Tema 1. Material genético. Tema 2. Vectores. Tema 3. Sondas genéticas.

Tema 1. Material genético.
Tema 2. Vectores.
Tema 3. Sondas genéticas.
Tema 4. Hibridación.
Tema 5. Análisis del genoma.
Tema 6. Secuenciación.
Tema 7. Clonación.
Bibliografía.
Tema 1. Material genético.
• Extracción de ADN.
• A partir de sangre
• A partir de tejido o células en cultivo:
• A partir de células bucales
• Extracción de ARN.
• Mediante tiocianato de guanidina
• Mediante urea−cloruro de litio
• Mediante purificación de poli(A)−ARN
• Determinación de ácidos nucleicos.
• Separación analítica y preparativa del ADN.
• Electroforesis analítica:
• En geles de agarosa
• Factores que afectan a la movilidad del ADN en el gel:
• [ ] de agarosa
• Voltaje
• Composición de bases y temperatura
• Composición de la solución amortiguadora de electroforesis
• En geles de acrilamida
• Otras electroforesis:
• PFGE
• OFAGE
• FIGE
• CHEF
• Revelado de geles y medida del tamaño de los fragmentos de ADN
• Electroforesis preparativa
• Enzimas de restricción.
• Clasificación:
• Tipo 1
• Tipo 2
• Tipos de cortes:
• Extremos cohesivos compatibles
1
• Extremos 3' cohesivos
• Extremos 5' cohesivos:
• Extremos romos:
• Extremos cohesivos incompatibles.
• Tipo 3
• Otras enzimas usadas en biología molecular.
• Polimerasas
• Ligasas
• Nucleasas
• Fosfatasas
• Quinasas
• ARNasas:
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
• El ADN
• Los enzimas
• Los nucleótidos
• Los cebadores
• Limitaciones de la PCR y problemas
Tema 2. Vectores.
• Principales utilidades de los vectores:
• Propiedades de un vector:
• Uso de un vector.
• Tipos de vectores:
• Plásmidos
• Pasos para obtener un plásmido:
• Obtención de una gran cantidad de plásmido
• Recombinación y clonación de plásmidos y ADN
• Selección de bacterias con plásmido recombinante
• Sistema del 2º gen de resistencia a un antibiótico
• Sistema del operón lactosa
• Plásmidos mas usados
• Fagos
• Como usar un fago:
• Obtención de fagos
• Construcción de híbridos con ADN exógeno
• Corte del fago
• Deleción − reemplazo
• Fagos más usados
• YACs
• Cósmidos
• Vectores virales eucariotas
Tema 3. Sondas Genéticas.
• Tipos de sondas.
• Según el tamaño se distinguen:
• Sondas grandes
• Sondas pequeñas
• Sondas intermedias
• Obtención de sondas.
2
• Marcaje de sondas.
• Sitios de marcaje o modificación:
• Tipos de marcaje:
• Marcaje radiactivo
• Nick−translation
• Random−primer
• Marcaje de sondas ARN
• Método Tailing
• Marcaje no radiactivo
• Marcaje enzimático
• Modificación química
• Marcaje químico con biotina
• Modificación de sondas con grupos químicamente reactivos
• Marcaje de oligonucleótidos sintéticos
• Purificación de sondas marcadas.
• Los métodos son :
• Precipitación con etanol
• Electroforesis en geles de acrilamida
• Cromatografía de exclusión
Tema 4. Hibridación.
• Factores que influyen en la hibridación.
• Composición de bases:
• Concentración de ADN/ARN y tiempos Cot y Rot:
• Concentración y tamaño de la sonda:
• Concentración de ADN diana:
• Medio de reacción:
• Sales:
• Formamida:
• Dimetil sulfóxido (DMSO):
• Polímeros inertes:
• Tiempos de prehibridación e hibridación:
• Lavados:
• Tipos de hibridación y mecanismos de detección.
• Hibridación sobre soporte sólido.
• Las membranas de nitrocelulosa:
• Las membranas de nylon:
• Proceso de hibridación:
• Radiografía:
• Rehibridación:
• Hibridación en fase liquida:
• Hibridación in situ:
• Hibridación in situ sobre cromosomas:
• Hibridación in situ de bacterias para clonaje:
Tema 5. Análisis del genoma.
• Método Southern.
• Métodos de transferencia:
• Transferencia por capilaridad.
• Transferencia por vacío.
3
• Transferencia electroforética.
• Aplicaciones del método Southern.
• Mapas de restricción.
• Detección de polimorfismos
♦ Tipos de polimorfismos:
♦ RFLP.
♦ VNTR.
♦ STR.
♦ Detección de deleciones.
♦ Análisis de mutaciones puntuales.
♦ Corte enzimático.
♦ Modificación química.
♦ Comportamiento electroforético:
♦ Polimorfismos de conformación se cadenas sencillas o
SSCP.
♦ Análisis del heterodúplex.
♦ Electroforesis en geles de gradientes desnaturalizantes o
DGGE.
♦ Mutaciones puntuales conocidas:
♦ Mutaciones que crean o destruyen un sitio de restricción.
♦ Hibridación.
♦ Amplificación.
Tema 6. Secuenciación.
♦ Secuenciación química, método de Maxam y Gilbert.
♦ Secuenciación enzimática, método de Sanger o de los
dideoxinucleótidos.
♦ Tipos de secuenciaciones enzimáticas:
♦ Secuenciación cíclica.
♦ Secuenciación múltiple.
♦ Secuenciación automática.
♦ Secuenciación quimioluminiscente.
Tema 7. Clonación.
Bibliografía.
Tema 1. Material genético.
♦ Extracción de ADN.
♦ A partir de sangre: deben aislarse las células nucleadas, por
ejemplo linfocitos, preferentemente a partir de sangre
periférica.
♦ Añadir solución hipotónica para la lisis de eritrocitos.
♦ Separación de leucocitos por centrifugación.
♦ Tampón de lisis de leucocitos, dodecil sulfato sódico (SDS).
♦ Extracción de proteinaza K para liberar el ADN de las
proteínas a las que esta asociado.
♦ Extracción de ADN en fenol, cloroformo,...
♦ Precipitar el ADN con alcohol etílico frío.
♦ Recuperar el ADN y diluirlo en una solución de TE
4
(Tris+EDTA).
Otro método es el de eliminar las proteínas celulares
mediante deshidratación y precipitación de las mismas con
una solución saturada de NaCl. Tras centrifugar las proteínas
precipitadas quedan en el fondo del tubo y el ADN en el
sobrenadante que se trasfiere a otro tubo y posteriormente se
precipita igual que antes.
♦ A partir de tejido o células en cultivo:
♦ Romper el tejido por homogenización.
♦ Incubar en SDS y proteinasa K para digerir las proteínas y
extraer el ADN con fenol.
♦ A partir de células bucales: se realiza un enjuague con una
solución de NaCl, se centrífuga, se descarta el sobrenadante
y el precipitado se resuspende en SDS, se incuba y se extrae
el ADN en fenol−cloroformo.
♦ Extracción de ARN.
Al trabajar con ARN surge el problema de las ARNasas,
capaces de degradar el ARN antes de que sea aislado.
♦ Mediante tiocianato de guanidina: el tiocianato es un agente
disociante que lisa y solubiliza las células inactivando la
ARNasa. El proceso continua con una extracción fenólica o
centrifugando en Cl2Cs de modo que separa el ADN del
ARN que va al fondo del tubo de donde se recupera.
Posteriormente se lava en AcNa y se precipita con etanol.
♦ Mediante urea−cloruro de litio: se usa una solución de urea y
o Cl que inactiva las ARNasas y permite la desnaturalización
con proteinaza K. Las proteínas se eliminan en una sola
extracción y los ácidos nucleicos se precipitan con etanol.
♦ Mediante purificación de poli(A)−ARN: hay ARNm con una
cola de poliadeninas, mas de 100, llamada poli(A), estos
ARN se pueden aislar por cromatografía en columna de
celulosa de oligo dT o poli(U) Sepharosa. La cola poli(A)
hibridará con la cadena poli(U) o con el oligo dT, fijándose
en la columna. Después de lavar los ARN no fijados el
ARNpoli(A) se eluye y se precipita con alcohol etílico frío.
♦ Determinación de ácidos nucleicos.
Normalmente es suficiente con una estimación de la
concentración. La [ADN] se determina por
espectrofotometría a una =260 nm en la banda del uv:
♦ 1 unidad de Abs a 260nm de ADN:
♦ de cadena doble = 50g/ml.
♦ de cadena sencilla = 37g/ml.
♦ 1 unidad de Abs a 260nm de ARN cadena sencilla =
40g/ml.
Estas medidas se aplican a soluciones puras de ácidos
5
nucleicos. Para evitar una posible contaminación proteica
debe realizarse una medición de la absorbancia 280 nm ya
que las proteínas absorben tanto a 260 como a 280 y los
ácidos nucleicos solo a 260. Un ADN puro tendrá una
relación D260/280 entre 1'8 y 2.
♦ Separación analítica y preparativa del ADN.
La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es el
método mas usado para separar, identificar y purificar
fragmentos de ADN. Además tiñendo el gel con una baja
concentración de bromuro de etidio, agente intercalante
fluorescente se puede determinar la localización del ADN
dentro del gel.
Las bandas con cantidades de 1−10 ng de ADN se pueden
identificar por examen directo del gel con rayos uv y si fuese
necesario dicho ADN podría recuperarse y utilizarse
posteriormente.
