel de agarosa con el ácido nucleico. Sellando todo lo que sobre se pone una
máscara impermeable. Todo lo de arriba se rellena con la solución de
transferencia. Ahora hacemos que el líquido pase a través del gel y por esto el
ácido nucleico va del gel a la membrana de nailon.
⋅ Electrotransferencia; con un aparato llamado cassette, parecido a una carpeta,
encima ponemos dos hojas de material poroso. Después ponemos dos hojas
de papel de filtro. A un lado se pone el gel de agarosa con el ADN y en el
otro lado la membrana de nailon. Después se cierra el cassette. Necesitamos
una cubeta vertical de electroforesis. Metemos el cassette y rellenamos la
cubeta con solución de transferencia. Aplicamos voltaje y el ADN se mueve
hacia el lado positivo por lo que sale del gel y se va a la membrana de nailon.
• OBTENCIÓN DE UNA SONDA
Una sonda es una molécula de ADN o ARN que puede estar en forma de
cadena simple o doble, debe estar marcada y con una secuencia
complementaria a la que estamos buscando. Si es de cadena doble hay que
ponerla simple.
• TIPOS DE MARCAJE.
1.− En caliente; con radioactividad. Se utilizan nucleótidos con fósforo
radioactivo bien en posición alfa o bien en posición gamma.
2.− En frío; se hace gracias a que los nucleótidos llevan conjugado un
antígeno (dihidroxigenina, biotina y fluoresceína). La fluoresceína es capaz
de emitir fluorescencia, por lo que también puede detectarse de forma directa.
Todo se hace de forma indirecta porque la membrana de nailon no se puede
observar al microscopio.
• METODOS DE MARCAJE.
Casi todos pueden utilizarse con antígenos o nucleótidos radioactivos.
1.− Traslado de la muesca (Nick−traslation); se incuba el ADN con el enzima
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ADNasa I que introduce mellas de forma aleatoria en ambas hebras de ADN
(mella: ausencia de un enlace fosfodiester entre un P−5´ y un 3´OH.). El
ADN con mella se incuba con la ADNpolimerasa I de E. coli y dNTP´s
marcados (la ADNpolimerasa I tiene actividad polimerasa 5´−3´, actividad
exonucleasa 5´−3´ y 3´−5´ correctora, y actividad ARNasa H). Al añadir
ADNpolimerasa I se une en posición 3´ de la mella, pero no se puede poner
nucleótido, por lo que actúa con actividad exonucleasa 5´−3´ y quita un
nucleótido y luego lo pone. Polimeriza en dirección 5´−3´ y va colocando
nucleótidos marcados, así en todas las mellas. La determinación de
nucleótidos marcados es en función de la cantidad de ADNpolimerasa I, a
más cantidad mayor número de mellas y mayor número de nucleótidos
marcados.
2.− Primado al azar (Radom priming); se parte de ADN de cadena simple o
doble, si el ADN es de cadena doble hay que desnaturalizarlo. Se añade una
mezcla de hexonucleótidos, otra de nucleótidos marcados y ADN polimerasa
(fragmento Klenow) sin actividad exonucleasa 5´−3´. Los hexanucleótidos
están formados por oligonucleótidos de 6 nucleótidos, con cualquier
secuencia al azar. Estos oligonucleótidos se unen a la cadena de ADN
(secuencias complementarias). La ADNpolimerasa I se une al extremo 3´OH
unidos a una cadena de ADN molde y sintetiza la hebra complementaria con
nucleótidos del medio. La cadena de ADN marcada es toda de nueva síntesis.
En el otro caso también es de nueva síntesis pero lo que se hace es sustituir el
ADN inicial por ADN marcado. El fragmento Klenow cuando llega al
extremo 3´ en el que comienza el nuevo hexanucleótido no puede quitar este
hexanucleótido y lo que hace es meterse en medio de la hebra y despegarla.
En general nos podemos encontrar que la cantidad de ADN es mucho mayor
que el tamaño de la hebra.
3.− Adición de colas marcadas (oligonucleotide tailing); partimos de ADN
monocatenario o bicatenario. La transferasa terminal añade nucleótidos a
moléculas de ADN monocatenario o bicatenario en el extremo 3´OH. Si
ponemos nucleótidos marcados en el medio, estas colas que añadimos están
marcadas. Se añade ADN monocatenario o bicatenario en condiciones
ligeramente desnaturalizantes, mas transferasa terminal, y con nucleótidos
marcados. Obtenemos el ADN marcado en los extremos. La secuencia del
nucleótido añadido es al azar.
4.− Marcaje en 3´ (3´ End−filling). Solo con moléculas de ADN de cadena
doble con el extremo 5´ prominente. Añadimos una ADNpolimerasa y una
mezcla de nucleótidos marcados (dNTB*). Sintetiza desde el extremo 3´
hasta rellenar el espacio. Será una molécula de ADN con los extremos
marcados.
5.− Marcaje en 5´ (5´ End−labeling); La 5´ End−labeling es igual. La
molécula de ADN de cadena simple o doble o ARN, se trata con fosfatasa y
así quitamos el fósforo del extremo 5´. Queda OH. Tratamos después con
quinasa poniendo también en el medio fósforo radioactivo. Ahora tenemos
los extremos 5´ marcados radioactivamente.
6.− Marcaje por PCR. Con ADN de cadena simple o doble, se desnaturaliza,
se añaden unos cebadores complementarios a la molécula que hemos puesto,
18
estos cebadores se unen, cuando baja la temperatura, a sus regiones
complementarias. Añadimos una polimerasa y nucleótidos marcados. Este
ciclo se repite muchas veces (30 normalmente) y así aumentamos de forma
exponencial la cantidad de ADN que se obtiene en relación a la que se obtuvo
al principio (es una ventaja). Se desnaturalizan las hebras otra vez y se vuelve
a repetir lo mismo, así se consigue lo anteriormente propuesto (mas
concentración de ADN). Casi todo el ADN que obtenemos al final es ADN
marcado. La polimerasa tiene que ser termoestable para que no se inactive
durante la desnaturalización.
7.− Transcripción in vitro. Sirve para obtener moléculas de ARN marcadas
partiendo de ADN de cadena doble. Pero se necesita que el ADN de cadena
doble tenga al principio un promotor. Hay unos enzimas, las
ARNpolimerasas, que sintetizan ARN a partir de ADN de cadena doble.
Inician la transcripción en unas secuencias promotoras. Para obtener esta
sonda de ARN, se utilizan ARNpolimerasas vivos: SP6, T3, T7. Reconocen
secuencias específicas y diferentes. Si ponemos en el medio ribonucleótidos
marcados este ARN está marcado. Si ponemos la Poli−A−polimerasa, ATP
marcado y moléculas de ARN, tenemos moléculas de ARN con una cola de
poliadenilato marcada.
• HIBRIDACIÓN
Consiste en unir la sonda de cadena simple con los ácidos nucleicos de
cadena simple, y fijarlos a un soporte sólido.
Hay varios factores que afectan a la hibridación:
1.− Temperatura: si es muy baja la sonda se puede unir solo con alguna
región de complementaridad. Si es muy alta se desnaturaliza. La temperatura
tiene que ser lo suficientemente alta para que se unan todos los nucleótidos
de la sonda.
2.− Concentración de la sonda; si es muy poca no se une, tiene que haber
mucha.
3.− Mayor concentración de sales en el medio; se favorece la unión de la
sonda a su secuencia complementaria, pero sin pasarse, porque si no la sonda
se uniría a cualquiera.
4.− Bloqueo; los posibles sitios de unión inespecíficos de la sonda se tapan
con ADN marcado.
Los pasos a seguir en el proceso son:
1.− Pre−hibridación; se bloquean los sitios de unión inespecíficos de la sonda
(a los que se pueden unir).
2.− Hibridación; es la unión entre secuencias complementarias.
3.− Lavados; se consigue la eliminación de sonda no unida a secuencias
específicas.
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• REVELADO
• Para sondas calientes:
Detección de la sonda:
1.− Directa: con un contador de radioactividad.
2.− Indirecta: mediante AUTORRADIOGRAFÍA.
• Para sondas frías:
Detección de la sonda:
1.− Indirecta: mediante revelado inmunológico, mediante impresión de
película sensible. Revelado inmunológico, con anticuerpos específicos, para
detectar el anticuerpo, utilizamos la actividad de la enzima que hemos unido
al anticuerpo. Se pueden utilizar dos enzimas, la fosfatas alcalina o la
peroxidasa antidiyodoxigenina. Se añade el sustrato del enzima y donde esté
el enzima se produce el producto que se deposita donde está el enzima y si es
coloreado nos dirá donde está la sonda. También puede ser una sustancia que
emita alguna radiación y se coloca una película para detectar la emisión.
TEMA 6: APLICACIONES DE LA MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
• SECUENCIACIÓN
La variabilidad de la molécula de ADN no radica ni en la estructura ni en la
diversidad de sus componentes, sino en la ordenación y cadencia de los
cuatro nucleótidos que forman la molécula, esto es, en su secuencia.
Diferencias diminutas en la secuencia de dos moléculas de ADN pueden
representar grandes cambios en sus productos. Hoy podemos conocer la
secuencia de cualquier ADN aislado de modo rápido y eficaz.
Los dos métodos de secuenciación denominados químico y enzimático,
comparten algunos principios básicos. Por ejemplo, ambos han de marcar de
algún modo de las moléculas a secuenciar, bien radiactivamente o con
fluorocromos. Otra de las características compartidas es la de generar
fragmentos de ADN de una sola hebra cuyos tamaños sólo se diferencien en
una base. Moléculas de ADN con la misma secuencia, y que sólo se
diferencien en una base, pueden ser separados en geles desnaturalizantes de
acrilamida por electroforesis. Las bandas correspondientes a las moléculas de
longitud decreciente forman una escalera que nos permitirá leer del orden de
unos 300 nucleótidos consecutivos.
• Secuenciación química.
En este método, un fragmento de ADN se marca radiactivamente en sus
extremos con 32P o 35S dATP por acción de la polinucleótido quinasa.
Ambos extremos han de ser separados en dos fragmentos distintos (con una
enzima de restricción, por ejemplo) y secuenciados independientemente.
Al comienzo del proceso tendremos un gran número de moléculas idénticas,
todas ellas marcadas en el mismo extremo. El paso siguiente consistirá en
romper estos fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con
reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases.
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Se separan cuatro alícuotas y cada una de ellas será tratada con un compuesto
químico que nos modifique sólo una de las cuatro bases, aproximadamente
una vez por molécula de ADN. El tratamiento a continuación con piperidina
producirá la ruptura de la cadena allí donde la base fue alterada. Existen
distintas reacciones de modificación de las bases, y en la técnica que se
describe las guaninas se modifican específicamente por tratamiento con
dimetil sulfóxido al 1 por 100 en presencia de formato de amonio pH 3´5
durante 10 minutos. Guaninas y adeninas son atacadas por ácido fórmico al
80 por 100 durante 20 minutos. Las timiditas se degradan al tratarlas con
MnO4K 0´1 mM durante 20 minutos (también son atacadas las purinas, pero
en menor grado). Las citosinas son eliminadas con hidroxilamina 4 M a pH 6.
Las reacciones se pueden llevar a cabo con el ADN unido a papel, lo que
facilita el manejo de las muestras. El tratamiento con piperidina suelta el
ADN del papel, el ADN se analiza en geles desnaturalizantes de acrilamida.
Las bandas marcadas se visualizarán por autorradiografía y la secuencia se
leerá identificando el tamaño de cada banda en los pocillos correspondientes
a cada base.
• Secuenciación enzimática.
Este método es el más utilizado en la actualidad. Se parte de un ADN,
idealmente circular y de banda simple, pero ADN lineal o circular bicatenario
desnaturalizado también es buen sustrato. Necesitamos un cebador que sirva
de enganche para el inicio de la síntesis del ADN que vamos a marcar
radiactivamente y secuenciar. El cebador puede ser específico y
complementario a una secuencia de localización concreta (o puede
representar una pequeña secuencia al azar sin localización definida a priori).
La enzima Klenow o la secuenasa son las enzimas empleadas. De modo
análogo al método químico, se establecen cuatro alícuotas, una para cada
base. La síntesis se lleva a cabo en dos pasos: en la primera parte del proceso
el cebador se alarga unos cientos de nucleótidos más, utilizando los cuatro
desoxinucleótidos e incluyendo dATP marcado con 32P o con 35S en el
fosfato alfa, como precursor radiactivo. En el segundo paso se produce la
terminación de cadenas por adición de una pequeña cantidad de un
dideoxinucleótido distinto en cada alícuota. El dideóxido es un nucleótido
trifosfato que por carecer de grupos OH, tanto en el carbono 2´ como el 3´ de
la ribosa, imposibilita el crecimiento de la cadena y paraliza la síntesis. El
resultado en cada tubo de ensayo es una colección de fragmentos, de tantos
tamaños como unidades de la base en concreto existan en la secuencia. Los
distintos fragmentos se analizarán por electroforesis en geles de acrilamida y
autorradiografía como en el caso anterior.
Los nucleótidos marcados con azufre tienen varias ventajas con respecto al
fósforo: originan bandas más nítidas en la autorradigrafía al poseer energía de
menor poder de penetración, tienen una vida media más larga y su
manipulación es menos peligrosa para el usuario.
• Secuenciación automática.