♦ Electroforesis analítica:
♦ En geles de agarosa: las moléculas de ADN de 200 pb y 50
kb se pueden separar en geles de agarosa de diversa
concentración sometidos a electroforesis horizontal en un
campo eléctrico de dirección constante. El protocolo para
realizar este tipo de geles se divide en tres etapas:
♦ el gel se prepara en una [ ] de agarosa apropiada según el
tamaño del ADN que se desee separar (% agarosa ADN Kb).
♦ el ADN se siembra en los pocillos del gel que se somete a
voltaje.
♦ tinción del gel y si el bromuro de etidio se ha incorporado
antes de la migración las bandas se verán directamente bajo
la luz uv.
Factores que afectan a la movilidad del ADN en el gel:
◊ [ ] de agarosa: las moléculas de ADN de doble
cadena migran a través del gel a una velocidad
inversamente proporcional al log10 de su masa
molecular. La masa molecular del fragmento se
interés se puede determinar comparando su
movilidad con la de un marcador de peso molecular
conocido. Las mayores concentraciones de agarosa
permiten separar fragmentos de ASN de menor
tamaño:
Kb de
% agarosa
ADN
0'3
5−60
0'6
1−20
1'2
0'4−6
2'0
0'1−2
6
◊ Voltaje: en general el ADN migra a una velocidad
proporcional al voltaje aplicado pero si este aumenta
demasiado la capacidad de separación disminuye.
◊ Composición de bases y temperatura: el
comportamiento del ADN en agarosa no se altera ni
por se composición de bases ni por se temperatura, al
contrario que en geles de poliacrilamida.
◊ Composición de la solución amortiguadora de
electroforesis: la movilidad del ADN varia según el
tampón utilizado, si este tiene pocos iones la
conductividad será mínima y el ADN migrara
lentamente y si la concentración iónica es elevada la
temperatura podría llegar a derretir el gel.
◊ En geles de acrilamida: se usan para separar
fragmentos pequeños de ADN (5−500pb), estos
geles permiten separa fragmentos que difieran solo
en un par de bases. Se usan en vertical con voltaje
constante. La porosidad de un gel de acrilamida se
determina según la longitud de las cadenas u el grado
de unión entre las mismas. Las tres aplicaciones de
estos geles de acrilamida son:
◊ purificación de oligonucleótidos de síntesis y
eliminación de nucleótidos libres tras marcaje
radiactivo.
◊ determinación de secuencias de ADN.
◊ separación de fragmentos pequeños de ADN de una
longitud menor a 500pb.
◊ Otras electroforesis:
◊ PFGE (Pulsed Field Gel Electroforesis): separa
moléculas de ADN cambiando la orientación y/o
polaridad del campo eléctrico a lo largo del
recorrido. A cada modificación del campo eléctrico
el ADN deberá reorientarse en paralelo al nuevo
campo y cuanto mayor sea la molécula mayor será el
tiempo de reorientación. Esta electroforesis se realiza
en geles de agarosa al 1% y separa moléculas de 50
kb y 12 megabases.
◊ OFAGE (Orthogonal Field Alaternative Gel
Electroforesis): se aplican 2 campos y el ángulo de
reorientación es de 90º. Separa fragmentos de 9 Mb.
◊ FIGE (Field Inversión Gel Electroforesis):el sentido
del campo se invierte periódicamente, de modo que
el ángulo de orientación es de 180º. Sin embargo la
migración no es proporcional al tamaño de los
fragmentos sobre la totalidad del recorrido y la
determinación precisa de la talla de las bandas es
difícil. Se pueden separar fragmentos de un tamaño
comprendido entre 1−2 Mb.
◊ CHEF (Contour clamped Homogeneus Electric
Field): el campo eléctrico tiene 6 electrodos
7
dispuestos hexagonalmente y se consiguen
reorientaciones de 120º. Las migraciones son
lineales y separa fragmentos de hasta 12 Mb.
◊ Revelado de geles y medida del tamaño de los
fragmentos de ADN: el bromuro de etidio se
intercala entre las bases del ADN y se vuelve
fluorescente de color naranja. Esta molécula se
introduce en la agarosa antes de que el gel se
solidifique. Tras la migración se ilumina con uv para
visualizar el ADN y se puede fotografiar con una
película muy sensible.
◊ Electroforesis preparativa: después de la migración
se visualizan las bandas correspondientes a los
ácidos nucleicos que se van a purificar para esto hay
varios procedimientos:
◊ Por delante de la banda se hace un corte en el gel y
se introduce una membrana, se continua con la
electroforesis hasta que el ADN de la banda haya
pasado a la membrana de la cual el ADN se eluye
con un tampón adecuado. Con esta técnica se pueden
recuperar fragmentos de 500 pb y 5 kb.
◊ Después de la migración la banda se corta y el
fragmento se disuelve en TE, y con 2 o 3
extracciones fenólicas seguidas de precipitación en
alcohol frío.
◊ Enzimas de restricción.
Son endonucleasas que cortan secuencias concretas
dentro de la cadenas de ácidos nucleicos.
Hoy día se conocen mas de 500 enzimas de
restricción que se nombran del siguiente modo: (Eco
RV)
⋅ La 1ª letra es una mayúscula igual a la inicial
de la especie bacteriana de donde se extrae
(E).
⋅ Las dos siguientes letras son minúsculas y se
corresponden con el genero de la bacteria
(co).
⋅ Las otras tres letras provienen de una cifra
romana que representa el numero de orden
de descubrimiento de la enzima dentro de la
misma bacteria (V). Se puede añadir una
mayúscula que represente la cepa (Ry)
⋅ Clasificación:
⋅ Tipo 1: después de reconocer la secuencia, la
enzima se desplaza sobre el ADN y se fija
aleatoriamente a 1000 o 5000 pb de esa
secuencia y corta
⋅ Tipo 2: la enzima corta en la secuencia
reconocida, estas secuencias son
8
palindrómicas, se leen igual de izquierda a
derecha que de derecha a izquierda. Dos
enzimas de restricción que reconocen un
misma secuencia se denominan
isoesquizómeros.
⋅ Tipos de cortes:
⋅ Extremos cohesivos compatibles: las
enzimas pueden cortar en el extremo 3' o en
el 5' del palíndromo.
⋅ Extremos 3' cohesivos:
5'−cg!atcg−3' 5'−cg.......atcg−3'
3'−gcta!gc−5' 3'−gcta.......gc−5'
⋅ Extremos 5' cohesivos:
5'−cgat!cg−3' 5'−cgat.......cg−3'
3'−gc!tagc−5' 3'−gc.......tagc−5'
⋅ Extremos romos:
5'−CCC!GGG−3' 5'−CCC......GGG−3'
3'−GGG!CCC−5' 3'−GGG......CCC−5'
⋅ Extremos cohesivos incompatibles.
⋅ Tipo 3:reconocen la secuencia y cortan 20
nucleótidos mas allá.
Las enzimas de restricción no reconocen
secuencias metiladas porque son
modificaciones , es mediante la metilación
que las bacterias se protegen de sus enzimas
de restricción. Existen enzimas que
reconocen la secuencia metilada y sin
metilar, por ejemplo los isoesquizómeros
Hsp I y Hpa II la 1ª reconoce la secuencia
esté o no metilada y la 2ª solo si no lo está.
⋅ Otras enzimas usadas en biología molecular.
⋅ Polimerasas: añaden desoxirribonucleótidos
solo en los extremos 3' hidroxi terminal de
un cebador situado sobre una molécula de
ADN de doble cadena. La síntesis solo
sucede en dirección 5' 3'. Muchas
polimerasas poseen además una actividad
exonucleasa que retira nucleótidos mal
incorporados tanto en dirección 3'5' como en
dirección 5'3'. Si es exonucleasa 3'5' deja
extremos 3' libres, si es una exonucleasas
9
5'3' dejara extremos 5' libres.
Enzima
Actividad catalítica
3'5'
5'3'
Polim
exonucleasa exonucleasa
E. coli
ADN
Baja Presente
polimerasa
Fragmento
de Klenow,
fragmento
Baja No existe
de la ADN
polimerasa
de E. coli
T4 ADN
polimerasa,
producida
por E. coli
Alta No existe
cuando esta
infectada
por el fago
T4
T7 ADN
Alta No existe
polimerasa
Taq ADN No
presente
polimerasa existe
Las actividades principales de las
polimerasas son:
Intermedia
Intermedia
Intermedia
Rápida
Rápida
• Secuenciación de ADN por el
método Sanger.
• Creación de hebras complementarias
a una hebra molde.
• Rellenado de extremos cohesivos
para hacerlos romos.
• Marcaje radiactivo con P32.
• Amplificación de secuencias
mediante PCR.
• Ligasas: unen fragmentos de ADN.
• ADN ligasa de E. coli: enlaces
fosfodiéster en ADN de doble
cadena, la reacción esta catalizada
por NAD+.
• T4 ADN ligasa: usa ATP
hidrolizado en AMP y pirofosfato en
lugar de NAD+. Une ADN de
extremos romos y/o cohesivos.
• T7 ADN ligasa usa ATP como
fuente de energía.
• Nucleasas: rompen enlaces
liberando nucleótidos.
10
• ADNasa I:
• se extrae del páncreas bovino.
• degrada ADNdc y produce
oligonucleótidos con el extremo 3'
hidroxilado (con un OH).
• en presencia de:
• Mg+2 corta al azar.
• Mn+2 corta las dos cadenas.
• Endonucleasa S1:
• extraída de Aspergillus oryzae.
• solo degrada ADNcs.
• ARN polimerasas: transcriben el
ADN a ARN a partir de un promotor
especifico.
• ARN ligasas: catalizan la unión del
extremo 5' de un ADN de cadena
simple o de un ARN al extremo 3'
de un ADNcs o de un ARN. Es
necesaria la presencia de ATP.
• Fosfatasas: quitan fosfatos al
extremo 5' del ADN y ARN.
• Quinasas: unen fosfatos al extremo
5' del ADN y ARN
• ARNasas:
• Ribonucleasa A:
• se obtiene del páncreas bovino.
• hidroliza enlaces fosfodiéster que
unen los ribonucleótidos, siempre
después de las bases pirimidínicas.
• Ribonucleasa T1:
• se obtiene de Aspergillus oryzae.
• hidroliza el ARN después de un
residuo de guanina
• Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
Es un método para generar in vitro
grandes cantidades de un
determinado fragmento de ADN a
partir de cantidades mínimas del
mismo.
Una de las propiedades de las ADN
polimerasa es que necesitan una
secuencia cebadora para iniciar la
síntesis de una hebra
complementaria.
Las 2 hebras de una molécula de
ADN pueden disociarse y
reasociarse in vitro por
calentamiento y enfriamiento, este
11
es un proceso altamente especifico
que sucede solo entre hebras
complementarias.
Esta técnica requiere el uso de
cebadores oligonucleotídicos
(primers) complementarios a las
secuencias situadas en los extremos
del fragmento de ADN que se desea
amplificar, se basa en el desarrollo
de ciclos repetidos de
desnaturalización de la doble hebra
de ADN por calor, hibridación de
los cebadores con las secuencias
complementarias y la síntesis de
ADN mediante un dan polimerasa.
En teoría el nº de copias obtenidas
debería ser 2n siendo n el numero de
ciclos, aunque en la practica el
numero de copias es menor. El
numero de copias, si el rendimiento,
R, es constante a lo largo del
proceso, será (1+R)n. Para un
rendimiento del 85% el numero de
copias será (1'85)n que par una PCR
de 30 ciclos representa un valor
aproximado de 106.
• El ADN. Es mejor obtenerlo
totalmente purificado sin ARN ni
proteínas. Actualmente se usan
100ng de ADN para una PCR. El
ADN que se puede usar para una
PCR puede obtenerse por ejemplo a
partir de 200l de sangre capilar que
se calienta 100ºC, se centrífuga y el
sobrenadante es ya una fuente
directa de ADN. Si la secuencia que
se quiere amplificar esta presente
una sola vez (1 copia) la cantidad de
ADN debe estar entre 100−500 ng,
si esta muy repetida llegan 10−100
ng.
• Los enzimas. La 1ª enzima que se
uso fue el fragmento de Klenow de
la ADN polimerasa I de E. coli, pero
se inactivaba con la temperatura de
desnaturalización del ADN, por lo
que tenia que ser añadida fresca al
final de cada ciclo. El que la
temperatura de hibridación no
12
superase los 37ºC favorecía la
aparición de secuencias
inespecíficas. Además aparecían
estructuras secundarias que
impedían el avance de las ADN
polimerasas. Todos estos
inconvenientes se superaros con el
uso de la polimerasa Taq, aislada de
Thermus aquaticus, bacteria
termófila que permitió no tener que
añadir enzima cada vez que
comenzaba un nuevo ciclo y
automatizar el proceso. La actividad
se esta enzima aumenta
considerablemente a partir de 65ºC y
hasta los 72ºC.
• Los nucleótidos. Cuanto mayor sea
la [ ] de nucleótidos aparecerán mas
amplificaciones inespecíficas y la
polimerasa cometerá mas errores.
Las [ ] de los diferentes nucleótidos
deben estar equilibrados aunque el
ADN sea mas rico en una base que
en otra, una de 20mol/l de cada
nucleótido permite sintetizar 2'6g
de ADN.
• Los cebadores. El diseño de las
secuencias cebadoras es muy
importante. Existen unas reglas a
seguir en el diseño de cebadores:
• Las secuencias de los cebadores no
deben permitir que suceda
hibridación entre los mismos.
• Los cebadores deben tener una
distribución de bases equilibrada y
con un contenido e CG similar al del
ADN diana.
• Las secuencias no deben
corresponder a secuencias
geonómicas repetidas.
• La mayoría de cebadores deben
contener entre 18 y 30 bases y sus
concentraciones optimas varían
entre 0'1−0'5 mmol/l
El ión magnesio interviene en la
hibridación delos cebadores con el
ADN diana, en la actividad y
fidelidad de la Taq polimerasa y en
la especificidad del producto de
amplificación.
13
El aparato que realiza la PCR de
modo automático se llama
termociclador.
• Limitaciones de la PCR y
problemas:
• Es imposible amplificar secuencias
de mas de 3 kb y para menos de 1 kb
es necesario ajustar las condiciones
de reacción.
• Es necesario efectuar alguna PCR
previa cuando el numero de copias
de ADN es bajo.
• La contaminación se elimina con el
uso de controles y prevención.
• La síntesis por ADN polimerasa
tiene la ventaja de que estas poseen
también actividad exonucleasa y
correctora, función de la que carece
la Taq polimerasa, para minimizar el
error que esta produce se usan
niveles bajos de dNTP y MgCl2, y
de reduce el nº de ciclos de PCR al
mínimo.
• Los cebadores son secuencias cortas
que en el99% de los caos hibridan
de forma no especifica a lo largo del
ADN. Existe una técnica, PCR
anillada, que es muy útil en la lucha
contra las amplificaciones
inespecíficas.
Tema 2. Vectores.
Los vectores son moléculas de ADN
que pueden manipularse e
introducirse fácilmente en una
bacteria o célula eucariota donde
pueden replicarse en gran nº de
copias. Por ello la inclusión de un
gen o de una secuencia de ADN en
un vector permitirá su introducción
y multiplicación en una célula para
la obtención de un gran nº de copias
idénticas a la secuencia original de
ADN y a su posterior amplificación
mediante selección clonal
molecular.
• Principales utilidades de los
vectores:
♦ El clonaje y amplificación
14
de una secuencia de ADN.
♦ El estudio de los
mecanismos de la expresión
de una secuencia de ADN.
♦ Introducción de genes en
células (transfección) o en
organismos (animales o
transgénicos).
♦ Producción de ARN y
proteínas codificadas por
genes introducidos.
• Propiedades de un vector:
♦ Debe replicarse activamente
en la célula hospedadora de
modo episomal
(independientemente del
ADN de dicha célula).
♦ El tamaño debe ser el menor
para poder inserta la mayor
cantidad de ADN posible y
para poder manejarlo con
mas facilidad.
♦ Tienen que codificar para
proteínas que confieran
resistencia a algún
antibiótico para seleccionar
las células que lo hayan
incorporado.
♦ Su presencia debe afectar lo
mínimo a la célula
hospedadora y debe
mantenerse en ella sin ser
modificado.
♦ El vector debe tener el
mayor numero de dianas
posible para enzimas de
restricción dentro de los
genes de selección a fin de
que la integración del ADN
foráneo facilite el
aislamiento del
recombinante.
♦ Su aislamiento en forma
pura debe ser fácil.
• Uso de un vector.
Primero es necesario cortar el vector
con enzimas de restricción en el
lugar preciso donde se desee insertar
la secuencia a clonar. Los extremos
del vector deben tratarse con
fosfatasa alcalina para que el vector
15
no vuelva a cerrarse sobre si mismo.
El ADN a insertar deberá tener un
tamaño y extremos compatibles con
el vector que lo porte. Ambas
preparaciones (vector y ADN a
insertar) se mezclan en unas
proporciones determinadas en
presencia de ligasas.
Una vez realizada la recombinación
(unión inserto−vector) es preciso
replicar el vector mediante su
introducción en la célula
hospedadora, este paso es especifico
para cada vector.
La elección de la célula hospedadora
se realiza según el vector y el
objetivo.
• Tipos de vectores:
• Plásmidos: son pequeños fragmentos
de ADN circular extracromosómico
de origen bacteriano, se replican
independientemente del cromosoma
bacteriano. El tamaño del plásmido
suele ser de 2−5 kb y puede recibir
hasta 8−9 kb de ADN exógeno.
• Pasos para obtener un plásmido:
• Obtención de una gran cantidad de
plásmido: esta técnica se usa tanto
para obtener plásmido como para
obtener clones recombinantes. Las
bacterias deben cultivarse en un gran
volumen hasta alcanzar una
densidad de 2'5.108 bact./ml que
equivale a Abs600nm de 0'6. se
bloquea la replicación del
cromosoma pero no la del plásmido
por ejemplo con cloranfenicol. El
cultivo se centrífuga, el precipitado
bacteriano se resuspende y se lisa en
medio alcalino, se vuelve a
centrifugar para separar ARN y
plásmido de restos celulares y
cromosoma bacteriano. Se digiere el
ARN con ribonucleasa y se procede
a la extracción fenólica y
precipitación con etanol frío del
plásmido.