El marcaje con fluorocromos permite eliminar la radiactividad y automatizar
la última parte del proceso, esto es, la manipulación de los geles de
secuenciación, fijación, secado y autorradiografía.
21
Hay esencialmente dos métodos: uno consiste en marcar las moléculas que
servirán de cebadores con el fluorocromo tetrametilrodamina. Los cebadores
así conjugados al fluorocromo, iniciarán la síntesis por el método enzimático.
Una vez interrumpida la síntesis con los dideóxidos correspondientes, las
muestras se corren en un gel donde las distintas bandas son leídas al pasar por
un rayo láser que identifica el fluorocromo.
El segundo método utiliza cuatro fluorocromos distintos: fluoresceína, NBD,
tetrametilrodamina y rojo de Texas, uno para cada base. Una vez conjugados
a cuatro alícuotas del cebador, se procede a la extensión del iniciador e
interrupción con dideóxidos. Las cuatro muestras se pueden correr en un
mismo pocillo, ya que tienen colores distintos y podrán ser distinguidos unos
de otros por su diferente emisión (longitud de onda).
Los resultados han de ser examinados en un ordenador, ya que los espectros
de cada fluorocromo, cuando se utilizan cuatro, se solapan ligeramente.
Cuando se utiliza un solo fluorocromo, el rayo láser transmitirá a la
computadora la información sobre el tamaño de los fragmentos en cada
pocillo del gel. En ambos casos la computadora deducirá la secuencia y la
presentará. Un total de 500 bases pueden ser identificadas con este
procedimiento.
El marcaje con fluorocromos y el análisis automatizado de los geles también
puede ser aplicado al método químico de secuenciación. El tratamiento con
los distintos compuestos químicos no interfiere con el fluorocromo acoplado
al extremo 5´ de las moléculas a secuenciar.
• DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES (RFLP)
Se fundamenta en el diagnóstico de enfermedades causadas por mutaciones
que al mismo tiempo dan lugar a la aparición de RFLPs. Las mutaciones
diagnosticables por RFLPs se dan por:
1.− Inserciones.
2.− Deleciónes.
3.− Mutaciones puntuales; si como consecuencia:
⋅ Aparece una diana para ER.
⋅ Desaparece una diana para ER.
Si cualquiera de ellos causa una enfermedad y al mismo tiempo estas
mutaciones están asociadas a un RFLP; podemos hacer un diagnostico de la
enfermedad por un RFLP.
La inserción y la deleción se comportan más o menos de la misma manera.
Puede haber un individuo homocigoto normal y otro heterocigoto para la
mutación.
Hay endonucleasas de restricción que cortan a los lados de donde se ha
producido la inserción. Los individuos normales tienen un tamaño de
fragmento igual y más pequeño que en los que se ha producido la inserción.
22
Se hace una electroforesis de ADN digerido, se transfieren a un soporte
sólido, se hibrida utilizando como sonda cualquier región del fragmento que
vamos a detectar que no incluya la zona donde se ha producido la inserción.
Lo que se ve en el individuo H.N una sola banda con la longitud del
fragmento entero, en el H+.M hay dos bandas una mas corta y otra mas larga,
y en H.M una base mas corta. El número de bandas depende de la sonda que
utilizamos del lugar donde se une en el ADN.
• Enfermedad asociada a inserción.
1.− Digestión con ER.
2.− Electroforesis.
3.− Transferencia.
4.− Hibridación con sonda.
5.− Revelado.
HN = homocigoto normal; HC = heterocigoto; HM = homocigoto mutación.
• Enfermedad asociada a deleción.
1.− Digestión con ER.
2.− Electroforesis.
3.− Transferencia.
4.− Hibridación con sonda.
5.− Revelado.
• Enfermedad asociada a mutación puntual.
Como consecuencia aparece una diana para ER.
1.− Digestión con ER.
2.− Electroforesis.
3.− Transferencia.
4.− Hibridación con sonda.
5.− Revelado.
• Enfermedad asociada a mutación puntual.
Como consecuencia desaparece una diana para ER.
1.− Digestión con ER.
2.− Electroforesis.
23
3.− Transferencia.
4.− Hibridación con sonda.
5.− Revelado.
• IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS
Se fundamenta en el análisis de sitios en el genoma en los que existen
variaciones en la secuencia de ADN detectables como diferencias entre
individuos de una población. Cuando estas diferencias son raras reciben el
nombre de mutación y no son útiles para este tipo de análisis. Cuando estas
diferencias son frecuentes reciben el nombre de polimorfismos y pueden
emplearse para establecer la huella genética.
Estudiar si una muestra de ADN está relacionada o no con algún individuo, o
si un individuo puede estar relacionado con otro. Para hacer estudios
evolutivos analizando registros fósiles.
Todo esto se basa en determinar la huella genética de un individuo
determinado. El genoma humano tiene 3x109 pares de bases. Se analizan
solo las diferencias del genoma porque entre individuos hay 0,1% de
diferencias, o sea, 3 millones de diferencias.
VNTR; repetimos en tandem en números variables. Para ver las diferencias.
En el cariotipo humano en posiciones en las que hay un número de
repeticiones en tandem pero son variables, el número de repeticiones entre
los diferentes individuos (no varía la secuencia sino el número de
repeticiones).
Si analizamos una determinada VNTR en la población, vemos las variaciones
que hay, por ejemplo individuos que tienen 3 repeticiones, otros 7, otros 10 y
otros 25 repeticiones. Estos alelos están formados por un número diferente de
repeticiones. Si encontramos endonucleasas de restricción que corten a
ambos lados podemos utilizar la PCR y utilizamos como sonda la secuencia
de VNTR determinado. Observamos las bandas en la electroforesis y
sabemos el número de repetición.
Se utilizan diferentes sondas con secuencias diferentes dependiendo de cada
tipo de VNTR.
Esto se puede aplicar para pruebas de paternidad, para pruebas
incriminatorias o exculpatorias en casos criminales, para la búsqueda de
personas desaparecidas o incluso para estudios evolutivos.
TEMA 7: INTRODUCCIÓN A LA CLONACIÓN
• CLONACIÓN
Un clon es una estirpe celular o serie de individuos pluricelulares nacidos de
ésta, absolutamente homogéneos desde el punto de vista de su estructura
genética.
La clonación permite obtener un gran número de células/individuos,
24
portadores todos ellos de la misma información genética manipulada.
La clonación se utiliza para:
1.− Obtener un elevado número de copias de la secuencia de interés para:
⋅ Análisis.
⋅ Manipulación.
⋅ Secuenciación.
2.− Analizar la función de fragmentos de ADN in vivo.
3.− Síntesis de proteínas de interés.
El proceso básico sería: unir el inserto a un vector, lo que nos daría ADN
recombinante que introduciríamos en una célula hospedadora para amplificar
el ADN recombinante, y a partir de esta se hace una selección de células
recombinantes, y seleccionamos el clon de interés.
• ANÁLISIS DEL PROCESO DE CLONACIÓN
Los pasos claves en la clonación de ADN son:
1.− Obtención del inserto.
2.− Producción de ADN recombinante (vector + inserto).
3.− Amplificar la molécula de ADN recombinante mediante su introducción
en un hospedador adecuado.
4.− Identificación del clon adecuado.
• Obtención del inserto.
El experimento suele ir dirigido al aislamiento, amplificación, análisis o
expresión de un cierto fragmento de ADN que aparece como el objeto central
del clonaje. En ocasiones no se conoce detalle alguno de su estructura y por
ello no se le exige una participación activa en el proceso; en otros casos, se
utiliza como soporte de una información para la síntesis de un producto
proteico. Se le conoce como ADN pasajero, ADN extraño o foráneo o,
también, inserto, recordando su ubicación en el interior de un recombinante.
El ADN se extrae de su fuente biológica natural (extracción a partir de geles
de agarosa, producto de PCR, ). Una vez purificado y, en su caso,
caracterizado y manipulado, se une al ADN vector para formar el ADN
recombinante y ser clonado. Tras su clonaje y amplificación, puede
recuperarse del cultivo y separarse del vector para su estudio y análisis.
La amplia metodología actual permite incorporar a este esquema cualquier
tipo de ADN como inserto del clonaje. Así:
Puede ser un único fragmento o una población mixta de piezas diferentes de
ADN.
25
Puede ser un ADN bicatenario o un ADN de hebra simple.
Puede ser un ADN natural, extraido de una fuente biológica cualquiera, o
bien una molécula sintética, obtenida artificialmente; también puede ser un
ADNc sintetizado a partir de un ARNm.
Puede ser ADN genómico (procariotas, eucariotas), ADN de orgánulos
(mitocondrial, cloroplastidial), ADN de plásmidos, o incluso ARN.
Con esto se ve que el ADN puede proceder de:
1.− Una población homogénea; se obtienen moléculas de ADN en gel de
agarosa y normalmente también si partimos de productos de PCR.
2.− Una población heterogénea; cuando aislamos una secuencia determinada.
También se puede obtener de ARN un ADN complementario. Se trabaja con
endonucleasas de restricción para generar fragmentos pequeños.
• Producción del ADN recombinante.
VECTOR.
Éste es el elemento más desarrollado del esquema. Es el principal
responsable del éxito del experimento al depender de él tanto la
supervivencia del recombinante en el cultivo transformado, por lo que se da
una selección, como la expresión del inserto en sus células. Se trata de una
molécula de ADN encargada de recibir al inserto y acompañarle en su
transferencia al interior celular; allí es responsable de que el recombinante
replique y de que sus copias se repartan correctamente entre las células
descendientes de la primera, o se propaguen adecuadamente por infección de
otras células del cultivo. El ADN vector transporta distintos tipos de
marcadores fenotípicos para la selección de células así como diversas señales
para la expresión del pasajero.
CARACTERÍSTICAS DEL VECTOR.
Debe contener un origen de replicación (región ori) que sea activo en la
célula hospedadora, capaz de dirigir la acción de la maquinaria replicativa
celular sobre el recombinante y provocar su replicación, de manera que sus
copias se repartan entre las células descendientes de aquélla (o se propaguen
por infección al resto de células del cultivo) y se consiga así la amplificación
del ADN clonado. La naturaleza de ori es fundamental para definir el rango
de hospedador de un vector, ya que esa región tiene que ser reconocida por el
complejo replicativo celular. Los vectores lanzadera contienen más de un
origen de replicación y, por ello, son activos en más de un tipo de célula.
Si el sistema de transferencia y/o propagación no es muy eficiente, se
requiere que contengan un marcador para la selección de recombinantes que
permita anular el crecimiento de las células que no lo contienen (los
marcadores más frecuentes son genes que codifican resistencia a
antibióticos).
Que tengan regulación de la expresión del inserto en el caso de vectores de
26
expresión.
Y que sean de un pequeño tamaño, pero que tengan una gran capacidad de
carga.
PRODUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE.
El ADN recombinante es la molécula que resulta de la unión del ADN vector
y del inserto. Su amplificación, análisis y expresión pasa por su transferencia
al interior de una célula hospedadora, es decir, su clonaje. Una vez clonado,
puede recuperarse del cultivo y conservarse como ADN puro.
La síntesis de ADN recombinante se basa en la unión in vitro del vector y el
inserto mediante la acción de la ADN ligasa. Los diferentes vectores aportan
diferentes alternativas para facilitar esta etapa.
Cuando hacemos el proceso de obtención de ARN recombinante podemos
obtener además de este otra molécula como el ADN inserto unido consigo
mismo, es la recircularización del inserto. Unido a otro inserto son
concatémeros del inserto o lo mismo pero con el vector.
Hay que aumentar la eficiencia para que todas las moléculas posibles sean
ADN recombinante (inserto + vector). Hay que conseguir que tanto el vector
como el inserto tengan extremos cohesivos compatibles.
Si tenemos extremos cohesivos incompatibles se puede hacer que sean
compatibles con rellenado parcial de los extremos. Para conseguir extremos
cohesivos el paso más simple es generar extremos sanos y a partir de ahí
obtener extremos romos compatibles:
1.− Rellenado total si tenemos extremos 5´ prominentes.
2.− Eliminar la región de cadena de ADN simple con endonucleasas
específicas de ADN simple.
Para luego crear extremos cohesivos se puede:
1.− Añadir colas homopoliméricas; tanto al inserto como al vector (suelen ser
de poliC y poliG porque la unión es mas fuerte por estar unidos por tres
puentes de Hidrógeno). Cuando las colas se unen al inserto y al vector no van
a ser iguales en longitud o que aparecen en posiciones conocidas. Se quedan
muescas en la cadena y hay que rellenar con polimerasas y ligasas.
2.− Empleo de moléculas; llamados Linkers, que son moléculas de ADN de
cadena doble que posee una diana para una nucleasa de restricción específica.
Después de tratar con este enzima obtenemos extremos cohesivos en el
vector y en el inserto que son cohesivos entre si. Ponemos poco inserto y
mucho linker para obtener fragmentos como queremos y con el vector igual.
El problema es que como el inserto o el vector tenga la secuencia diana que
reconoce la endonucleasa también cortaría esta molécula. Se trata nuestro
inserto y lo tratamos con el enzima de modificación correspondiente que
metila las secuencias diana y después se fija el linker.
27
Un adaptador. Si una molécula tiene un extremo romo y otro cohesivo
compatible con alguna endonucleasa de restricción. Le colocamos un
adaptador a cada lado. Los adaptadores están desfosforilados en el extremo
cohesivo y por eso otro adaptador no se puede unir por ese extremo cohesivo.