• Recombinación y clonación de
plásmidos y ADN: se corta con
16
enzimas de restricción de único sitio
al plásmido que se tratara con
fosfatasa alcalina para que no se
cierre ni se una a otro ADN, de este
modo el plásmido solo se cerrara
sobre la secuencia de ADN exógeno
que esté fosforilada. El plásmido
linearizado y defosforilado se incuba
con el ADN exógeno y la ligasa a
baja temperatura para que los
extremos hibriden. La concentración
del ADN a insertar debe ser menor
que la del plásmido para que haya
mayor unión ADN−plásmido que
ADN−ADN. Después habrá que
introducir el plásmido recombinante
en la bacteria portadora
(transformación bacteriana). Las
bacterias deben ser competentes
para poder introducirles el plásmido
y esto se logra con cloruro clásico en
cultivo con el plásmido en frío.
• Selección de bacterias con plásmido
recombinante: después de la
transformación hay 3 posibilidades:
bacterias sin plásmido, bacterias con
plásmido no recombinante y
bacterias con plásmido
recombinante; son estas ultimas las
bacterias que nos interesan para
seleccionarlas se hace un cultivo en
medio selectivo con antibiótico al
que demuestran resistencia las
bacterias que han incorporado el
plásmido, aunque no se pueda
diferenciar entre las que son
recombinantes y las que no lo son,
es por esto último por lo que se usan
otras técnicas como:
• Sistema del 2º gen de resistencia a
un antibiótico: el ADN exógeno se
inserta dentro de un 2º gen
inactivándolo de modo que se
seleccionan las bacterias resistentes
a un 1º antibiótico pero que no lo
son al 2º antibiótico debido a que el
gen que confiere resistencia esta
inactivado.
• Sistema del operón lactosa: se
transforman las bacterias lac− con
un plásmido con el gen lac Z
(−galactosidasa) que confiere
17
fenotipo lac+ a la bacteria. Si el
ADN exógeno se introduce dentro
del gen lac Z lo inactivara y la
coloración de las colonias en
presencia de un galactósido será
blanca, nula, por lo que no habrá
complementación (plásmido lac− y
bacteria lac−) mientras que si el
ADN exógeno no se inserto en el
gen lac Z del plásmido las colonias
se colorearan de azul. (técnica usada
en practicas)
• Plásmidos mas usados: en un
principio se usaron los que se
encontraron espontáneamente, y
después comenzaron a construirse
plásmidos artificiales.
Uno de los primeros plásmidos
artificiales fue el pBR322, con genes
de resistencia a la tetraciclina y
ampicilina, y con 20 dianas únicas
para enzimas de restricción, la mitad
de las cuales están en los dos genes
de existencia a antibióticos.
Otros plásmidos fueron los de la
familia pUC se pequeño tamaño y
replicación rápida. Contienen el gen
de resistencia a la ampicilina y parte
del gen lac Z con un sitio de
múltiple clonaje, polilynker, que es
una secuencia polinucleotídica
sintética con un gran numero de
sitios de corte sucesivos para
enzimas de restricción que permite
una fácil inserción de casi cualquier
secuencia.
• Fagos: son virus bacterianos de
multiplicación rápida y el numero de
copias que se obtienen es grande ya
que además se multiplican
independientemente de la bacteria.
El ADN exógeno que puede recibir
un fago es mayor que la de un
plásmido, pero la manipulación es
mas compleja.
• Como usar un fago:
• Obtención de fagos: se hace que una
bacteria exprese el receptor para un
fago concreto, se cultivan dichas
18
bacterias con el fago (5.107
fagos/ml bacterias) después de la
lisis bacteriana se extrae el ADN de
los fagos por tratamientos químicos
y se titulan para saber su
concentración.
• Construcción de híbridos con ADN
exógeno: se puede hacer de dos
modos:
♦ Corte del fago: en un único
sitio de donde se insertara el
ADN exógeno de hasta 12
kb.
♦ Deleción − reemplazo: se
basa en la deleción de la
parte central del fago y su
reemplazo con el ADN
exógeno (8−22 kb).
Para la reconstrucción del fago con
el ADN exógeno es necesario
proporcionar una cabeza proteica
que le confiera capacidad infecciosa.
Las proteínas necesarias se extraen
de 2 cepas de E. coli que contienen
el fago integrado en su cromosoma,
mutado y defectivo. La lisis no se
producirá en las bacterias, ya que en
cada cepa existe una mutación
diferente, pero si se complementan
in vitro apareciendo así un fago
completo. El fago infeccioso se
cultiva con células bacterianas que
posteriormente se siembran en placa
Petri para saber se hay
recombinantes ya que si es así
aparecerán calvas de lisis.
• Fagos más usados: el 1º fue el fago
de 48'5 kb que infecta a E. coli, su
ADN es bicatenario, lineal y sus
extremos tienen una secuencia
llamada cos (12 pb, monocatenario y
extremos cohesivos entre si) que
permiten al fago formar
concatenámeros.
• YACs (Yeast Artificial
Chromosome): son vectores que
permiten clonar fragmentos grandes
de ADN de 150−1000 kb. Tienen
tres secuencias necesarias para la
correcta duplicación y segregación
de cromosomas en mitosis y
19
meiosis: TEL (teloméricas), CEN
(centroméricas), y ARS o secuencias
necesarias para la replicación.
• Cósmidos: vectores artificiales
construidos por un plásmido al que
se le han unido las secuencias cos
del fago . Solo se usan para la
construcción de genotecas y
especialmente para andar por el
cromosoma en pequeñas distancias.
Se detecta la infección de bacterias
en la aparición de colonias y no en
las placas de lisis. Debido al gran
tamaño del inserto el tiempo
necesario para la replicación
aumenta, y disminuye el nº de
copias por bacteria.
• Vectores virales eucariotas: son
genomas de ADN o formados por
ADN en alguna parte del ciclo. Los
mas usados son los SV40,
adenovirus, retrovirus, virus tipo
Herpes, baculovirus, etc....
Tema 3. Sondas Genéticas.
Bioquímicamente una sonda es una
molécula de ADN o ARN homologa
a una secuencia de ARN o ADN
diana, con la que híbrida de forma
estable y especifica (por asociación
de bases complementarias). Las
cadenas ricas en G y C están unidas
con mayor fuerza porque entre ellas
hay 3 puentes de H en vez de 2
como sucede entre la A y T.
La sonda es una copia fiel de un gen
o de un fragmento de ARN o ADN y
se unirá exclusivamente esa
secuencia de la que es copia. Esto es
lo que se llama especificidad de la
sonda.
Una vez que la sonda se une a la
secuencia diana se detecta y
cuantifica. La detección solo es
posible si la sonda se ha marcado
con un grupo detectable.
Dependiendo del numero de estos
grupos incorporados y de la señal
que emitan la sonda puede tener
20
diferente sensibilidad, dando una
señal ± intensa. A mayor
sensibilidad menor será la cantidad
de ADN o ARN que la sonda puede
detectar.
• Tipos de sondas.
Se escogen en función de la
secuencia diana (ADN o ARN) y se
tienen en cuenta la longitud y el tipo
de secuencia diana así como el
medio de marcaje y detección.
Según el tamaño se distinguen:
• Sondas grandes: secuencias de ADN
bicatenario de una longitud de 1−4
kb. Pueden ser genómicas,
secuencias con intrones y exones, o
de ADNc, sin intrones, obtenidas a
partir de la transcripción inversa del
ARNm.
• Sondas pequeñas: son secuencias
monocatenarias de 15−50
nucleótidos. Reciben el nombre de
oligonucleótidos sintéticos. Son de
ADN.
• Sondas intermedias: son de ARN.
• Obtención de sondas.
Las sondas bicatenarias de ADN
genómico y de ADNc, se obtienen
por dos métodos distintos. El primer
método fue el clonaje de un
fragmento de ADN en un vector
plasmídico o vírico. El 2º método es
la amplificación de la sonda por
PCR, mas rápido, fácil y económico
que el 1º método.
Las sondas de ARN solo se obtienen
por clonaje. Primero se obtiene un
ADNc que mediante transcripción
inversa pasara a ARN que se
clonara.
Las oligonucleótidos se obtienen por
síntesis química a partir de
nucleótidos libres. Son sondas
menos especificas por su tamaño y
por que la señal de hibridación es
21
mas débil. Sus ventajas son:
♦ Tiempo de hibridación
menor para cubrir un
numero equivalente de
dianas.
♦ Detectan diferencias de una
sola base en la secuencia
diana detectando por lo
tanto mutaciones puntuales.
♦ Se obtienen en gran
cantidad de modo
económico.
Hay ciertas normas para seleccionar
un oligonucleótido usado cono
sonda. El tamaño ideal esta entre 18
y 30 nucleótidos. Las sondas cortas
son poco especificas y las largas
alargan el tiempo de hibridación. La
composición de bases debe tener un
40−60% de CG para una mayor
estabilidad sonda−diana. Es
importante que no existan
secuencias complementarias dentro
de la sonda para que esta n hibride
consigo misma. Es importante que
se estudien otras secuencias
genómicas para que la sonda no
tenga mas de 8 nucleótidos en
común, y en secuencia, con regiones
que no sean dianas.
• Marcaje de sondas.
• Sitios de marcaje o modificación:
Para detectar hibridación hay que
usar sondas marcadas o modificadas
y para ello se marcan los nucleótidos
sin que se vea disminuida la
capacidad de apareamiento entre
bases complementarias. Algunas
bases modificadas pueden ! o ! la
estabilidad del híbrido. La
2−amino−adenina se incorpora en
sondas pequeñas y forma 3 puentes
de H con su complementaria, la
timina. La cosina sustituye a la
guanina en el ARN rico en GC y
solo forma 2 puentes de H con la
citosina. Sise añaden isótopos
radiactivos las propiedades del
marcaje no se ven modificadas.