El inserto después de unirle los adaptadores esta defosforilado. Si el vector
que se le va a unir está fosforilado si puede unirse. Una ventaja con
adaptadores es que no hay que utilizar endonucleasa de restricción y así
evitamos que pueda cortar nuestro inserto.
Ya podemos unir el inserto con el vector porque el inserto tiene extremos
cohesivos y compatibles.
Para aumentar la eficiencia del proceso se defosforila o el inserto o el vector,
para que no se una consigo mismo.
Otra forma de aumentar la eficiencia del proceso es añadir colas
homopoliméricas al vector y al inserto. Así no se recircularizan ni se forman
concatémeros.
Para generar extremos cohesivos compatibles, podemos utilizar
endonucleasas de restricción distintas tanto en el vector como en el inserto.
Se pueden generar extremos cohesivos y compatibles.
Si se recirculariza es reconocido por la endonucleasa de restricción y se
puede cortar. Y si se concatena también. Y con el vector pasa lo mismo.
Si se unen el vector y el inserto se quita la diana para las endonucleasas y ya
no se unen.
Si son extremos cohesivos compatibles se pueden unir el inserto en dos
direcciones. Hay que controlar la orientación del experimento.
Conseguir un inserto con extremos no compatibles entre si y el vector igual
pero compatibles con los del inserto en la dirección que nos interesa.
Cortando el inserto con dos endonucleasas de restricción diferentes y
cortando el vector con las mismas endonucleasas en el orden que queramos
que se una el vector con el inserto.
El proceso generalizado sería: se añade al mismo tubo el inserto y el vector
con extremos compatibles. Y se pone, además, la ligasa de ADN, que cataliza
la formación de moléculas de ADN recombinante.
• Introducción del ADN recombinante en la célula hospedadora.
Son células que se encargan de duplicar nuestro ADN recombinante. Pueden
ser procariotas o eucariotas. Las procariotas que mas se utilizan son E. coli,
es la mas simple y se pueden hacer pocas cosas.
Las eucariotas, las más simples son las levaduras. También se usan líneas
celulares de mamíferos, insectos o plantas. También embriones de mamíferos
o embriones de insectos.
28
Las células hospedadoras necesitan tener una serie de características:
1.− Que no sean capaces de modificar, degradar o recombinar el ADN
recombinante introducido.
2.− Que carezcan del fenotipo proporcionado por los marcadores presentes en
los vectores que empleamos.
3.− Otras características deseables en función del objetivo, experimento,
vector,
MÉTODOS PARA INTRODUCIR EL ADN RECOMBINANTE.
1.− Transformación por choque térmico; cuando se tratan las células con
cationes bivalentes y se altera la envuelta celular, se obtienen células
competentes que son capaces de captar ADN del medio que puede ser
sometido a un choque térmico, normalmente se utilizan células procariotas.
2.− Transfección de ADN precipitado con fosfato cálcico; suelen utilizarse
células eucariotas.
3.− Infección por fagos o virus; se coge el ADN recombinante y se mete
dentro de una partícula viral y es el virus el que se encarga de meter el ADN
en la célula.
4.− Electroporación; en bacterias y células animales. Se somete a la célula a
una diferencia de potencial fuerte, en este proceso se abren poros transitorios
y por ahí entra el ADN.
5.− Empleo de liposomas; para células que tengan membrana. El ADN se
mete dentro de un liposoma (que es una membrana) y se puede fusionar con
la membrana de una célula y meter dentro de la célula.
6.− Microinyección; el ADN se mete dentro de la célula directamente.
7.− Bombardeo con microproyectiles; realizados con metales pesados, y a la
superficie se le une el ADN, se bombardea a la célula hospedadora con estos
proyectiles. Se suele utilizar sobre todo en plantas.
DESTINOS DEL ADN DENTRO DE LA CÉLULA RECEPTORA.
1.− Se pude degradar (se pierde).
2.− Se puede integrar en el cromosoma (se replica con el cromosoma
bacteriano).
3.− Puede que no se integre y entonces puede:
⋅ No se replica de forma autónoma.
⋅ Se replica de forma autónoma.
• Identificación del clon adecuado.
SELECCIÓN DE RECOMBINANTES.
29
Cuando hacemos todos estos procesos habrá células que se transformen y
células que no se transformen. Dentro de las que se transforman las hay con
ADN recombinante (que es lo que nos interesa), con vector, otros. Dentro de
las que tienen ADN recombinante puede haber positivas y negativas.
Las células hospedadoras no transformadas, no llevan el vector por lo que no
llevan el marcador.
En el caso de células hospedadoras transformadas con otra cosa que no lleve
marcador, tampoco se ve nada.
Las células transformadas con vector y con ADN recombinante, llevan
marcador. Para diferenciar esto se ponen dos marcadores diferentes al vector.
Una célula que lleve solo el vector tendrá el marcador 1 y el 2, si la célula
tiene ADN recombinante lleva el marcador 1 pero no lleva el 2, porque ha
sido inactivado por el inserto.
Hacemos crecer las células en una placa y seleccionamos las que sean
positivas para el marcador 1 y negativas para el marcador 2.
Por lo tanto lo que se debe hacer es poner unas condiciones de crecimiento
que permitan únicamente la división de las bacterias transformadas y
distinguir entre bacterias transformadas recombinantes y transformadas no
recombinantes.
Cuando un fago infecta una bacteria libera un gran número de partículas
fágicas que, a su vez, inyectan las bacterias de alrededor. El resultado es una
zona clara en un césped de bacterias que se denomina calva.
La identificación de una calva de lisis fágica cuyos fagos lleven un gen de
interés de entre todas las calvas de lisis crecidas sobre un césped de bacterias,
o la de una colonia bacteriana de entre todas las crecidas en una placa Petri es
una práctica común en ingeniería genética.
Los métodos de hibridación son los más comunes para la selección de un
clon en particular de entre todos los obtenidos. La utilización de estos
métodos precisa del empleo de una sonda, esto es, un ADN o ARN
complementario al gen que se desea aislar y que podemos marcar
radiactivamente. Muchas veces no es posible tener una sonda pura, sino que
se parte de una mezcla enriquecida para la secuencia que buscamos, con lo
cual el proceso de aislamiento e identificación del gen deseado no es tan
directo como en el ejemplo que describiremos a continuación.
Partiendo, por ejemplo, de una librería genómica, el primer paso será crecer
las colonias o calvas a una gran densidad para poder tener el mayor número
posible de unidades por placa Petri. A continuación se transfieren las
colonias/calvas a papel de nitrocelulosa o nailon, colocando simplemente
dicho papel sobre la placa Petri. Una parte de las colonias permanecerán en la
placa Petri y constituirán la placa maestra, a partir de la cual se aislará la
colonia/fago de interés. El filtro con las colonias/calvas es tratado con álcali
para lisar las bacterias/fagos y desnaturalizar el ADN. Seguidamente se
incuba con protinasa K para degradar proteínas, y dejar sólo el ADN unido a
30
la nitrocelulosa, por la que tiene gran afinidad. El ADN se fija al papel por
calor en horno a 80ºC en el caso de la nitrocelulosa, o por radiación
ultravioleta en el caso del nailon. Se desnaturaliza la sonda, si es de doble
banda, y se hibrida a los filtros en condiciones de sal y temperatura que
favorezcan la formación y estabilidad de secuencias complementarias. El
resultado de esta hibridación se detecta por autorradiografía. La colonia cuyo
ADN da lugar a un positivo en la autorradiografía puede ser seleccionada en
la placa Petri maestra de partida.
El método descrito es general para identificar cualquier secuencia o gen del
que se disponga de una sonda. La obtención de sonda es, pues, el factor
limitante.
TEMA 8: VECTORES DE CLONACIÓN EN PROCARIOTAS
• INTRODUCCIÓN
Los vectores de clonación permite seleccionar o encontrar las bacterias que
no llevan ADN recombinante (estas se mueren). El vector también tiene que
permitir que el ADN recombinante se replique autónomamente dentro de la
bacteria, para conseguir esto se ha visto que las moléculas dentro de las
bacterias tienen replicación autónoma, así se han hecho vectores derivados de
plásmidos. El fago también se replica de forma autónoma y también se han
hecho vectores derivados de este. Un vector con propiedades intermedias son
los cósmidos. Los últimos son vectores derivados de virus monocatenarios.
En resumen:
Replicación autónoma:
⋅ Vectores derivados de plásmidos.
⋅ Vectores derivados del fago .
⋅ Vectores derivados de los dos cósmidos.
⋅ Vectores derivados de virus monocatenarios M13.
• Transducción generalizada.
Cuando un fago entra en una bacteria inyecta su ADN. Este puede hacer dos
cosas:
Recircularizarse, y después replicarse. Hay lisis y al final salen muchas
partículas del fago de esa bacteria. Este sería el ciclo lítico.
En el ciclo lisogénico el ADN se integra en el cromosoma bacteriano, esto
ocurre hasta que se dan unas condiciones en que el fago se escinde del
cromosoma bacteriano y sigue el ciclo lítico.
Para la transducción generalizada hace falta un ciclo lítico, porque por el
mecanismo de transducción en ocasiones se empaqueta el genoma de la
bacteria en lugar de el del fago, así cuando los fagos vuelvan a infectar a una
bacteria, las partículas que lleve la bacteria también se integran.
Por este mecanismo, cualquier gen de una bacteria puede pasar a otra bacteria
con la misma probabilidad.
• Transducción restringida.
31
Es necesario que el fago haya seguido el ciclo lisogénico (completamente
diferente al anterior).
El mecanismo se basa en una escisión errónea del fago que sigue un ciclo
lisogénico. Cuando las condiciones son las adecuadas, el fago se escinde para
replicarse, pero la escisión es errónea y se lleva parte del genoma de la
bacteria. Si se da la escisión errónea al replicarse habrá pequeñas partículas
con genoma de la bacteria, se empaqueta y al infectar a otras bacterias
también se integrará parte del genoma de la primera bacteria.
No todos los genes pasan a la célula receptora con la misma probabilidad,
pasan los genes que están a ambos lados del genoma del fago, es decir, los
genes del sitio de integración (el gen gal y el bio).
• VECTORES DERIVADOS DE PLÁSMIDOS
• Características generales.
Las características principales son:
1.− Moléculas de ADN circular cerrado covalentemente, extracromosómicos.
2.− Replicación autónoma.
3.− Distribución amplia en la población.
4.− Confieren características fenotípicas a las bacterias que los poseen.
5.− Tamaño y número de copias por célula variable.
El control de la replicación del plásmido interesa especialmente porque
interesa que los plásmidos estén presentes en un elevado número de copias y
por tanto habrá que trabajar con plásmidos con un control relajado de la
replicación.
Dentro de una misma bacteria solamente pueden coexistir diferentes
plásmidos si pertenecen a grupos de incompatibilidad diferentes. Los grupos
de incompatibilidad quedan definidos por el mecanismo de control de la
replicación del plásmido de forma que los plásmidos pertenecen al mismo
grupo de incompatibilidad si el control de la replicación se realiza de la
misma manera.
El mecanismo de control de replicación es muy importante y un ejemplo de
este es la replicación del grupo de incompatibilidad Col E I: a un lado del
origen de replicación tiene lugar la transcripción de una molécula de ARN
que recibe el nombre de ARN II, esta molécula se procesa y sirve de cebador
para iniciar la replicación a partir del origen de replicación. Los plásmidos
pueden regular la replicación de forma negativa, y es que en la misma región
donde se transcribe el ARN II, se puede transcribir otra molécula de ARN
que recibe el nombre de ARN I que se transcribe en la dirección contraria a la
que se transcribe ARN II. Como ARN I y ARN II se solapan en una región, y
los dos se transcriben en direcciones contrarias, estos son complementarios
en una pequeña región y ARN I regula negativamente la replicación porque
secuestra a ARN II. Al otro lado del origen de replicación hay un gen que se
32
transcribe y que cuando se traduce da lugar a la proteína rop que estabiliza el
híbrido ARN I−ARN II (también inhibe la replicación). Para la replicación de
nuestros plásmidos interesa que no haya proteína rop ni ARN I, es decir,
inhibir los mecanismos de replicación negativa del plásmido.
Cuando utilizamos plásmidos hay unas características deseables para estos:
1.− Los vectores tienen que tener características fenotípicas seleccionables,
es conveniente que en algún sitio un gen lleve un marcador que esté en la
bacteria con el plásmido y no en las otras y hará que las primeras no mueran
y las que no lleven el vector se mueran.
2.− Debe haber sitios de clonación; son dianas únicas para enzimas de
restricción que cortan al vector en un solo punto. Los sitios de clonación
deben estar dentro de marcadores seleccionables, cuando ponemos ADN
digerido con el vector digerido lo que queremos es que se una el
ADN−plásmido (vector), pero también puede aparecer el vector
recircularizado y para ello nos interesa poder diferenciar bacterias con vector
más inserto de bacterias con vector pero sin inserto. Si ponemos un segundo
marcador y hay inserto, las bacterias con inserto lo tienen inhibido.
3.− Bajo peso molecular; cuanto más pequeño sea el plásmido más fácil es de
manipular y más fácil es que entren dentro de la bacteria, que se repliquen y
mayor probabilidad tienen de encontrar sitio de clonación.
• Elementos indispensables en vectores plasmídicos.
1.− Origen de replicación modificado para que sea reactivo en la bacteria.