22
Posibles sitios de marcaje de las
bases:
Adenina:Citosina:Uracilo:Guanina:Timina:
• Tipos de marcaje:
• Marcaje radiactivo: el marcaje de
sondas mediante isótopos
radiactivos es el mas usado. Pueden
marcarse todos los tipos de sondas y
puede ser uniforme o en los
extremos de la cadena.
El isótopo mas utilizado es el P32,
con alta actividad especifica (9200
Ci/mmol puro) y emite partículas
de alta energía (1'7 MeV) por lo que
sondas marcadas con este elemento
tienen un elevado rendimiento y
sensibilidad.
El marcaje puede ser en diferentes
posiciones, o . El P32 tiene un
periodo de semidesintegración
relativamente corto, 14'3 días, lo que
obliga a usar las sondas marcadas
dentro del periodo de una semana
después dl marcaje, y además la
emisión de partículas durante
largo tiempo puede alterar la
estructura de la sonda.
Otro isótopo muy utilizado es el
S35, su emisión de partículas tiene
menos energía (0'167 MeV) y su
actividad especifica también es
menor (1500 Ci/mmol). Su largo
periodo de semidesintegración (87
días) hace que sea muy usado. Las
sondas marcadas con este isótopo
tuenen una alta resolución, pueden
diferenciar señales de hibridación
muy próximas, incluso dentro de
una misma célula por ello es
utilizado en hibridaciones in situ y
sobre preparaciones histológicas o
citogenéticas.
Los nucleótidos marcados con S35
tienen un grupo fosfotioato (P=S) en
vez de un grupo fosfato (P=O) en
posición o , este cambio puede
23
inhibir la actividad de ciertas
enzimas, esta demostrado que la
ADNpolimerasa I incorpora estos
nucleótidos con menor frecuencia.
El 3º radioisótopo es el tritio H3,
con baja actividad especifica (29
Ci/mmol puro), baja energía de las
partículas beta (0'019 MeV) y un
largo periodo de semidesintegración
(12 años). Su baja actividad
especifica hace su necesario un largo
periodo de tiempo para su detección.
Se usa para hibridaciones in situ
puesto que su baja energía ofrece
una alta resolución con poco ruido
de fondo.
Otros isótopos fueron el I125 y el
I131, este último se desestimó
debido al riesgo que producía su
uso. El I125 tiene menor energía y
un mayor periodo de
semidesintegración las emisiones
beta y gamma dan una alta
sensibilidad y resolución se emplea
en hibridaciones in situ.
• Nick−translation: produce ADN
uniformemente marcado con una
alta sensibilidad. Se usa para marcar
sondas de ADN bicatenario
obtenidas por clonaje con un tamaño
de 600 nucleótidos, de los cuales el
30−60 % están marcados con P32
(actividad 109 cpm) o con H3
(actividad 108 cpm).
• Proceso:
• ADNasa I: corta aleatoriamente el
ADN formando extremos 3'−OH y
5'−P.
• ADN pol I (5'−3' exonucleasa):
elimina 1 o mas bases del extremo 5'
de los cortes.
• ADN pol I (3'−5'): incorpora
nucleótidos en dirección 3' 5', estos
nucleótidos están marcados,
normalmente solo se marca uno de
los cuatro tipos de nucleótidos.
• Random−primer: se aplica para
marcar sondas lineales de ADN
clonado en un vector u obtenidas por
24
PCR.
• Proceso:
• Se desnaturaliza por calor el ADN y
se añade una mezcla de
hexanucleótidos sintéticos de todas
las secuencias posibles (random
primers o cebadores aleatorios).
• Algunos hexanucleótidos hibridan y
ofrecen un extremo 3'−H que será
cebador para la actividad polimerasa
del fragmento Kleenow de la ADN
polimerasa.
• Se añaden nucleótidos siendo solo
uno de ellos el marcado que se
incorporara en un 60%. Se puede
usar cualquier marcaje pero con S35
existe un menor % de incorporación.
• Ventajas frente a Nick−translation:
• La sonda tiene una actividad
especifica mayor y se obtiene en
poco tiempo (30').
• El ADN no se rompe durante la
reacción con lo que se necesita
menor cantidad de sonda.
• El marcaje se incorpora de modo
uniforme por toda la cadena.
• Se puede aplicar a fragmentos
pequeños de 100−500 pb en los que
Nick−translation es menos eficiente.
• Marcaje de sondas ARN: se
obtienen sondas de ARN marcadas a
partir de ADN clonado en vectores
de transcripción. Los vectores de
transcripción contienen promotores
para la ARN pol adyacentes al lugar
del clonaje. Después de clonar la
secuencia de ADN deseada se añade
ARN pol que realiza una
transcripción in vitro con dUTP
marcado. Se pueden obtener sondas
de las dos cadenas del fragmento
clonado, sentido y antisentido. Una
vez obtenida la preparación de la
sonda, se digiere con ADNasa I libre
de ARNasas para eliminar el ADN.
Es necesario trabajar con inhibidores
de ARNasas.
• Método Tailing: se usa para marcar
sondas oligonucleotídicas. El
marcaje se realiza añadiendo una
pequeña cola de nucleótidos
marcados al extremo 3' de la cadena
25
mediante una
deoxinucleotidil−transferasa−terminal.
El extremo 5' también puede
marcarse mediante una T4
polinucleótido quinasa que transfiere
el P del ATP32 al extremo 5' del
oligonucleótido, esto puede hacerse
directamente porque el extremo 5'
no esta fosforilado, si lo estuviese
seria necesario desfosforilarlo
previamente.
• Marcaje no radiactivo: el uso de
sondas frías, marcadas con grupos
no radiactivos eliminan el problema
de la contaminación. Todos estos
métodos se basan en la adición a la
sonda de un grupo químico reactivo
que se detecta después de la
hibridación de la sonda con la
secuencia diana. Esta detección se
basa en la formación de un producto
coloreado visible en soporte donde
se produce la hibridación o en el
soporte donde se produce la
formación de modificaciones en la
sonda. El problema de estos
métodos es el bajo índice de
incorporación de grupos detectables
y su menor sensibilidad.
• Marcaje enzimático: usa la biotina,
un complejo de la vitamina B
también llamado vitamina H con
actividad antigénica que se une a
nucleótidos de uridina. Este
compuesto puede detectarse
mediante anticuerpos conjugados
con otros grupos detectables como la
fosfatasa alcalina, la peroxidasa, la
fluoresceína o la rodamina, pero es
le método indirecto el utilizado con
avidina o estreptoavidina que forma
un compuesto coloreado al
reaccionar con la biotina.
Otro compuesto muy usado es la
digoxigenina, esteroide extraído de
la planta Digitalis, se une a
nucleótidos de uridina en la posición
5' de la base pirimidínica, es un
compuesto antigénico que se detecta
con anticuerpos de conejo
contradigoxigenina modificados con
26
un grupo detectable, aunque
normalmente se una a un ac 2º
contra−igG portador del grupo
detectable.
La fluoresceína se une a nucleótidos
de uridina que se incorporan a la
sonda a marcar. Se puede detectar
directamente o usando ac contra la
fluoresceína conjugados con otro
grupo detectable o ac 2º también
modificados.
Actualmente se usan sondas con
fosfatasa alcalina enzima que puede
reaccionar con un sustrato
quimioluminiscente, dicha reacción
emite luz durante 24 horas y puede
detectarse con placas fotográficas.
No todos los nucleótidos
modificados son buenos sustratos
para este tipo de reacciones de
síntesis de sondas:
• dUTP y dGTP: son buenos sustratos
para las ADNpol cuando están
modificadas en posición 5.
• dATP y dGTP: modificadas en
posición 8 no son sustratos
adecuados para la polimerasa pero si
para la transferasa terminal.
• dATP: modificada en posición N6 es
incorporada al ADN por varias
enzimas.
• dUTP, dCTP y dATP: modificados
con biotina son incorporados por la
transferasa terminal pero si están
modificados con digoxigenina solo
podrá incorporar dUTP.
• dUTP: modificado por biotina es
muy usado para sondas frías de
ARN puesto que es muy buen
sustrato para las ARN pol.
• Modificación química: se basa en la
adición de grupos detectables
directamente sobre las secuencias
deseadas. La sonda se marca sin
necesidad de reacciones enzimáticas
se usan ac 1º y/o 2º para detectar un
compuesto que se une a residuos de
alguna base.
27
• Marcaje químico con biotina: se usa
la fosfobiotina sensible a la luz, que
reacciona con los residuos de
adenina en la posición N7. con este
método se marca una base de cada
50 por ello se usa para sondas de
mas de 200 nucleótidos.
Posteriormente el ADN marcado se
separa con extracción en butanol y
precipitación con etanol frío.
• Modificación de sondas con grupos
químicamente reactivos: consiste en
la adición de grupos químicos que se
usan posteriormente para añadir
grupos detectables.
• Marcaje de oligonucleótidos
sintéticos: se trata de modificar la
sonda mediante la adición de un
grupo amino libre en el extremo 5'
durante la síntesis de los
oligonucleótidos. Este grupo amino
se usa después para incorporar
grupos detectables como biotina,
peroxidasa o fosfatasa alcalina.
• Purificación de sondas marcadas.
Después del marcaje de una sonda
es necesario eliminar los fragmentos
de ADN inespecíficos los
nucleótidos marcados no
incorporados, las enzimas usadas y
el exceso de sales que podrían
interferir en la hibridación.
• Los métodos son :
• Precipitación con etanol: la sonda
marcada puede precipitar con etanol
y acetato de amonio. La fracción
precipitada se recoge y se
resuspende.
• Electroforesis en geles de
acrilamida: los oligonucleótidos
marcados pueden ser purificados
según su tamaño. Se usa este método
para oligonucleótidos marcados por
el método Tailing, para ello s somete
la sonda a una electroforesis en gel
de acrilamida desnaturalizante,
detectándose en el gel la sonda de
longitud adecuada que se extraerá
cortando esa zona del gel.
• Cromatografía de exclusión: la
28
filtración en gel de la sonda marcada
elimina los nucleótidos libres,
marcados y sin marcar. Este método
se realiza en columnas de Sephadex,
gel constituido por pequeñas esferas
que permite una permeabilidad
selectiva. Los nucleótidos y
moléculas pequeñas quedan
retenidas en el gel y las grandes
(sonda marcada) pasan a través de
las esferas.
Tema 4. Hibridación.
La hibridaciones basa en el
apareamiento por
complementariedad de bases (C−G y
A−T/A−U) de dos secuencias
nucleotídicas. Un ADN
monocatenario o un ARN de
determinada secuencia (sonda) se
apareará con otro ADN
monocatenario o ARN de secuencia
complementaria (diana).
Cuando un ADN bicatenario se
calienta a una temperatura superior a
la temperatura de fusión se separa en
2 hebras porque se rompen los
puentes de hidrógeno, si
posteriormente se procede a un lento
enfriamiento las hebras se reasocian
progresivamente, esto es lo que se
llama hibridación y se produce
cuando existe complementariedad
entre el ADN − ADN o ADN −
ARN.
• Factores que influyen en la
hibridación.
• Composición de bases: las
moléculas de ADN ricas en GC
poseen una Tm (temperatura de
fusión) superior a una pobre en
dichas bases.
• Concentración de ADN/ARN y
tiempos Cot y Rot: cuanto mayor es
la [ADN] mayor es el numero de
copias de las secuencias
complementarias y mayor es la
velocidad de hibridación. El tiempo
Cot: Co es la concentración inicial
29
de ADN en mol/l y t es el tiempo de
incubación en segundos, el Cot1/2
es el tiempo que tarda en reasociarse
la mitad de las moléculas de ADN
durante la hibridación. Cuando se
trata de un híbrido ADN / ARN se
considera la [ ] y el tiempo necesario
para la reasociación del ARN y
entonces se usa la variable Rot.
• Concentración y tamaño de la sonda:
cuando existe un exceso de sonda la
velocidad de hibridación depende
principalmente de la longitud
(complejidad) de la sonda y de su
concentración. Tiempos de
hibridación superiores a 18 horas
dejan de ser efectivos. Las
características de una sonda sintética
son:
♦ Longitud: 18−50
nucleótidos.
♦ Composición de bases CG
entre un 40−60 %.
♦ No deben existir regiones
complementarias dentro de
la sonda para que no Irbid
con ella misma.
♦ Evitar secuencias con mas
de 4 bases iguales seguidas.
♦ No debe haber mas de un
70% de homología entre la
sonda y cualquier zona del
genoma que no sea nuestra
diana.
♦ Concentración de ADN
diana: la [sonda] debe ser
superior a la del ADN diana
para que no haya
competencia de este ADN
diana con otro que no sea
diana, pero parecido,
produciéndose hibridaciones
inespecíficas.
♦ Medio de reacción:
♦ Sales: si disminuye la fuerza
iónica disminuye la Tm.
Esto se debe a la
astringencia, una solución
es mas astringente cuanto
mas diluida esta y
desestabiliza la doble
cadena de ADN. Esta
30
propiedad se usa para:
◊ Disminuir el ruido
de fondo.
◊ Probar la
especificidad de una
hibridación.
◊ Obtener
deshibridación.
◊ Formamida:
disminuye mucho la
Tm y se usa cuando
la sonda es ARN o
cuando es diana.
◊ Dimetil sulfóxido
(DMSO): se usa
cuando la Tm es
baja para reducirla
aun mas.
◊ Polímeros inertes:
se usan para
acelerar las tasas de
hibridación de
sondas con tamaños
superiores a 250
nucleótidos. Estos
polímeros son por
ejemplo dextran
sulfato,
polietilenglicol
(PEG), ácido
poliacrílico, fenol,
sales criotrópicas,
etc...
◊ Tiempos de
prehibridación e
hibridación: los
protocolos
recomiendan
prehibridaciones de
3 horas para filtros
de nitrocelulosa y
15' para membranas
de nylon. Una
hibridación puede
llevar toda la noche.
◊ Lavados: pueden
provocar
deshibridaciones si
no se realizan a
temperaturas
adecuadas.
◊ Tipos de
31
hibridación y
mecanismos de
detección.
Los métodos de
hibridación mas
comunes son los
que implican la
inmovilización de
uno de los ácidos
que intervienen de
modo que las
moléculas no
hibridadas se
eliminan mas
fácilmente. El
soporte sólido de
inmovilización
suelen ser
membranas de
nitrocelulosa o
nylon, esferas
magnéticas o de
látex, o placas
`microtites'.
◊ Hibridación sobre
soporte sólido.
◊ Las membranas de
nitrocelulosa: se
usan a menudo para
inmovilizar ácidos
nucleicos en el
proceso de
hibridación. La
unión no es
covalente. Después
de la fijación a 80ºC
durante 2 horas, el
ácido nucleico esta
fuertemente unido y
no se deshibrida ni
con lavados
fuertemente
astringentes.
Los inconvenientes
de estas membranas
de nitrocelulosa
son:
⋅ La unión
32
del ácido
nucleico
requiere
altas [ ] de
sales.
⋅ Los ácidos
nucleicos
pequeños (<
200 pb) se
unen con
dificultad.
⋅ La
fragilidad
de la
membrana
hace difícil
su
manipulación
y no
resisten
muchas
rehibridaciones.
⋅ Las
membranas
de nylon:
son mas
resistentes y
duraderas y
permiten la
unión
covalente
de los
ácidos
nucleicos
aunque sean
de 10 pb.
Requieren
calentamiento
para fijar
los ácidos
nucleicos
pero los
mantienen
así dentro
de un
amplio
rango de
condiciones.
Permiten
eliminar la
sonda sin
despegar la
33
diana de la
membrana.
⋅ Proceso de
hibridación:
las
secuencias
de ADN
inmovilizadas
por calor
sobre la
superficie
de la
membrana
(spot blot)
se somete a
prehibridación
con una
solución
amortiguadora
de
hibridación
sin sonda,
luego se
sustituye
esta
solución por
la de
hibridación
con la sonda
marcada, la
sonda que
no haya
hibridado se
elimina por
lavados
dependientes
del tipo de
sonda
utilizada.
⋅ Radiografía:
las sondas
marcadas
radiactivamente
se detectan
por
radiografía.
El tiempo
necesario de
exposición
en placas de
rayos X
para la
34
visualización
de la
radiación
depende del
tipo y
cantidad de
isótopo
usado.
⋅ Rehibridación:
después de
la
hibridación
y
radiografía
el filtro se
puede
deshibridar
de la sonda
original con
un lavado
de alta
astringencia
(! Tª y ![ ])
o con agua
destilada a
100ºC y el
filtro puede
rehibridarse
con una
sonda
distinta para
detectar tras
secuencias.
Una
membrana
de nylon
puede
rehibridarse
hasta 12
veces, las
de
nitrocelulosa
son muy
frágiles
pero
también
pueden
rehibridarse.
⋅ Hibridación
en fase
liquida: las
secuencias a
35
hibridar
están en
solución en
un tampón y
se asocian
debido a la
agitación
térmica. Se
trabaja a
una Tª 15ºC
menor que
Tm. Las
tres técnicas
mas usadas
son
métodos
espectrofotométricos
técnica de la
nucleasa S1
y
cromatografía
del
hidroxil−apatito.
Y sus
aplicaciones
son la
comparación
de los
tamaños del
genoma de
secuencias
únicas
(STS),
análisis
global de
los % de
homología
de
secuencias
entre dos
especies
próximas y
el análisis
de
secuencias
repetitivas.
⋅ Hibridación
in situ: es la
hibridación
directa de
una sonda
con el ADN
36
o ARN de
cortes
citologicos
o de
cromosomas
metafasicos.
⋅ Hibridación
in situ sobre
cromosomas:
los
cromosomas
se preparan
en metafase
a partir de
linfocitos
circulantes,
linfoblastos
y
friboblastos.
La
hibridación
se realiza
directamente
sobre
preparaciones
citogenéticas
fijadas en
un porta y
se someten
a un
tratamiento
con
ARNasa
para
destruir el
ARNm y
una
desproteinización
mediante
proteinasa
K.
Las técnicas
de bandeo
pueden
aplicarse
antes o
después de
la
hibridación
que suele
hacerse con
37
un isótopo
radiactivo
(H3). El
resultado se
observa al
microscopio,
las señales
positivas se
ven como
granos
sobre los
cromosomas.
⋅ Hibridación
in situ de
bacterias
para
clonaje: el
clonaje de
un gen
consiste en
la búsqueda
de una cepa
de bacterias
que hayan
integrado
unvector
recombinante
con el gen
que nos
interesa.