2.− Promotores y secuencias implicadas en la expresión génica (vectores de
expresión).
3.− Marcadores seleccionables.
4.− Sitios de clonación.
Los Poli−linkers son secciones cortas con aproximadamente 10 dianas para
enzimas de restricción diferentes, es una secuencia que interrumpe la
expresión de un marcador porque está inserto en él. Es un oligonucleótido de
unas 20 pb que incluyen numerosos sitios de clonación para una gran
variedad de enzimas de restricción (aproximadamente 10), y se encuentran
interrumpiendo la expresión de un gen marcador.
• Selección de recombinantes.
Para la selección de los transformantes hay que sembrar las bacterias con
tetraciclina, y las que crezcan es que son transformantes. Para saber cuales
son los recombinantes hay que sembrar con tetraciclina y Amp, y las que
estén en la 1º placa y no en la 2º serán las recombinantes.
Las bacterias tienen que ser defectivas para los genes marcadores para poder
hacer esta clase de experimentos.
• Selección por inactivación insercional.
33
Otro gen marcador puede ser LacZ´, del operón de la lactosa. LacZ está
implicado en el metabolismo de la lactosa y en concreto codifica para la
−galactosidasa, que hidroliza lactosa dando GLU+GAL. LacZ también
puede actuar sobre el sustrato artificial X−GAL, y da lugar a GAL y a otro
producto de color azul. Las bacterias con −galactosidasa y en un medio con
X−GAL dan lugar a colonias azules y lo podemos utilizar como un marcador
seleccionable:
.− Si no hay inserto se produce −galactosidasa, que en un medio con
X−GAL da colonias azules.
.− Si entra el inserto el gen LacZ se inactiva y en presencia de X−GAL no
hay producto azul, las colonias son blancas.
Si en el medio hay también ampicilina obtendremos colonias blancas y
azules, todas con resistencia a la ampicilina, pero con inserto (blancas) y sin
inserto (azules). La selección se hace de las blancas que son las
transformantes y recombinantes. En la realidad, las bacterias hospedadoras
tienen una deleción en su gen LacZ, y la proteína no funciona, así son
mutantes que hace que la −galactosidasa no sea funcional porque le falta un
trozo.
El marcador no es el LacZ completo, sino el LacZ´, que es un fragmento del
gen LacZ que codifica para la región que le falta a la bacteria hospedadora.
Así cuando el plásmido con LacZ´ y la bacteria hospedadora defectiva están
juntos, codifican para la proteína −galactosidasa funcional.
• Extracción del ADN plasmídico.
1.− Lisis celular; quedará una mezcla de ADN genómico + ADN plasmídico
+ impurezas. Necesitamos aislar por un lado el ADN de la bacteria y por otro
lado el del plásmido, y esto se puede hacer porque los dos ADN tienen
características diferentes.
2.− Extracción del ADN plasmídico (purificación);
⋅ Centrifugación en gradiente de ClCs y EtBr; en gradiente de ClCs el ADN
plasmídico y genómico están juntos pero separados de todo lo demás. Como
el ADN plasmídico es circular y pequeño, y el genómico es grande y también
circular, tras la lisis el genómico se vuelve lineal. Al hacer la centrifugación
en gradiente de ClCs + EtBr se separan los dos porque el EtBr se mete entre
las dos hebras de ADN, pero en el ADN lineal puede desenrollarlo y en el
caso del plasmídico no puede hacerlo porque está superenrrollado. Al añadir
EtBr disminuye la densidad de la molécula en la hebra desenrollada y en
función de este se pueden separar.
⋅ Lisis alcalina; también se lisan las células pero en una solución de lisis con
pH 12−12´5, así se produce una desnaturalización de ADN lineal: el
plasmídico sigue igual pero el genómico se desnaturaliza porque en el
proceso de lisis se vuelve de cadena lineal. El siguiente paso es neutralizar la
solución bajando el pH a 7−7´5 y el plasmídico estará igual, pero el
genómico no se renaturaliza sino que forma una maraña que se puede separar
de lo que es realmente el plasmídico por centrifugación.
⋅ Electroforesis; para aislar plásmidos de tamaño elevado. Las bacterias se
34
mezclan con agarosa fundida, se ponen en un molde y cuando solidifican se
sacan los bloques con bacterias atrapadas. Este bloque se somete a solución
de lisis y las bacterias se lisan dentro del bloque de agarosa. Se cargan los
bloques en los pocillos como si fuera la muestra, se aplica un campo eléctrico
y el ADN migra, pero las bacterias se quedan en el bloque.
• VECTORES DERIVADOS DEL FAGO
Cuando un fago infecta a bacterias se adsorbe sobre una proteína de la
superficie, entra en forma lineal, y se recirculariza. En forma circular el ADN
puede seguir dos ciclos:
1.− Ciclo lisogénico; se integra en el cromosoma bacteriano y se queda de
forma latente hasta que decida escindirse, en condiciones adecuadas, para
replicarse y seguir el ciclo lítico.
2.− Ciclo lítico; en primer lugar el ADN circular se replica generándose un
Ori y se obtienen dos copias. En la replicación tardía se replica de forma
diferente, por el círculo rodante formando concatémeros de virus: el genoma
de un virus seguido de otros muchos. Al mismo tiempo se sintetizan en la
bacteria las cápsidas para empaquetar los virus y salir fuera de la bacteria.
El genoma del virus está formado por ADNdc con 48´5 kb, en sus extremos
hay regiones de cadena simple de aproximadamente 12 pb complementarias
entre sí y que son las que permiten la recircularización del fago dentro de la
bacteria. Las secuencias de ADN de cadena simple de los extremos se
denominan secuencias cos, que también están implicadas en el
empaquetamiento, de forma que se empaqueta todo el ADN que hay entre
dos secuencias cos.
Todos los genes implicados en un mismo proceso están juntos.
Sabiendo como es el ciclo biológico se puede conseguir que las bacterias
hagan muchas copias del genoma del virus y utilizarlo como vector.
• Ventajas e inconvenientes del fago como vector.
• Inconvenientes:
.− Genoma muy grande y por tanto baja probabilidad de encontrar sitios de
clonación.
.− La capacidad de carga del fago es muy baja, y eso limita el tamaño del
inserto que se puede meter en el vector. Si usamos fago como vector, y este
tiene 48´5 kb, y la cantidad máxima de ADN que entra en la cápsida no
puede superar las 52 kb, solo podremos poner un inserto de 3´5 kb. El límite
mínimo para empaquetar es de 35 kb. En las 48´5 kb de ADN se encuentran
dianas para diferentes enzimas de restricción, lo que es un problema, porque
se necesitan dianas únicas para clonar.
• Ventajas:
.− Es posible realizar la selección en función del tamaño del inserto.
.− Mayor eficiencia de clonación.
Si queremos fabricar un vector a partir del fago necesitamos aumentar la
35
capacidad de carga del fago, también conservar los genes implicados en la
replicación del fago, necesitamos también meter marcadores seleccionables y
son imprescindibles las secuencias cos porque permiten recircularizar y
empaquetar el vector y por tanto necesitamos meter regiones reguladoras de
la expresión del inserto.
• Tipos de vectores del fago .
Hay dos tipos de vectores diferentes:
1.− Vectores de inserción; se modifica el fago de forma que pongamos un
sitio de clonación donde introducir el inserto que interrumpa un marcador
seleccionable. Se corta con endonucleasas de restricción y se mete el inserto.
2.− Vectores de sustitución; se modifica el fago de forma que se genere un
región que se sustituya por el inserto. Se corta con una endonucleasa de
restricción y se mete el inserto en la región a sustituir que es donde estará el
marcador seleccionable.
El vector fágico puede entrar en la bacteria por transfección y por infección.
Esta última posibilidad tiene mayor eficacia que la última.
El vector que entra por infección es 100 veces más eficiente.
El empaquetamiento se hace por métodos in vitro, por tres sistemas:
⋅ Utilizando extractos celulares de bacterias infectadas por un fago cuyos
sitios cos están modificados.
⋅ Utilizar sistemas de empaquetamiento doble; basado en dos bacterias, una
infectada por fago defectivo para una proteína implicada en el
empaquetamiento y la otra defectiva para otra proteína. Si se extraen las
proteínas y se ponen conjuntas si se puede empaquetar.
⋅ Comprar un sistema de empaquetamiento; vienen todas las proteínas, se
juntan y se mezclan con el ADN.
Después del ligado hay concatémeros de secuencias cos y con el
empaquetamiento in vitro se empaqueta el ADN que hay entre dos secuencias
cos.
• Selección de recombinantes.
Inactivación isercional del gen LacZ´: si en LacZ´ hemos puesto un sitio de
clonación pueden pasar dos cosas:
1.− Vector sin inserto; el LacZ´ sigue activo y junto con LacZ dan lugar a una
−galactosidasa que en presencia de X−GAL lo degrada en GAL y producto
azul. Ahora aparecen calvas azules en lugar de colonias azules como pasaba
con los plásmidos. De esto se deduce que la bacteria hospedadora tiene que
ser defectiva para LacZ, y necesita un complemento para que se active.
Deben crecer en un medio con X−GAL y un inductor que será el IPTG.
2.− Vector con inserto; es el que se tiene que seleccionar. El gen LacZ´ se
inactiva, no se complementa la mutación de la bacteria hospedadora y la
degradación para la galactosidasa es negativa y aunque haya X−GAL en el
36
medio no se produce compuesto color azul, serán todas las calvas blancas
(calvas blancas recombinantes; se seleccionan).
Inactivación insercional del gen cI de ; este gen está implicado en la
decisión de seguir el ciclo lítico o lisogénico. Cuando aumenta la cantidad de
cI el virus se decide por el ciclo lisogénico, y cuando disminuye, por el ciclo
lítico. En condiciones normales si tenemos una bacteria infectada por un
virus, este tiene que decidir por un ciclo u otro, y en todas las bacterias no se
decide por el mismo, por lo que habrá calvas turbias donde hay bacterias
todavía vivas, porque el virus se ha decidido por el ciclo lisogénico. Podemos
utilizar cI insercinándolo de forma que tendrá un sitio de clonación donde
meter el inserto y dos posibilidades:
1.− Vector sin inserto: calvas turbias.
2.− Vector con inserto: cI se inactiva insercionalmente y como esta
inactivado se sigue el ciclo lítico siempre y las calvas serán transparentes.
Selección utilizando el fenotipo spi (genes red y gam); genes implicados en la
inmunidad y replicación del virus. Utilizamos como hospedador bacterias
lisogénicas para el fago P2, que está integrado dentro del genoma bacteriano.
Los virus tienen que evitar que haya otra infección por otro virus y los genes
implicados en esto son red y gam. Si están los dos el segundo virus que va a
infectar no puede hacerlo, por que el fago inhibe la entrada. Se detecta la
inserción del inserto (se utilizan como vectores de sustitución). Hay dos
posibilidades:
1.− Vector sin inserto; red+ y gam+, no se forman calvas porque no puede
entrar el fago con un ciclo lítico (spi+).
2.− Vector con inserto; red− y gam−, no es sensible a la inhibición P2 y el
segundo fago puede infectar a la bacteria y formar calvas. Todas las calvas
que aparezcan serán recombinantes.
Selección en función del tamaño del genoma; si tenemos un vector derivado
de , vamos a utilizarlo por sustitución si entre el vector y el inserto tienen
más de 35 kb y menos de 52 kb, por encima y por debajo de estos límites no
hay empaquetamiento.
• Métodos de contención biológica.
Utilizar vectores derivados de con mutaciones de codón de parada en mitad
de genes esenciales: si por ejemplo, tenemos un gen implicado en la
replicación del virus y le introduce un codón de parada, cuando se transcriba
y después se traduzca no se sintetiza la proteína completa y el virus no será
capaz de sobrevivir. Necesitamos bacterias hospedadoras especiales que son
supresoras de la mutación del vector, ya que cuando se transcriba en la
bacteria esta no reconocerá el codón de parada como tal, sino que continua la
transcripción porque el transferente de la bacteria introduce el aminoácido
que le falta y continua la transducción de la proteína. Así el virus solo puede
sobrevivir dentro de la bacteria (que está modificada genéticamente).
• CÓSMIDOS
37
Son híbridos entre plásmidos y derivados de , del plásmido llevan el origen
de replicación y genes marcadores, y de los derivados de llevan las
secuencias cos. Además llevan sitios de clonación.
A la hora de utilizar los cósmidos una ventaja frente a los plásmidos es que al
tener secuencias cos nos permiten empaquetarlos en partículas virales y
podremos introducir el vector en la bacteria mediante transducción.
Y frente al vector derivado de es que la capacidad de carga es mucho
mayor.
El cósmido se linealiza y se liga con el inserto, cuando vamos a empaquetar
lo hará todo lo que hay entre las secuencia cos que tenga un tamaño entre 35
y 52 kb. Con esto ya podemos infectar bacterias que se comportarán como un
plásmido y se pueden seleccionar bacterias por el gen marcador (AmpR). Si:
.− Vector con inserto: en una placa con Amp las que crezcan serán
recombinantes.
También tiene problemas, como:
1.− La orientación de las secuencias cos.
2.− También puede pasar que el inserto se una a otro y clonásemos
secuencias que en realidad no están juntas.
3.− También se pueden caracterizar los vectores.