Para ello
disponemos
de un banco
celular en
placas Petri,
se toma una
huella de
cada placa
mediante un
filtro de
nitrocelulosa
o nylon. Las
células de
estas
membranas
se lisan y
sus cadenas
de ADN se
separan
para
hibridarlas
38
con nuestra
sonda.
Después de
lavar se
procede a la
radiografía
para
identificar
así la placa
y la colonia
con el ADN
diana
integrado.
Tema 5.
Análisis del
genoma.
Técnicas
para
localizar
secuencias
y para el
análisis de
las mismas.
⋅ Método
Southern.
Se usa para
localizar
secuencias
de ADN
genómico.
El ADN se
digiere con
1 o mas
enzimas de
restricción,
los
fragmentos
resultantes
se separan
según su
tamaño en
un gel de
agarosa por
electroforesis.
El ADN se
desnaturaliza
in situ y se
39
transfiere a
un soporte
sólido
(membranas
de
nitrocelulosa
o nylon) y
se híbrida
con sondas
marcadas
radiactivamente
posteriormente
se hace una
autorradiografía
y se
identifican
las andas.
Hay tres
métodos
para
transferir
fragmentos
de ADN de
geles de
agarosa a
soportes
sólidos.
⋅ Métodos de
transferencia:
⋅ Transferencia
por
capilaridad:
los
fragmentos
de ADN se
llevan desde
el gel al
soporte
sólido que
se cubre con
un paquete
de papel
que asegure
el paso, por
capilaridad,
del liquido
en el que
está
embebido el
gel a través
40
del soporte
sólido hasta
el papel, de
modo que
arrastre el
ADN
hibridado y
quede preso
en el filtro
de nylon o
nitrocelulosa
en el cual se
fijara
mediante
diferentes
métodos.
⋅ Transferencia
por vacío:
se hace
pasar la
solución al
filtro de
nitrocelulosa
o nylon por
extracción
mediante
una bomba
de vacío.
⋅ Transferencia
electroforética:
el gel se
coloca entre
dos
esponjas y
se introduce
en una
cubeta que
se mantine
fria puesto
que el
voltaje
elevado que
se necesita
puede
interferir en
el proceso.
⋅ Aplicaciones
del método
Southern.
⋅ Mapas de
restricción:
el ADN a
41
analizar se
reparte en
fracciones
que se
tratan con
diferentes
enzimas de
restricción,
los
fragmentos
obtenidos se
separan por
Southern
usando una
sonda del
gen. Las
medidas de
los
fragmentos
están en
función de
su distancia
de
migración y
se
comparan
con un
marcador de
peso
molecular
cuyo
tamaño
sirve de
patrón. Se
pueden
hacer reglas
de tres entre
distancia
migrada de
un
fragmento
con la
distancia
recorrida y
las Kb de
un
fragmento
marcador,
para
averiguar
las Kb de
nuestro
42
fragmento
problema.
La
comparación
de los
mapas de
restricción
del ADN
genómico
con su
correspondiente
ADNc
permite
tener una
idea de los
intrones que
posee el
gen.
⋅ Detección
de
polimorfismos:
la mayoría
del ADN
genómico
de un
organismo
superior no
es
codificante.
Si se analiza
una
secuencia
no
codificante
de una
región
autosómica
en 10
cromosomas
de
diferentes
individuos
puede
existir una
variación de
200 pb,
estas
variaciones
constituyen
polimorfismos.
43
Los
polimorfismos
son
estables, se
transmiten
de manera
mendeliana
y
constituyen
la base
molecular
de la
diversidad
genética
entre
individuos
de la misma
especie.
• Tipos
de
polimorfismo
• RFLP
(Restriction
Fragment
Length
Polimorphism
son
fragmentos
de
restricción
de
longitud
variable,
polimorfismo
del
ADN
que
se
detectan
por
enzimas
de
restricción.
Hay
4
puntos
importantes
a
tener
en
cuenta
44
en
el
análisis
de
RFLP:
♦ El
patró
obse
depe
de
la
sond
utiliz
en
el
análi
♦ El
camb
de
una
base
detec
por
una
enzim
de
restr
que
origi
un
RFL
no
es
respo
de
una
enfer
gené
carec
de
cons
func
Es
útil
para
marc
un
crom
y
segu
su
segre
45
♦ Se
trans
de
mod
mend
♦ Si
se
usan
RFL
para
segu
la
heren
de
un
crom
en
una
fami
los
mas
útile
serán
aque
dond
la
mayo
de
los
indiv
sean
heter
Si
el
99%
de
la
pobl
lleva
uno
de
los
alelo
y
el
otro
alelo
lo
porta
solo
el
1%,
46
dicho
alelo
será
un
marc
poco
signi
pues
que
la
mayo
de
los
indiv
serán
hom
(99%
Es
impo
cono
el
conte
de
infor
del
polim
(PIC
que
se
calcu
en
base
a
la
prob
de
que
un
indiv
sea
heter
para
un
locus
depe
de
la
frecu
de
los
alelo
en
47
la
pobl
Los
RFL
pued
detec
por
PCR
sin
trans
ni
hibri
si
se
cono
las
secu
flanq
de
dicho
RFL
se
ampl
digie
y
anali
por
elect
♦ VNT
(Var
Num
of
Tand
Repe
son
un
num
varia
de
repet
en
tánde
tamb
llam
mini
Se
desc
medi
Sout
,
48
se
carac
por
la
prese
de
secu
corta
y
repet
orde
en
tánde
Dich
secu
tiene
9−60
pb
y
su
func
no
se
cono
El
num
de
repet
difie
entre
crom
hom
y
varia
desd
4/5
a
varia
doce
Se
detec
medi
Sout
y/o
enzim
de
restr
Este
tipo
de
secu
perm
49
el
estud
simu
de
60
locis
autos
en
un
indiv
Com
cada
loci
es
mult
la
prob
de
enco
2
indiv
no
empa
con
un
perfi
de
restr
idént
es
míni
("10
Los
mini
perm
estab
fácil
la
espe
gené
de
un
indiv
o
de
una
línea
celul
y
la
filiac
de
50
las
mism
Son
muy
utiliz
en
prue
de
pater
y
en
medi
foren
♦ STR
(Sho
Tand
Repe
son
repet
corta
en
tánde
♦ Dete
de
delec
detec
muta
de
no
meno
de
40
pb.
Dele
meno
pued
detec
por
PCR
y
las
mayo
por
elect
en
camp
pulsa
♦ Anál
de
muta
punt
51
Las
alter
de
una
base
en
la
secu
nucle
cons
las
muta
más
comu
en
la
mayo
de
los
loci
génic
No
todas
caus
enfer
Para
detec
estas
muta
se
elige
un
méto
en
func
de
la
natur
de
la
muta
del
tama
y
estru
del
locus
de
la
dispo
de
ARN
52
de
las
fuen
dispo
etc...
♦ Muta
punt
desc
Los
heter
de
ADN
o
ARN
(tipo
salva
/
muta
se
carac
por
el
apare
incor
de
nucle
en
el
sitio
de
la
alter
Estas
muta
punt
desc
se
anali
por
difer
méto
♦ Cort
enzim
el
heter
ARN
cons
por
un
53
ribos
salva
marc
y
un
ARN
muta
obten
por
PCR
se
trata
con
ARN
A,
que
corta
el
ARN
mon
El
prod
se
anali
por
elect
en
gel
de
acril
desn
y
si
se
prod
apare
se
obse
dos
fragm
Hay
que
marc
las
dos
cade
de
ARN
para
que
la
efica
54
de
la
ARN
Asea
de
un
60%
y
no
de
un
30%
(con
una
cade
marc
A
A
Gel
Desn
Hom
G
G
Arn
muta
corte
con
Arn
norm
hetro
arnas
a
♦ Mod
quím
corte
quím
con
apare
incor
(CCM
Chem
Clea
of
55
Mist
se
basa
en
los
princ
de
secu
de
Max
y
Gilb
Un
heter
ADN
salva
marc
/
ADN
o
ARN
poten
muta
se
corta
por
los
pb
mal
apare
que
han
sido
mod
prev
de
mod
quím
Los
desa
que
impl
una
citos
se
marc
con
tetra
de
osmi
(OsO
y
56
los
que
impl
un
timin
con
hidro
(HA
La
sond
se
marc
con
P32
y
se
híbri
con
la
secu
poten
muta
se
incub
una
mues
con
OsO
y
otra
con
HA,
cada
una
se
trata
con
piper
que
corta
el
ADN
a
la
derec
de
la
base
quím
mod
Se
anali
57
los
fragm
en
geles
desn
de
acril
Este
méto
es
fiabl
al
100%
pero
es
lento
y
los
prod
quím
muy
tóxic
NOR
MUT
MAR
HET
MOD
QUI
CON
OsO
:
CON
HA:
TRA
CON
PIPE
GEL
DES
HOM
58
♦ Com
elect
♦ Polim
de
conf
se
cade
senc
o
SSC
(Sing
Stran
Conf
Polim
se
basa
en
la
varia
de
mov
elect
en
geles
de
acril
desn
de
molé
de
ADN
o
ARN
que
difie
en
su
secu
La
estru
2ª
del
ácido
nucle
varia
segú
su
secu
y
tamb
59
dism
a
medi
que
aume
el
tama
Esta
técni
es
útil
para
fragm
corto
de
ADN
la
efica
es
del
90%
para
mas
de
200
pb
y
del
70−8
para
mas
de
400
pb.