• VECTORES DERIVADOS DE VIRUS MONOCATENARIOS:
M13
Nos centramos en M13 de ADNcs, que infecta a bacterias por pelos sexuales,
es decir, tienen que ser F+. El ADN que entra a la bacteria se denomina
positivo. Cuando el ADNcs entra en la bacteria tiene que sintetizar un
ADNcd, es decir, la hebra complementaria a la cadena positiva. A esto se le
llama forma replicativa, que se replica dentro de la bacteria por el método del
círculo rodante, de forma que dentro de la bacteria se obtienen muchas
formas replicativas. Al mismo tiempo que estas se replican también se
transcriben genes, de forma que a mayor cantidad de copias del genoma
vírico, mayor será la cantidad de proteínas virales dentro de la bacteria.
Entre estas proteínas está el producto del gen 5, que es una proteína con
afinidad por unión al ADNcs, y llega un momento en que hay tanta cantidad
del producto del gen 5 que la hebra positiva es secuestrada por es proteína y
ya no se forma la hebra complementaria y solo queda ya la hebra positiva. Al
mismo tiempo se transcriben otras proteínas como las de la cápsida del virus
que se van hacia la membrana de la bacteria y se localizan allí. Ahora las
partículas de hebra positiva con proteínas producto del gen 5 van hacia la
membrana y salen por exocitosis.
En M13 no hay un límite de ADN que se encapsida. El genoma de M13 es de
ADNcs de 6´4 kb, donde se encuentran distribuidos 10 genes con su origen
de replicación. Para utilizarlo como vector de clonación tiene varios
38
problemas:
1.− El genoma es tan compacto que no podemos quitar una región para
insertar otra.
2.− Todos los genes son esenciales, y por tanto no se puede meter un inserto
entre dos genes, solo se puede meter en la zona del Ori, sin afectar la
secuencia o una región intergénica de pocos pares de bases entre el gen 3 y 8.
3.− No tiene sitios de clonación, habría que introducirlos.
Para usarlo como vector se han sacado genes esenciales y utilizan el vector
con un virus ayudador, y se le ponen sitios de clonación. Con estos vectores
obtenemos insertos de cadena simple y se pueden utilizar como sonda, por
ejemplo: también se pueden aplicar en secuenciación, ya que el ADN que
utiliza es ADN de cadena simple.
TEMA 9: INTRODUCCIÓN DE NUEVA INFORMACIÓN GENÉTICA
EN BACTERIAS
• FORMAS DE ENTRADA DE ADN EN BACTERIAS
En bacterias de forma natural hay varios métodos por los que el ADN puede
entrar dentro de ellas, y estos se engloban en tres tipos diferentes:
1.− Entrada de ADN desnudo dentro de la célula. Si solo entra ADN desnudo
en la célula de otra célula se llama transformación. Si el ADN desnudo es
viral se llama transfección, este tipo de ADN puede desencadenar una
infección.
2.− Otro tipo de entrada de ADN implica el contacto físico entre las bacterias
y el ADN pasa de una a otra y se llama conjugación. El ADN ya no es
desnudo. Si en este proceso en vez de pasar ADN plasmídico pasa ADN
cromosómico se llama sexducción.
3.− También puede entrar a través de partículas virales, en este caso se llama
transducción. Hay dos formas:
⋅ Generalizada; cualquier parte del genoma de una bacteria puede pasar a otra
bacteria.
⋅ Restringida; solo pasan unos determinados marcadores de una célula
bacteriana a otra.
• TRANSFORMACIÓN
La transformación es la variación hereditaria de una célula bacteriana debida
a la captación de ADN exógeno desnudo. Y un transformante es una célula
que ha adquirido ADN mediante transformación.
Es un mecanismo que existe de forma natural en bacterias y que permite la
entrada de fragmentos de ADN a través de las paredes celulares. Las
bacterias capaces de captar ADN desnudo reciben el nombre de bacterias
competentes.
1.− Transformación natural; hay especies que son competentes de forma
39
natural. Según sean Gram + o Gram − usan un mecanismo u otro.
La transformación también se puede inducir de forma artificial:
2.− Transformación inducida químicamente; se incuban las células que
queremos con cationes divalentes como cloruro de calcio o de aluminio. Las
bacterias alteran su pared celular y si los incubamos con el ADN y los
sometemos a un choque térmico, el ADN entra dentro de la célula.
3.− Transformación inducida enzimáticamente; tratando a las bacterias con
lisozimas y EDTA en un medio isotónico. El enzima degrada la pared de la
bacteria y obtenemos esferoplastos, que son células carentes de la mayor
parte de su pared celular, capaces de adquirir ADN del medio. Tras la entrada
de ADN y regeneración de la pared celular se obtienen transformantes.
4.− Transformación inducida físicamente; mediante electroporación.
Sometiendo a las bacterias a descargas eléctricas, se le abren unos poros
transitorios en la membrana y el ADN puede entrar dentro de la bacteria.
La utilización de un método u otro va a depender del tipo de bacterias con las
que se trabaja.
• CONJUGACIÓN
Se requiere el contacto físico entre las bacterias donadoras y las receptoras.
Las bacterias donadoras establecen contacto con las receptoras mediante un
pelo sexual que las receptoras no poseen.
Todo esto se por una serie de genes codificados por el plásmido conjugativo,
de manera que la bacteria donadora lleva ese plásmido conjugativo y puede
transferir la información a la bacteria receptora. Constituye un problema,
porque queremos que el ADN se quede en nuestra célula hospedadora y no
pase a otra. Además se trabaja con bacterias que llevan diferentes clones.
Es muy importante que las bacterias que se utilicen como células
hospedadoras no lleven plásmidos conjugativos.
• TRANSDUCCIÓN
Es la transferencia de ADN bacteriano de una célula a otra debido a la
infección causada por un bacteriófago, portador de dicho ADN. Hay dos
tipos, la transducción generalizada y la transducción restringida.
• TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA.
Los fagos empaquetan accidentalmente ADN bacteriano, y estas partículas
portadoras de ADN bacteriano son capaces de infectar otras células, aunque
no serán capaces de producir ninguna progenie (dado que en la cápsida no
hay ADN del fago). Al introducir el ADN bacteriano dentro de otra célula,
éste puede recombinar con el ADN endógeno.
La frecuencia de transducción generalizada es baja e idéntica para cualquier
gen del genoma de la célula donadora.
• TRANSDUCCIÓN RESTRINGIDA.
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Este tipo de transducción requiere que el fago haya seguido un ciclo
lisogénico dentro de la bacteria donadora. Es debida a un error en la escisión
previa al empaquetamiento. En esta tan solo se transfieren genes bacterianos
próximos al sitio de inserción del fago. Después del empaquetamiento la
cápsida contiene tanto ADN bacteriano como ADN del fago.
Con este tipo de transducción se puede empaquetar el ADN recombinante en
una cápsula viral y utilizamos su mecanismo de infección para inyectar el
ADN recombinante dentro de la bacteria.
Es un método más eficiente que la transformación, del orden de 100 veces
más eficiente.
TEMA 10: SELECCIÓN DE RECOMBINANTES
• INTRODUCCIÓN
Los métodos que se utilizan para identificar los insertos dependen de la
estrategia y del vector que hemos seguido.
En la búsqueda del ADN recombinante hay que emplear una propiedad
específica de nuestro inserto que puede ser o bien su secuencia o su función.
Esto nos lleva a establecer dos métodos diferentes:
1.− Métodos basados en la secuencia del inserto.
2.− Métodos basados en el producto de expresión del inserto.
• MÉTODOS BASADOS EN LA SECUENCIA DEL INSERTO
Necesitamos conocer la secuencia del inserto. Este tipo de métodos no
requieren la expresión del inserto, y es aplicable a cualquier tipo de
secuencia, no necesitamos que esta secuencia codifique para una proteína.
Conociendo una parte de la secuencia del inserto podemos fabricar una sonda
para encontrar el inserto. Pueden ser ADN o ARN simples o dobles,
marcados en caliente (32P) o en frío (biotina, digoxigenina o fluoresceína),
las sondas bicatenarias deben desnaturalizarse antes de su empleo en la
hibridación, y deben tener una longitud mínima de 20 nucleótidos. Según el
experimento de clonación se pueden obtener de bandas de ADN aisladas de
geles de agarosa (repetitivos), productos de PCR, de ARNm obtenido a partir
de tejidos (elevada expresión del gen de interés), de insertos clonados (genes
conservados en distintas especies), o por síntesis química (a partir de la
secuencia de aminoácidos).
Una vez conseguida la sonda se debe marcar, y para esto hay diferentes
métodos:
⋅ Traslado de la muesca (Nick−translation).
⋅ Primado al azar (Random priming).
⋅ Adición de colas marcadas en 3´ (Oligonucleotide tailing).
⋅ Marcaje en 3´ (3´ End−filling).
⋅ Marcaje en 5´ (5´ End−labeling).
⋅ Marcaje por PCR.
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⋅ Marcaje por transcripción in vitro.
Si no tenemos idea de la secuencia pero si conocemos algo de la secuencia de
aminoácidos, de aquí podemos conocer la secuencia de nucleótidos, pero
como el código genético es degenerado se utilizan sondas degeneradas,
poblaciones de diferentes sondas que incluyen todas las secuencias posibles
que codifican para una determinada secuencia de aminoácidos. Con esto nos
aseguramos tener la secuencia de la sonda que buscamos. Aumenta la
posibilidad de obtener falsos positivos.
Ahora necesitamos buscar nuestro clon recombinante en la genoteca. Hay
que hacer una réplica de la genoteca en filtro (filtro de nitrocelulosa), es un
filtro que tiene situadas las colonias en la misma posición que en la placa. El
filtro tendrá condiciones desnaturalizantes para lisar bacterias y para que el
ADN se desnaturalice.
Se hibrida con la sonda y se revela para saber donde está la sonda.
Hay veces que hacer replicación en filtro no resulta conveniente y se hace
transferencia individual de colonias. Se cogen las colonias que llevan el
inserto, se siembran en placas y después se hace lo mismo o se hace la
transferencia individual a un filtro cuando hay pocas colonias.
• Métodos basados en la secuencia del inserto: Hibridación
diferencial.
En este caso no conocemos la secuencia del gen que buscamos.
Tenemos un cultivo creciendo en condiciones normales, cuando le añadimos
una sustancia X, estas células, por ejemplo, empiezan a dividirse mucho. Este
puede ser debido a que esta sustancia X induzca los genes que inician la
proliferación y están implicados en esta. No sabemos nada de su secuencia.
Extraemos el ARNm en las dos situaciones, en los que están inducidos por X
habrá además de los ARNm normales, los que son inducidos por X. Y en las
células no inducidas estarán los ARNm normales debidos a procesos básicos.
A partir de la población X de ARNm se hace la síntesis de ADN
complementario y a partir de este hacemos una genoteca. De esta genoteca
hacemos dos replicas, a cada un de estas las hibridamos con dos sondas
diferentes.
De los ARNm de la placa X se hace la síntesis de la primera hebra con
oligo−dT con la reversa transcriptasa y dNTPs*. Si aumenta el pH el ARN se
degrada y tenemos hebras de ADN marcadas, sería la sonda A.
Con los ARNm de la placa que no lleva la sustancia X, se hace lo mismo, y
tenemos la sonda B.
La sonda A la hibrido con una de las réplicas y la B con otra de las réplicas.
En el caso de la sonda A todos los clones están marcados, y en la B los que
no nos interesan se marcan. Buscamos clones positivos con A y negativos
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con B. De la primera placa se pican esas colonias que no están marcadas y se
siembran en una placa.
• MÉTODOS BASADOS EN EL PRODUCTO DE EXPRESIÓN
DEL GEN CLONADO
Necesitamos que el inserto se exprese. Se pueden clasificar en dos tipos:
• Métodos genéticos o de complementación.
Son los más rápidos y sencillos. Necesitamos que el inserto se exprese y que
esta expresión de lugar a un fenotipo observable y que la célula hospedadora
se defectiva para este fenotipo y compatible con el.
Este tipo de métodos se suelen utilizar cuando estamos clonando genes
implicado en vías biosintéticas. Genoteca con el genómico de la bacteria y
seleccionamos las bacterias que sean capaces de crecer en un medio selectivo
(que queramos nosotros).
• Métodos inmunológicos.
Hace falta que se exprese el inserto, pero no se necesita que sea un fenotipo
observable. Lo que necesitamos para observar nuestro producto es un ácido,
no necesitamos que la bacteria sea compatible con el gen que buscamos.
Tenemos placas con genoteca, se hibrida con un filtro (ahora buscamos
proteínas en vez de ácidos nucleicos). Sobre este filtro detectamos las
proteínas y lo incubamos con un ácido que reconozca de forma específica las
proteínas que estamos buscando.
Se incuban luego con un ácido secundario que suele ir unido a un enzima y
detectamos su presencia mediante la acción de enzimas.
Necesitamos un anticuerpo específico frente a la proteína que se busca.
Basados en Western−Blot:
⋅ Extracción de proteínas a partir de los clones.
⋅ Electroforesis en gel de acrilamida.
⋅ Transferencia a soporte sólido: Western−Blot.
⋅ Hibridación con el anticuerpo específico.
⋅ Detección del anticuerpo secundario y revelado.
TEMA 11: ESTRATEGIAS DE CLONACIÓN: GENOTECAS
• INTRODUCCIÓN
Una genoteca es un conjunto de clones. Estos proporcionan información
sobre un fragmento de ADN. Hay de varios tipos:
1.− Las genotecas genómicas, pueden ser de dos tipos:
⋅ Totales; si está representando todo el genoma de un organismo. Conjunto de
clones que lleva toda la información de un organismo.
⋅ Parciales; es un conjunto de clones que llevan la información de una parte del
genoma.
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2.− Genotecas de ADN complementario (ADNc); conjunto de clones que nos
da toda la información referente a los genes que se están expresando en un
determinado tejido, línea celular o células en un determinado momento.
3.− Genotecas sustractivas; conjunto de clones que llevan la información de
todos los genes que se expresan de forma diferencial en una determinada
situación.
• GENOTECAS GENÓMICAS
El primer paso es el aislamiento del ADN de partida, que puede ser:
.− ADN genómico total.
.− Conjunto de fragmentos de un determinado tamaño (gel).
.− ADN de orgánulos.
.− ADN de uno o varios cromosomas.
El siguiente paso es la fragmentación aleatoria del ADN, puede ser de dos
tipos:
1.− Rotura física del ADN; se rompe de forma aleatoria en diferentes puntos,
suele dejar extremos romos, por eso se trata para generar extremos cohesivos.
2.− Digestión con endonucleasas de restricción; pero que no sean totales ya
que no se obtienen fragmentos solapantes. Deben ser parciales simples o
parciales dobles, y se da fraccionamiento por tamaño.
Después sea aíslan los fragmentos deseados (por rango de tamaño), y se ligan
con el vector previamente digerido con enzimas compatibles.
El tamaño de una genoteca depende del tamaño del genoma del organismo
del que vamos a hacer la genoteca. También del tamaño del inserto, cuanto
más pequeño sea, mayor es el tamaño de la genoteca, porque tiene mayor
número de clones. En función del tamaño del inserto decidimos que vectores
vamos a utilizar, normalmente derivados de lambda o en cósmidos.
Para saber cual es el número de clones adecuado para tener una buena
probabilidad de encontrar el inserto deseado, tenemos la siguiente fórmula:
N = ln(1−P)/ln(1−f)
N = número de clones
P = probabilidad de encontrar el inserto deseado
f = fracción del genoma en un inserto. Longitud media del inserto/Longitud
del genoma
• Análisis de una genoteca.
Buscamos una sonda del fragmento que estamos buscando y rastreamos la
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genoteca.
Una vez que tenemos el inserto si es muy grande se subclona. Se clona cada
uno de ellos por separado. Hay que encontrar genes que se encuentren
próximos a una secuencia conocida, haciendo un paseo cromosómico, que
permite que de una secuencia dada podamos secuenciar genes que están
cerca.
Para hacer un paseo cromosómico se hace una digestión parcial de nuestras
moléculas de ADN para obtener más información. Partimos de una genoteca
del ADN de un organismo. Necesitamos un punto de partida (secuencia
conocida), que es la sonda. Se rastrea la genoteca y nos encontraremos los
genes de la secuencia (sonda) y los genes que estén a su alrededor (clones).
Se coge el inserto de esos clones, se secuencian y después alineamos la
secuencia obtenida. Se coge un extremo de la secuencia conocida (de la
secuencia obtenida), sintetizamos una sonda y sacamos los clones positivos
que serán diferentes a los anteriores, se secuencian y se alinean. De esta
manera, caminando por el cromosoma se podrá ir avanzando en la
caracterización de una gran región. Para saber donde está el gen se van
analizando puntos de inicio de transcripción, etc., mediante sistemas
informáticos.
El paseo cromosómico presenta problemas:
1.− Saber en que dirección estamos paseando. Para hermanos y especies
como modelo de investigación, hay mapas en los que se indican diferentes
marcadores, en cada uno de los cromosomas (polimorfismos, etc.). Para una
misma especie todos los cromosomas tienen las mismas marcas.
2.− El ADN es repetitivo, hay secuencias repetidas en el genoma y se
encuentran dispersas por el genoma. Si hacemos una genoteca estas
secuencias se encuentran también en ella. Si hacemos una sonda para esa
secuencia tendremos fragmentos de todos los cromosomas y no nos sirven
para poder encontrar el gen.
3.− Son muy lentos.
Para poder resolver el problema del ADN repetitivo hay técnicas como el
salto cromosómico.
En el salto cromosómico para poder secuenciar un genoma, cuanto mayor sea
el inserto, antes se secuencia, pero el tamaño del inserto es limitado. Vamos a
crear insertos que sean iguales a los de 500 kb. Cortamos el ADN en
fragmentos de 500 kb., los ligamos a un vector que lleva un gen marcador
formado por un gen supresor de un codón de parada (lo demás no es
importante). Tenemos el vector más 500 kb de insertos, esto es imposible que
entre en una célula, por lo que cortamos con una endonucleasa que corte en el
inserto, pero va en el vector. En nuestro vector lo más probable es que se
haya quedado unido un fragmento de ese ADN del inserto. Con esto
formamos un vector que tiene el vector y los dos fragmentos de los extremos
de nuestro inserto, así nos ahorramos meter 500 kb. Hacemos un vector con
eso y con un vector derivado de lambda. Utilizamos bacterias normales, sin
45
genes supresores y que lleven solamente el vector con el gen supresor del
codón y los extremos del inserto. Si entra eso en la bacteria dan una infección
predictiva, da una calva. Si no llevan el gen supresor no hacen nada a la
bacteria, porque el vector derivado de lambda tiene inactivados los genes
supresores y no dan lugar a la muerte de la bacteria. Todas las calvas llevan
fragmentos de ADN del mismo inserto pero que están separadas en realidad
por 500 kb. Lo que obtenemos al final es un genoteca a saltos. Por si mismas
no sirven para hacer un paseo cromosómico, pero si sirven por si vamos
paseando y podemos dar un salto.
Para dar un salto cogemos una sonda de los fragmentos que vamos
analizando y la llevamos a la genoteca a salto, y la sonda hibrida con uno de
los clones y dependiendo del trozo que hibrida se coge el otro y se utiliza
como sonda. Por ejemplo, tenemos la sonda hibridada con X, cogemos el
trozo Y y le hacemos una sonda. Esta sonda la hibridamos con nuestro ADN
estudiado y hemos dado un salto de 500 kb (los fragmentos son de diferente
tamaño, no de 500 kb.).
• Genoteca parcial.
Se lleva información sobre una parte del genoma, por ejemplo información
sobre un único cromosoma, se puede hacer por citometría de flujo, hay que
marcar.
Pueden ser:
1.− Genoteca parcial cromosómica; separamos los cromosomas y cogemos
uno. Tenemos información sobre ese cromosoma.
2.− Genoteca parcial con un determinado tamaño; mediante electroforesis.
La cromosómica se puede hacer por diferentes formas, por citometría de
flujo, por nidodisección.
• GENOTECAS DE ADN COMPLEMENTARIO
Se diferencia de las genómicas en:
1.− El material de partida en estas es el ARN, que pasa a ADNc. Esto tiene
como consecuencia que en los genes de una genoteca de ADNc no está
representado todo el ADN del organismo, sino solo las secuencias
codificantes.
2.− No están representados todos los cromosomas.
3.− Las secuencias de ADNc son diferentes unas de otras dependiendo del
tejido de partida y de diferentes momentos y diferentes condiciones.
Las utilidades de estas genotecas son las siguientes:
1.− Estudiar la regulación de la expresión génica.
2.− Maduraciones alternativas del mensajero, donde están los intrones y los
exones.
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3.− Estudio de diferentes procesos que tienen lugar durante el desarrollo, ya
que se sabe cuales son los genes que se expresan durante el desarrollo
embrionario.
• Síntesis del ADN complementario.
Con un fenol ácido se hace una extracción de ARN total (ARNm, ARNt,
ARNr, ). Dos ARNm son normalmente los que nos interesan. Se utilizan
métodos que nos permitan eliminar el resto de ARN. La mayoría de ARNm
tienen una cola de poliA.
El método principal se basa en el empleo de poliT unido a una matriz de
nitrocelulosa. Se pasa el ARN total por esa columna y únicamente los ARNm
que lleven una cola de poliA quedarán retenidos en la matriz. Se hace una
serie de lavados y después se emplean condiciones desnaturalizantes para que
el ARNm se separe y salga de la columna.
Otros métodos utilizan partículas magnéticas unidas a oligo−dT, y se mezcla
el ARN total con esta solución. Los ARNm con cola de poliA se unen a los
oligo−dT. Se introducen en un aparato que lleva un imán en uno de los lados
y arrastran las partículas magnéticas junto con los ARNm unidos a los
oligo−dT. Se tira la solución y se hacen varios lavados. Después se ponen en
condiciones desnaturalizantes para separar el ARNm de la partícula
magnética. Se vuelve a poner el imán para que las partículas magnéticas se
separen de ARNm y lo recogemos.
Tras este paso hacemos la síntesis de ADNc, en dos pasos:
1.− Síntesis de la primera hebra; síntesis de una hebra de ADN
complementario al ARN de partida. Lo más simple es pone un oligo−dT que
se une a la cola de poliA, enzimas retrotranscriptasas y los nucleótidos
(dNTPs). La retrotranscriptasa sintetiza la cadena de ADN en dirección 5´ 3´.
También podemos utilizar una mezcla de hexanucleótidos aleatorios. Se
pueden quedar unidos a cualquier zona y la retrotranscriptasa sintetiza la
cadena de ADNc. Esto es ventajoso cuando los ARNm son demasiado largos
porque la rerotranscriptasa no es un enzima demasiado activa y cuando llega
a un punto se para, haya terminado o no.
2.− Síntesis de la segunda hebra; sintetizar la hebra complementaria a la
primera en forma de ADN. Hay dos métodos:
⋅ Empleo de la ARNasa H y ADN polimerasa y dNTPs. La ARNasa H degrada
híbridos de ARN−ADN, corta la cadena de ARN y deja la molécula de ARN
que sirve de cebador a la ADN polimerasa que sintetiza la molécula de ADN
complementaria. Con su actividad exonucleasa 3´ 5´, quita el ARN.
⋅ Empleo de la transferasa terminal y de la ADN polimerasa. Se incuba con la
transferesa terminal y con un oligo−dCTP por ejemplo, y se pone una cola de
poliC en el extremo 3´ de la cadena de ADN. Se hidroliza el ARN (se puede
hacer de diferentes formas). Colocan un oligo−dGTP más una ADN
polimerasa. El dGTP aparearía con el dCTP y la ADN polimerasa se une a
ese fragmento de poliG y sintetiza la segunda hebra. En el medio ponemos
también dNTPs.
• Clonación del ADN complementario.
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El ADNc va a tener extremos romos. Normalmente la clonación de esta
indicará la creación de extremos cohesivos. Para ligamiento con el vector
podemos usar colas homopoliméricas, linkers o adaptadores. Las colas
homopoliméricas no son muy buenas, porque nos pueden alterar las lecturas,
porque no controlamos la longitud y la expresión del inserto, no suele ser
viable.
Nos interesa controlar la orientación del inserto, una estrategia es cuando
ponemos el oligo−dT, puede ser uno especial que lleve una secuencia diana
de una endonucleasa de restricción (no afecta al proceso). Sintetizamos la
segunda hebra y también se sintetiza el fragmento de la secuencia diana. A
esta molécula si se le puede poner linkers o lo que queramos. Si ponemos los
linkers y corto con uno o con dos tengo dos extremos diferentes.
• GENOTECAS SUSTRACTIVAS
Se pueden considerar también como un tipo de ADNc. Contienen genes que
se expresan de forma diferencial en una situación.
Estamos estudiando, por ejemplo, una sustancia que produce cáncer,
estudiamos los genes que se expresan cuando está esta sustancia y los que se
expresan cuando no está o los que no se expresan.
Se extraen los ARNm de las dos situaciones. En la situación X nos
deshacemos del ARN. Se hibridan las dos poblaciones. Los mensajeros que
hibridan son los que están en las dos situaciones.
Lo que nos interesa no lleva biotina (ADN que no ha hibridado). Se utiliza
estreptarilina, que tiene afinidad con la biotina. Se unen y arrastran la primera
hebra que se había unido a la biotina. La estreptarilina está unida a una
partícula magnética, con un imán nos llevamos todas las partículas
magnéticas y nos quedan sueltos los ADN que nos interesan.
TEMA 12: AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS IN VITRO
• INTRODUCCIÓN
Se necesita gran cantidad del material de partida (ADN y/o ARN) para
cualquier tipo de manipulación in vitro.
Hasta el descubrimiento de la PCR la única forma de obtener una gran
cantidad de material genético era mediante la clonación.
Desde la aparición de la PCR se han desarrollado otras técnicas que permiten
la amplificación de ácidos nucleicos in vitro (NASBA, LIGASE CHAIN
REACTION).
Todo esto tuvo una gran repercusión.
• FUNDAMENTO DE LA PCR
La PCR es un método enzimático que permite sintetizar numerosas copias de
un fragmento concreto de ADN. Utiliza como cebadores dos oligonucleótidos
complementarios a lo que serán los extremos del producto y colocados con
sus terminales 3´OH enfrentados. Lo que se amplifica es el ADN
48
comprendido entre ambos oligos. La sucesión de una serie de ciclos en los
que tiene lugar la desnaturalización del molde, hibridación con los cebadores
y extensión de la síntesis por acción de la ADN polimerasa, origina una
acumulación exponencial de fragmentos específicos cuyos extremos estarán
definidos por los extremos 5´ de los cebadores. Al poder ser utilizados los
productos de un ciclo como moldes del ciclo siguiente, el número de copias
de ADN, se dobla en cada ciclo. Así pues, 30 ciclos de PCR producen una
amplificación de un millón de veces aproximadamente.