La
secu
de
ADN
se
marc
dura
la
PCR
es
prod
se
desn
calen
y
enfri
brusc
60
para
evita
la
reaso
de
cade
que
form
estru
mon
El
resul
se
anali
por
elect
Se
usa
siem
un
ADN
contr
que
no
este
muta
con
segu
Esta
técni
estab
la
prese
o
ause
de
la
muta
ADN
NOR
PCR
ADN
MUT
DES
ELE
ADN
NOR
ADN
61
MUT
♦ Anál
del
heter
es
iugu
que
la
SSC
pero
en
este
caso
la
varia
de
mov
elect
viene
dada
por
el
mal
apare
de
base
♦ Elec
en
geles
de
grad
desn
o
DGG
(Den
Grad
Gel
Elec
la
TM
de
un
fragm
de
ADN
esta
en
func
de
su
62
secu
una
muta
punt
impl
una
varia
de
Tm
esto
pued
evide
por
medi
de
una
elect
en
gel
de
acril
dond
se
ha
estab
un
grad
linea
desn
(urea
o
form
Los
fragm
de
ADN
migr
segú
su
tama
en
kb
hasta
que
entra
en
la
zona
del
grad
dond
se
63
desn
y
se
sepa
La
migr
de
las
band
debe
comp
con
un
ADN
de
refer
♦ Muta
punt
cono
♦ Muta
que
crean
o
destr
un
sitio
de
restr
una
muta
que
suce
en
una
secu
para
una
enzim
de
restr
destr
dicho
sitio
y
al
revés
Para
evide
estas
muta
se
pued
64
aplic
Sout
PCR
y
diges
enzim
♦ Hibr
la
hibri
con
oligo
de
alelo
espe
(ASO
Allel
Spec
Olig
cons
en
la
hibri
difer
medi
oligo
de
secu
espe
de
15−2
pb.
Los
oligo
se
sinte
con
la
muta
en
el
centr
y
se
hibri
con
el
ADN
diana
de
mod
que
solo
65
se
prod
apare
corre
♦ Amp
de
alelo
espe
(ASA
depe
de
la
ampl
selec
por
PCR
La
técni
ARM
(Am
Refr
Muta
Syste
se
basa
en
la
selec
de
ceba
para
la
ampl
solo
de
la
zona
muta
La
reacc
de
ligam
en
cade
de
oligo
(Liga
Chai
Rect
LCR
la
Taq
66
ligas
term
para
la
ampl
Se
requ
2
oligo
de
20
pb
una
que
term
antes
de
la
base
muta
y
otro
cuya
1ª
base
sea
dond
se
prod
la
muta
estos
se
hibri
con
el
ADN
y
si
este
esta
muta
la
1ª
base
del
2º
nucle
(sin
muta
no
hibri
67
Tem
6.
Secu
♦ Secu
quím
méto
de
Max
y
Gilb
Se
basa
en
la
capa
de
deter
susta
de
codif
espe
base
del
ADN
Estas
susta
son
hidra
dime
sulfa
(DM
y
ácido
fórm
Prim
se
mod
espe
las
base
(G
DMS
G+A
ácido
form
T+C
hidra
Chid
poste
68
la
piper
corta
las
base
mod
Se
proc
a
una
sepa
elect
en
gel
de
acril
y
poste
revel
La
lectu
se
reali
de
5'
a
3',
desd
la
parte
infer
del
gel
hasta
la
supe
por
ello
es
nece
marc
el
extre
5'
con
P32.
Este
méto
es
optim
para
69
secu
de
ADN
con
meno
de
250
nucle
a
parti
del
extre
marc
Culti
de
adn
con
mod
quím
(Muc
adn
con
1
MOD
/
TUB
Incu
con
piper
que
corta
a
difer
altur
difer
fragm
de
cada
tubo
Sepa
elect
en
gel
de
acril
y
revel
70
Adn
pipe
Reac
♦ Secu
enzim
méto
de
Sang
o
de
los
dideo
Impl
la
sínte
de
ADN
por
una
ADN
polim
in
vitro
a
parti
de
un
mold
de
ADN
mon
o
bicat
71
pero
desn
Prim
se
incub
el
ADN
mold
con
un
ceba
espe
para
que
se
unan
poste
se
reali
otra
incub
con
deox
(dNT
y
se
reali
otra
incub
es
en
este
paso
dond
la
sínte
de
ADN
se
inter
al
incor
el
dNT
pues
que
carec
de
grup
3'−O
dond
72
segu
incor
nucle
Esta
reacc
se
reali
en
tubo
sepa
cada
uno
con
un
solo
tipo
de
dNT
difer
Se
obtie
de
este
mod
un
gran
num
de
fragm
de
difer
tama
Se
proc
con
una
elect
en
gel
de
polia
en
el
que
se
leen
las
secu
de
5'
a
3'.
73
Incu
de
adn+
Incu
adn+
en
tubo
difer
en
cada
tubo
un
ddNT
Inter
de
la
sínte
Elec
R
A
3'
5'
♦ Tipo
de
secu
enzim
♦ Secu
cíclic
muy
usad
un
en
la
detec
74
de
muta
punt
♦ Secu
múlt
los
prod
de
la
secu
se
some
a
elect
en
gel
y
se
híbri
con
una
onda
espe
se
desh
con
otra
sond
espe
difer
de
la
1ª
en
el
mism
carri
del
gel,
de
este
mod
se
secu
sibre
una
mem
varia
vece
♦ Secu
autom
los
75
ceba
se
sepa
en
4
fracc
y
se
marc
en
su
extre
5'
con
color
difer
una
fracc
con
fluor
otra
con
NBD
otra
con
rojo
tejas
y
una4
con
tetra
A
cada
fracc
se
le
añad
un
ddNT
y
se
incub
Todo
los
fragm
que
haya
incor
el
mism
ddNT
se
76
marc
con
el
mism
color
se
mezc
todas
las
fracc
y
se
coloc
en
un
gel
de
secu
Cada
band
obse
corre
a
un
conju
de
fragm
de
igual
tama
y
estar
marc
con
el
fluor
corre
al
ceba
usad
en
la
sínte
de
los
fragm
Se
proc
a
una
elect
conti
77
en
un
carri
y
el
color
de
la
band
se
deter
al
excit
l
fluor
por
rayo
láser
situa
en
la
base
del
gel
.
la
seña
la
anali
un
orde
que
estab
l
secu
del
fragm
♦ Secu
quim
desp
de
la
elect
de
los
prod
de
secu
bioti
estos
se
trans
78
y
fijan
a
una
mem
de
nylo
y
se
detec
medi
una
reacc
quim
la
estre
fija
los
prod
de
secu
a
la
fosfa
alcal
bioti
inmo
a
la
fosta
con
la
desfo
por
la
fosfa
alcal
el
sustr
diox
emit
luz
que
se
detec
por
autor
Tem
7.
Clon
79
El
clona
es
la
recom
in
vitro
de
un
gen
o
de
un
fragm
de
ADN
con
un
vecto
que
se
repli
de
form
indep
dentr
de
la
célul
hosp
Un
clon
es
una
colon
de
bacte
idént
entre
si,
proc
de
una
única
bacte
Un
clon
recom
será
aque
que
80
conte
el
vecto
en
el
que
se
ha
inser
el
ADN
genó
o
de
ADN
Geno
de
ADN
genó
La
cons
de
una
geno
de
ADN
genó
cons
en
fragm
el
ADN
e
intro
cada
fragm
(inse
en
el
vecto
apro
y
poste
en
el
hosp
El
ADN
proc
81
de
cualq
célul
exce
sise
traba
con
gene
que
sufre
reord
somá
espe
de
tejid
(gen
de
la
inmu
Com
célul
hosp
suele
usars
cepa
de
E.co
res
(−)
(rest
nega
en
las
que
las
enzim
de
restr
no
destr
el
ADN
inser
y
las
cepa
E.co
rec
A−,
en
las
que
82
no
se
prod
recom
del
inser
con
el
ADN
bacte
o
cons
mism
Cuan
una
geno
esta
perfe
estab
conti
de
form
entre
el
conju
de
la
infor
de
un
indiv
tal
y
como
esta
en
su
geno
Este
tipo
de
geno
se
usan
para:
83
Geno
de
ADN
Un
ADN
o
ADN
comp
es
la
copia
de
un
ARN
en
form
de
ADN
Para
que
una
geno
84
de
ADN
sea
repre
debe
conte
al
meno
una
copia
de
cada
ARN
prese
en
la
célul
de
la
que
prov
dicho
ARN
Estas
geno
son
espe
de
cada
tipo
celul
pues
que
cada
tipo
de
célul
pose
unos
ARN
conc
que
le
perm
su
difer
celul
Una
prote
prese
en
bajas
85
canti
en
una
célul
y
con
vida
muy
corta
pued
tener
mas
mens
que
la
codif
que
una
prote
que
este
en
gran
canti
y
que
tenga
una
vida
larga
en
la
mism
célul
tamb
pued
exist
mens
que
no
se
tradu
a
prote
Los
ARN
se
incub
en
prese
de
86
una
ADN
polim
dirig
por
ARN
y
de
una
mezc
de
4
deso
trifos
(dXT
y
de
un
polid
corto
este
ultim
híbri
con
el
ARN
y
sirve
de
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a
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polim
Cuan
ha
copia
como
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el
ARN
este
se
destr
t
se
sinte
la
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ADN
medi
87
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de
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de
la
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de
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M.
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E.
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E.
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