Las polimerasas que se emplean son termorresistentes para no tener que
añadir la enzima manualmente en cada ciclo. La purificada de la bacteria
Thermus aquaticus (Taq) es una de las más utilizadas, pero carece de
actividad correctora de errores (exonucleasa 3´ 5´), por lo que puede
introducir aproximadamente un nucleótido equivocado por cada 1000
colocados a concentraciones altas de magnesio y uno por cada 1000000
colocados, en otras condiciones. Este índice de error no suele presentar
problemas en la mayoría de las aplicaciones, pero ha de tenerse en cuenta y la
magnitud de la equivocación puede ser importante si ocurre en las primeras
rondas. Otras polimerasas, como la obtenida de Pyrococcus furiosus (Pfu) o
la aislada de la bacteria Thermococcus litorales que se encontró en la ventana
de ventilación de un submarino (Vent), incorporan errores con una frecuencia
mucho más baja y pueden copiar fragmentos de mayor longitud que la Taq.
Para que la especificad sea máxima, se debe evitar que la polimerasa y el
resto de los componentes estén a temperatura ambiente antes de iniciar el
primer ciclo. La polimerasa puede también añadirse una vez que se ha
producido la primera desnaturalización del ADN o incluso mejor, para no
tener que manipular los tubos una vez iniciado el proceso, se pueden añadir
anticuerpos anti−Taq, que inhibirán la actividad de la polimerasa hasta que se
desnaturalicen por calor. La amplificación de las secuencias requiere cambios
rápidos de temperatura, el proceso se realiza en un termociclador que lleva un
microprocesador para programar estos cambios y el número de ciclos
deseado.
• CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR
La reacción de amplificación por PCR produce material suficiente para
muchas aplicaciones analíticas, pero cuando se necesitan cantidades aún
mayores del producto, o cuando éste va a ser objeto de manipulación
adicional, es necesario proceder a su clonación, lo que no siempre es una
tarea sencilla.
Aunque, en teoría, los productos de la reacción son moléculas de doble hebra
con terminales romos, éstas abundan muy poco en la mezcla final, quizá
como resultado de la actividad de la polimerasa que, con frecuencia,
incorpora algún nucleótido adicional en el extremo 3´ de la hebra copiada.
Esto requiere la introducción de una etapa de retoque del producto antes de
intentar su clonación, por ejemplo mediante incubación con la ADN
polimerasa Klenow o con la de T4 en presencia de los cuatro dNTPs; gracias
a sus actividades exo 3´ 5´ y polimerasa 5´ 3´, estas enzimas son capaces de
recortar los extremos 3´ protuberantes y generar terminales romos.
A continuación ha de procederse a la separación del exceso de cebadores y
49
del producto de la reacción, mediante electroforesis en gel de agarosa y
extracción de banda. Las moléculas de ADN así purificadas pueden ligarse a
un vector en forma lineal y con extremos romos. Es importante tener en
cuenta que los oligonucleótidos preparados por síntesis química resultan con
sus dos extremos, el 5´ y el 3´, con un OH libre, sin fosfato. Los cebadores
sintéticos construidos por este sistema y utilizados en la reacción de PCR no
llevan fosfato en sus extremos, por lo que los productos de amplificación son
moléculas de dsADN desfosforiladas. En el caso de que se pretenda su
clonación, debe utilizarse, imprescindiblemente, un vector con extremos
fosforilados. Si se quiere desfosforilar el vector lineal para impedir su
recircularización, es necesario proceder a la fosforilación del producto de
PCR mediante la inclusión de un tratamiento con polinucleótido−quinasa.
En el caso de la polimerasa Taq, el error más frecuente se da en la etapa de
polimerización, y se concreta en la adición de un nucleótido extra de adenina,
lo que crea moléculas bicatenarias con un terminal 3´ protuberante integrado
por una única A. Se han construido y comercializado vectores, en forma
lineal, que tratan de aprovechar este hecho presentando terminales con un
nucleótido de timina que sobresale de los extremos 3´, con el fin de facilitar
la clonación de los productos de PCR.
Una alternativa a las soluciones anteriores es el uso de cebadores que
incluyen alguna diana de restricción, con lo que los productos amplificados
pueden ser digeridos y posteriormente clonados en un vector con extremos
compatibles.
• ALGUNAS VARIACIONES DE LA PCR
• Amplificación de ARN: retro PCR.
La amplificación de ARNm se puede realizar en un solo tubo de ensayo de
dos maneras diferentes.
Uno de los métodos consiste en poner las dos polimerasas (transcriptasa
inversa y ADN polimerasa termorresistente) desde el comienzo en el mismo
tubo, junto con los cebadores de ambos extremos, desoxinucleótidos y sulfato
de magnesio. En un principio, durante unos 45 minutos y 48ºC se sintetiza la
primera hebra del ADNc copia del ARNm; a continuación se sube la
temperatura a 94ºC durante 2 minutos, con lo que se desnaturaliza el molde,
sintetizándose seguidamente la segunda hebra del ADNc y las múltiples
copias de ambas hebras durante 40 ciclos.
El segundo método utiliza una ADN polimerasa termorresistente que posee
además actividad transcriptasa inversa. Es la polimerasa Tth que se aisló de
la eubacteria termofílica Thermus thermophilus. Amplifica bien ARNm de
hasta 1 kb.
Una variante es la utilización de un oligonucleótido específico dentro del gen
y otro inespecífico, con lo que se amplifica no sólo la región codificante de
un ARNm, sino también, en muchos casos, la región no traducible 5´ o 3´ del
mensajero.
• Generación de ADNcs: PCR asimétrica.
Es esta una variante que nos permite generar un gran número de moléculas de
50
ADN de banda simple que se pueden utilizar directamente para secuenciar o
como sondas para hibridaciones. El método consiste en poner diferente
proporción de los dos oligocebadores de manera que uno esté a concentración
limitante. Así, los 20−25 primeros ciclos amplifican las dos hebras del ADN,
pero al agotarse uno de los cebadores, los 5−10 ciclos siguientes serán de
ADN de banda simple.
• Búsqueda de zonas flanqueantes: PCR inversa.
La PCR inversa nos permite amplificar secuencias desconocidas vecinas a
secuencias genómicas conocidas. Imaginemos que queremos aislar las
secuencias adyacentes al lugar donde un retrovirus se ha insertado.
Tomaremos ADN genómico y lo trataremos con una enzima de restricción
cualquiera, Hind III, por ejemplo, y permitiremos la formación de círculos
por complementariedad de los extremos cohesivos. Utilizaremos como
cebadores dos secuencias de la región conocida, pero cuyos extremos 3´OH
se dirijan hacia el exterior de la molécula conocida. Así se amplificará un
fragmento que al ser tratado con la diana Hind, nos liberará dos fragmentos
que representarán las secuencias anteriores y posteriores al gen concreto. La
misma técnica nos permitiría amplifica cualquier región reguladora
flanqueante de un gen cuya secuencia sea conocida.
• APLICACIONES DE LA PCR
1.− Producción de grandes cantidades de fragmentos de ADN concretos
2.− Marcaje de sondas.
3.− Secuenciación del ADN.
4.− Diagnóstico de enfermedades genéticas.
5.− Detección de partículas infecciosas.
6.− Diagnóstico prenatal.
7.− Medicina forense, identificación.
8.− Cuantificación (PCR cuantitativa en tiempo real).
9.− Cálculos de porcentaje de recombinación en células germinales.
10.− Amplificación de genes con expresión diferencial.
TEMA 13: MUTAGÉNESIS IN VITRO
• INTRODUCCIÓN
Para encontrar genes mutantes se estudiaba el individuo con el mutágeno se
buscaban los fenotipos mutantes y se encontraba el gen y la función.
En ingeniería genética se estudia el gen, se hace un clon, lo mutamos y se
estudia la alteración que se produce cuando lo mutamos y podremos deducir
cual es la función de este gen.
51
Hay dos tipos de métodos para hacer mutagénesis:
1.− Método aleatorio; introducimos mutaciones al azar en una determinada
secuencia de ADN y no podemos decidir ni la posición de la mutación ni el
tipo.
2.− Métodos dirigidos; introducir la alteración que se quiera en el sitio que se
quiera.
• METODOS ALEATORIOS
• METODOS ALEATORIOS POR INTRODUCCION DE
DELECCIONES.
Inducimos una deleción en nuestra secuencia, se corta con una o dos
endonucleasas de restricción, quitar el fragmento y se vuelve a ligar. Se corta
con una endonucleasa de restricción que haga un solo corte y tratar después
con nucleasa. Se para la reacción y luego se liga. Se trata con ADNasa I, se
introducen cortes aleatorios con manganeso. Tratamos con nucleasas y luego
ligamos.
• METODOS ALEATORIOS POR INSERCION.
Se trata con endonucleasa de restricción y el vector con el inserto linealizado
se liga con un oligonucleótido de cadena doble.
Se trata con una endonucleasa de restricción que genere extremos cohesivos,
en concreto extremos 5´ prominentes, se rellenan los extremos y se ligan.
• METODOS ALEATORIOS POR MUTACIONES PUNTUALES.
1.− Métodos químicos.
Por sustitución; se necesita una molécula de ADN, se puede conseguir por
vectores MB. Otros métodos son:
* Tratar el vector con bromuro de etidio y se corta con enzimas de
restricción. Cuando el ADN está con bromuro de etidio la enzima de
restricción reconoce esa secuencia pero sólo corta una hebra. Si tratamos con
una exonucleasa 3´ elimina la cadena. También se puede utilizar cualquier
polimerasa con actividad exonucleasa 3´ 5´ y sin poner nucleótidos en el
medio.
* Tratamiento con bisulfito sódico, induce la desaminación de la citosina y se
transforma en uracilo. Si tratamos con bisulfito sódico y luego hacemos la
síntesis de la cadena de ADN complementaria. Tenemos sustituciones CG y
UA.
2.− Métodos enzimáticos.
Generan ADN de cadena sencilla, rellenan el hueco, síntetiza ADN al ir
sintetizando se van introduciendo las mutaciones.
Utilizando su polimerasa sin actividad correctora (sin exonucleasica 3´ 5´).
Utilizar polimerasa con −tio−dNTPs, nucleótidos, que en la posición no
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llevan fósforo sino un azufre. Una vez que se incorporan si se han
incorporado mal la polimerasa ya no lo puede corregir.
Utilizar polimerasa junto con análogos de nucleótidos, por ejemplo el
4−hidroxicitosina, aparea tanto con la A como con la G, el que aparea con
una forma o con otra depende de la forma del análogo que tiene dos formas
imino que aparea con A y la amino con G. Este análogo es de dTTP. Si se
aparea con una G es porque esta en la forma amino y se introduce la
mutación en la siguiente réplica porque es un análogo de la T y pondría una
A.
Después de hacer estos métodos se saca el inserto y se vuelve a meter en otro
vector porque el primer vector puede que se haya mutado también y ya no
nos funciona. Se vuelve a meter en la célula hospedadora, obtenemos una
especie de genoteca de mutaciones.
• METODOS DIRIGIDOS
Una mutación en un punto concreto en una secuencia concreta, con
mutagénesis con oligos de secuencia definida.
Partimos de ADN de cadena sencilla. Hacemos un oligo complementario a la
secuencia en la que se encuentra el punto exacto donde queremos hacer la
mutación y en el oligo ese punto lo cambiamos para introducir esta mutación.
Podemos introducir deleciones e inserciones. Una vez que se produce la
mutación sintetizamos la hebra complementaria.
Introducir en las células hospedadoras. Seleccionan los mutantes, se hace una
búsqueda utilizando como sonda el oligo con la mutación. Cuando la célula
hospedadora se divida tendremos la mitad de los clones normales y la otra
mitad mutantes.
Lisamos las bacterias, hibridazos con la sonda, si hacemos esto la sonda se
pega a todos porque la diferencia es sólo de un nucleótido.
Vamos subiendo paulatinamente la temperatura, pasado un tiempo. La
temperatura en la que el oligo tenga un 100% de su hibridación. Por debajo
de esta son todas positivas, porque se une el oligo de forma menos específica.
Si aumenta la temperatura van quedando los que tengan mayor homología
con el oligo hasta quedar los que sean 100% homólogos. En esta temperatura
los que son positivos se quedan y los que son negativos ya no se ven.
En realidad la frecuencia de plásmidos mutantes no es el 50% es mas bajo.
Una de las veces por la que la frecuencia es tan baja es por fallos en el propio
proceso, si la síntesis no se completa es porque a la polimerasa no le da
tiempo a llegar al final. No todas las moléculas son de cadena doble, la
solución es la purificación de las hebras de la cadena doble mediante
electroforesis. Utilizamos las moléculas complementarias para introducirlas
en células. También puede ocurrir que la polimerasa acabe su actividad y
corrija la mutación, la solución es utilizar polimerasa sin actividad
exonucleasa 3´ 5´.
53
A pesar de estas soluciones el proceso sigue siendo poco eficiente.
Al introducirlo en la bacteria esta quita una de las dos bases, la que está
mutada o la que no está mutada.
Por esto hay que engañar a la bacteria para que corrija la hebra antigua y no
la mutada. Hay dos métodos para conseguir esto:
1.− Utilizar el ADN de cadena sencilla que queremos que corrija se obtiene
de una bacteria que sea dNTPasa−, dUT−, Ung−. La dNTPasa es la enzima
que degrada el dUTP. Si la bacteria es dUTPasa− la concentración de dUTP
aumenta. La uracil glicosilasa corta U que estén en el ADN y repara. Si la
bacteria es uracil glicosilasa− su ADN tiene U. esta bacteria tendrá mucho U
en su ADN. Si introducimos está hebra en la célula hospedadora con nuestra
cadena de ADN con el oligo (mutación). La bacteria si es uracil glicosilasa+
por lo que quita los U y utiliza como molde la hebra de fuera que es la que
lleva nuestra mutación.
2.− Hacer la síntesis del ADN de cadena doblo utilizando −tio−dNTPs.
Tratamos con endonucleasas de restricción que corta en la hebra antigua,
después se trata con una exonucleasa que quita bastante de esta hebra y
después sintetizamos esta hebra otra vez y le introducimos la mutación.
Después lo metemos en la célula hospedadora.
* Mutagénesis de cassette; queremos cambiar una secuencia concreta. Se
corta a ambos lados de la secuencia. Por síntesis química se hace una hebra,
luego la otra y se unen, se aparean porque son complementarias y se
introduce en el hueco.
* Mutagénesis por PCR; queremos hacer una mutación en un punto concreto
sintetizamos un cebador con la mutación y el otro con la secuencia normal.
Las hebras mutadas aumentan progresivamente su número. Obtenemos
muchas copias de nuestro inserto mutado. Para poder poner la mutación en
mitad de un gen hacemos dos PCR diferentes introduciendo el cebador 1 y el
2 en un caso y el 3 y 4 en otro caso. Hacemos una PCR que contenga los dos
fragmentos que obtenemos con los cebadores 1 y 4. Al hacer PCR A
complementa con D y B con C. puede aparear A−B, A−D, C−D y C−B. El
primer ciclo con la polimerasa la unión A−D se sintetiza la molécula de ADN
de cadena doble. El segundo ciclo tenemos la hebra entera con la mutación en
medio y la polimerasa hace moléculas igual a esta. Además de eso también se
siguen sintetizando más moléculas B y C. B dará lugar a A y C dará lugar a
D.
TEMA 14: MANIPULACION GENETICA EN MAMIFEROS
• INTRODUCCIÓN
Normalmente cuando clonamos mamíferos partimos del gen de interés que ya
va a estar clonado porque si queremos clonar se hace en procariotas, si
queremos estudiar su efecto entonces utilizamos eucariotas.
Ya tenemos el clon, lo manipulamos y después lo introducimos en la célula
hospedadora o en el organismo hospedador y observamos su fenotipo.
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En mamíferos la transformación hace referencia al proceso por el que una
célula normal se transforma en una célula en la que no hay un control sobre
el ciclo celular y se divide de forma indiscriminada.
Para la entrada de ADN extracelular es por transfección independientemente
de cómo entre.
• MANIPULACION GENETICA DE CELULAS
La célula hospedadora es eucariota. Pueden proceder bien de cultivos
primarios (tenemos tejido, lo disgregamos y lo cultivamos), o cultivos
secundarios (a partir de los primarios). Al final las células acaban uniéndose
porque el número de divisiones de una célula está contado. Se divide un
número concreto de veces. Por lo que sólo se hacen periodos cortos.
También utilizan líneas celulares, células transformadoras en las que no hay
un control normal del proceso de división celular, se dividen de forma
indefinida como las células cancerosas.
Las líneas celulares no son homogéneas (esto es un problema). Porque los
genes se dividen o se duplican, etc., y la información genética será diferente
dando resultados diferentes.
• METODOS DE TRANSFECCION
Se pueden clasificar atendiendo a:
1.− Estabilidad del ADN dentro de la célula cuando ha entrado:
⋅ Método de transfección transitoria; el ADN dentro de la célula acaba
perdiéndose.
⋅ Método de transfección permanente; el ADN si se queda dentro de la célula
hospedadora de forma estable.
2.− Si utilizamos una partícula vírica para la transfección:
⋅ Métodos de activa; con virus. Se usan vectores que sean de virus que infectan
sólo a células eucariotas.
⋅ Métodos de pasiva; si entra ADN desnudo sin utilizar ningún virus. Hay que
precipitar el ADN con fosfato cálcico y luego se mezcla con la célula. O bien
por electroporación. O bien por microinyección, se inyecta ADN en el núcleo
o en el citoplasma. O bien por empleo de liposomas o de lípidos catiónicos,
encierran el ADN en unas vesículas lipídicas (mono o bicapa) que cuando
llegan a la membrana de la célula se fusionan y el ADN entra dentro de la
célula, los liposomas catiónicos envuelven el ADN y con ello le confieren
carga positiva al ADN y le facilita la entrada en la célula. En todos estos
casos se puede utilizar el ADN tal cual o una mezcla del ADN que queramos
meter junto con un ADN acompañante, lo que ocurre es que forman
concatémeros muy largos que entran dentro de la célula y se introducen en el
núcleo y se pueden integrar en el ADN de la célula. No se controla ni el
número de unidades que forma un concatémero, ni donde se integran, ni el
número de veces que se integran. En una célula podemos tener diferentes
porciones de integración en diferentes posiciones del genoma. O el ADN se
expresa o no depende de la región del genoma donde se haya integrado (zona
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que se expresa mas o menos). Hay vectores derivados del SV40 y vectores
derivados de retrovirus.
1.− Vectores derivados de SV40.
SV40, únicamente afecta a células de mono. Su genoma tiene unas 5000
pares de bases, es circular de cadena doble, con un origen de replicación, a
ambos lados regiones implicadas en la regulación de la replicación y la
transcripción.
Luego la región de transcripción temprana (izquierda) y a la derecha regiones
de transcripción tardía. En la zona de la transcripción temprana se transcriben
dos proteínas implicadas en la transcripción del virus, sin ellos no se
transcriben Ag T y Ag t. Y en la región de transcripción tardía UP1, UP2,
UP3, para la cápsida del virus.
No se puede empaquetar nada que sea menor de 3900 pares de bases ni
mayor de 5900 pares de bases.
La solución es el uso de vectores que llevan genomas defectivos del virus. Si
quitamos una región u otra necesitamos utilizarlos con vectores ayudadores.
Hay tres estrategias diferentes para un vector ayudador.
• Si utilizamos un vector ayudador SV40 silvestre, cuando pongamos
la célula con el vector más el inserto más el vector SV40. Puede
ocurrir que una célula hay sido infectada por el vector mas el inserto
y entonces en la célula no pasa nada por el vector o no se replica o no
se empaqueta.
• Si se infecta con un SV40, si hay lisis pero no hay inserto que es lo
que nos interesa.
• Si es la infección conjunta se complementa el vector inserto con el
SV40. Por lo que se da la lisis y tenemos el inserto. El problema es
que encontramos calvas, pero no todas nos interesan, unas son
producidas sólo por SV40 y las otras por los dos. Hay que analizar
calva a calva.
Para resolver esto se suelen utilizar vectores ayudadores receptivos. Vector
sin las regiones de la cápsida. Se puede utilizar un SV40 pero defectivo para
el Ag T y Ag t. Para que entre las dos se complementen pero por si solos no
puedan vivir. Por lo que sólo habrá lisis y por lo tanto calvas si se infecta la
célula con los dos, vector y SV40. Las calvas van a tener todas el inserto. De
estas calvas hay dos tipos de partículas virales, una con el SV40 y otra
inserto. Esto se resuelve utilizando como célula hospedadora para este topo
de vectores células cos, son células que han sido infectadas por un virus
SV40 que tiene alguna mutación en el origen de replicación. El SV40 está
integrado en su genoma. El virus no puede salir de ahí porque no pueden
replicarse, pero si que se transcriben sus proteínas, por lo que tiene Ag T, Ag
t y proteínas UP.
Si infectamos estas células con virus defectivos estas si se pueden replicar y
empaquetar. Por eso si utilizamos nuestro vector mas el inserto, así sólo
tenemos replicas del inserto.
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2.− Vectores derivados de retrovirus.
Virus que tienen como genoma una molécula de ARN, suelen llevar la
retrotrancriptasa que necesita todo envuelto en una cápsida y luego la
cubierta.
Cuando entre en la célula hospedadora pierde la cápsida y la envuelta y entra
desnudo. El ARN se tiene que convertir en ADN mediante la
reversotranscriptasa.
Cuando está en forma de ADN de cadena doble se integra en el genoma viral,
se traducen y se obtienen las proteínas del virus. No producen lisis de la
célula.
En su genoma hay en la parte central genes para proteínas, en los extremos
dos repeticiones terminales invertidas (LTR), y entre la primera LTR y los
genes de proteínas hay una secuencia implicada en el empaquetamiento. Los
LTR también son importantes en el empaquetamiento. Los genes que se
sustituyen son los de las proteínas. Se utilizan mucho en terapia génica para
que la célula hospedadora exprese el gen de interés. Necesitamos los LTR
para que se introduzca en la célula de forma más correcta. Pero para
empaquetarlo no tenemos los genes que nos dan las proteínas. Por lo que
metemos en una célula empaquetadora en la que se meten las proteínas de la
cápsula del virus. En la célula empaquetadora tiene que haber un retrovirus
en su genoma y que este sea capaz de producir las proteínas necesarias para
empaquetar al retrovirus.
De la célula hospedadora va a salir una partícula viral con nuestro inserto.
Para impedir que el retrovirus de la célula empaquetadora se replique y salga
de esta célula (la célula empaquetadora está dentro también de la célula
hospedadora) se le quita la secuencia implicada en el empaquetamiento o se
le muta.
Con los virus que obtengamos infectamos la célula que queramos transfectar,
el ARN pasa a ADN de cadena doble, integra dentro del genoma de la célula
que se transcribe pero no se empaqueta.
• METODOS DE SELECCIÓN EN CELULAS EUCARIOTAS
(MARCADORES)
Para células permanentes.
1.− G418; antibiótico de tipo aminoglicósido. El marcador el APH
(aminoglicósido 3´ fosfotransferasa). La célula hospedadora tiene que ser
sensibles al antibiótico. El medio tiene que ser selectivo llevando el
antibiótico. Este antibiótico inhibe la síntesis de proteínas da lugar a la
muerte celular. Si tenemos el gen APH degradamos el antibiótico y da
resistencia al antibiótico.
2.− Por timidita quinasa (tk); el gen de la tk normalmente la del virus herpes
simple. La célula hospedadora tienen que ser tk− y el medio selectivo, medio
HAT, lleva hipoxantina, aminopterín y timidita. La selección en el medio
HAT, la ruta metabólica de los dNTPs se corta por algunos puntos y no se
57
obtienen todos los aminoácidos por acción de aminopterín. Al tener
hipoxantina se obtienen los dos aminoácidos que faltan G y A. Pero nos falta
T. por lo que si tenemos timidita y con tk se puede formar dTTPs, y la célula
no se muere.
3.− Resistencia a ácido micofenólico. El marcador es XGPAT. Ahora la ruta
se corta por el punto de dGTP. En presencia de xantina.
4.− Resistencia a metotrexato (mtx).
• INACTIVACION DE GENES ENDOGENOS
1.− Utilización de ARN antisentido.
Conseguiremos una inactivación funcional del gen endógeno. Este está
presente e intacto, sin mutar.
Vector mas inserto se pone delante de un promotor fuerte (se va a transcribir)
lo ponemos en una orientación tal que el ARN que se transcriba a partir del
promotor tenga la secuencia complementaria a la del ARNm del gen que
queremos inactivar. Las dos cadenas se unen y no se puede traducir.
2.− Inactivación insercional de genes.
Si se consigue una inactivación estructural del gen. Intentamos que nuestro
ADN exógeno se integre exactamente en el sitio que queramos del gen
endógeno. Para que esto ocurra se hace mediante recombinación homóloga.
Inactivación insercional de genes por recombinación homóloga.
El gen endógeno (inactivan), conseguimos este gen y lo modificamos
introduciendo en el centro un gen marcador (gen de resistencia neomicina) a
un lado le ponemos el gen de la tk.
Si sustituimos el gen endógeno por el que hemos fabricado lo hemos
inactivado. Al introducirlo:
⋅ Puede haber una recombinación homóloga y se sustituye el gen endógeno por
el nuestro. La célula es resistente a la neomicina, pero es tk− porque el trozo
de la tk se queda fuera.
⋅ Si no hay recombinación, la célula no es resistente a la neomicina ni tk, es
sensible a la neomicina y tk−.
⋅ Con recombinación no homóloga entra todo, la célula es neomicina resistente
y tk+. Pero esto se puede dar en cualquier sitio.
Conseguir un medio que sólo haya tenido recombinantes homólogos. Medio
con neomicina, las células sensibles mueren. Medio también con ganadovis,
las células tk son sensibles al ganadovis. Por lo que se mueren las células
donde haya habido recombinante no homóloga.
48
HM
58
HC
HN
HM
HC
HN
SONDA 3
SONDA 2
SONDA 1
HM
HC
HN
HM
HC
HN
HM
HC
HN
SONDA 3
SONDA 2
SONDA 1
HM
HC
HN
HM
HC
HN
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HM
HC
60