TÉCNICA DE PREPARACIÓN DE FROTIS. COLORACIONES Y COLORANTES.

MICROBIOLOGÍA
UNIDAD 1 – LECTURA 1: Técnica de preparación de frotis. Coloraciones y Colorantes
TÉCNICA DE PREPARACIÓN DE FROTIS.
COLORACIONES Y COLORANTES.
A) TÉCNICA DE PREPARACIÓN DE FROTIS.
Definición de frotis: es la extensión de una suspensión corpusculada en una fase
líquida, en una lámina de vidrio, de forma tal que los elementos queden espaciados
en una monocapa para su posterior visualización al microscopio.
Los frotis son fijados y coloreados, permitiendo con ello una mayor claridad en lo
que respecta a la forma de las bacterias, disposición de las mismas, estructuras
especiales, etc. a diferencia de la práctica anterior –donde estudiábamos bacterias
vivas- aquí observaremos bacterias muertas.
Para la preparación del frotis, contamos con etapas o pasos:
1. Preparación de la lámina. Las láminas se lavan con agua caliente, detergente y /
o jabón. Luego se las enjuaga con agua de la canilla y posteriormente agua
destilada. Luego se conservan en bocales con alcohol a 96°C u acetona
(actuando los mismos como desengrasantes) hasta el momento de su uso. En el
momento que se van a usar, son retiradas del bocal con una pinza y secadas con
un paño que no desprenda pelusas o felpas, para posteriormente pasarlas por la
llama del mechero (lo que completa el desengrasado y elimina los restos de
pelusa que pudieran haber quedado) 3 o 4 veces. Luego lo dejamos enfriar al
aire, ya que si lo depositamos inmediatamente sobre la mesa pueden ocurrir
roturas por la diferencia de temperatura.
2. Extensión del material. Se siguen distintas técnicas según el material del que se
trate:
-
-
extensión de un medio líquido: tomamos con el asa
directamente el medio líquido (tomando en cuenta las
operaciones aprendidas hasta el momento), la llevamos
al borde del portaobjetos y hacemos la extensión de
modo que quede un frotis circular de 1-1,5 cms. de
diámetro.
Extensión partiendo de un medio sólido: en general las
maniobras son las mismas que las del medio líquido,
con la diferencia de que aquí se hace necesaria la
dilución del medio obtenido con solución fisiológica o
agua destilada, para lograr la dispersión de las bacterias
y cumplir con el principio de lo que es un frotis.
Tomamos con el asa una gotita de agua destilada o
suero fisiológico esterilizado, y la colocamos sobre el
portaobjeto. Se toma la espátula, se esteriliza en la
llama, se destapa el tubo de ensayo, se flamea la boca e
introducimos la espátula dejando que se enfríe entre el
medio y el tubo ( o arriba contra la pared); tocamos el
material apenas, recogiendo la cantidad suficiente como
para hacer el frotis, sin lesionar el medio y lo
colocamos sobre la gota que habíamos colocado sobre
el portaobjetos, dispersando el material. A continuación
esterilizamos la espátula, etc.
Profs. Flor Solari – Carmen Mena
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A veces es necesario hacer frotis de órganos, son los
denominados frotis por aposición o impresión que
veremos mas adelante.
3. Secado del frotis: el secado del frotis se hace con CALOR, poniendo el
portaobjeto (sujeto con un palillo) en la parte del aire caliente de la llama del
mechero, secándose lentamente. Si se seca a temperatura ambiente el resultado
es mejor (debido a que en el secado con mechero se forman ondas
concéntricas), pero tiene el inconveniente de demorar mucho tiempo. El frotis
nunca puede ser puesto a secar a temperaturas que superen los 45°, y menos aun
agitarse en forma de abanico, ya que pueden haber proyecciones bacterianas.
4. Fijación del frotis: “Fijar” es la acción de matar bruscamente una bacteria,
conservando su estructura tal como estaba “in vivo”, y sin producir artefactos.
Como consecuencia de esta fijación, el frotis, o sea el material depositado sobre
la lámina de vidrio queda adherido a la misma, lo que evitará –en las
coloraciones en las que haremos lavados- que el material sea arrastrado por el
chorro de agua.
EL CALOR SE RESERVA SOLO PARA LA FIJACIÓN DE BACTERIAS, ya que
si lo usamos para fijar frotis de sangre, destruirá las células que queremos observar.
Técnica: Tomamos la lámina por uno de sus bordes (con la pinza) y la pasamos 3
veces por la llama del mechero (EL FROTIS DEBE ESTAR HACIA ARRIBA),
cortándola de arriba hacia abajo. Entre corte y corte se debe dejar enfriar la lámina
probándola con el dorso de la mano, y cuando el calor se soporta se la pasa
nuevamente. Dejaremos ahora enfriar el frotis sobre tela por ejemplo pero no sobre
la mesa, y ya estará pronto para ser coloreado.
El calor es el fijador mas empleado en bacteriología, pero también ciertas sustancias
químicas, pueden ser también utilizadas: acetona, alcohol metílico y etílico, formol,
etc.
B. FROTIS DE ESPECIMENES PATOLÓGICOS.
Los materiales que llegan al laboratorio microbiológico para hacer frotis, pueden
ser de 2 tipos: sólidos o líquidos.
Dentro de los sólidos tenemos: a) órganos: trozos de hígado, bazo, riñón, etc.
b) materia fecal
c) legrados: raspado de superficies mucosas.
Dentro del material líquido tenemos: a) orina
b) leche
c) exudados faríngeos, vaginales, etc
d) materias fecales líquidas
e) pus
Frotis de pus
Si el pus es muy espeso (cremoso) puede diluirse con suero fisiológico.
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Después procederemos a la realización del frotis igual que cuando hablamos de
extendidos partiendo de medios líquidos.
Frotis de hisopos estériles con exudado
El hisopo consiste básicamente en un pequeño trozo de algodón enrollado
fuertemente alrededor del extremos de una varilla de madera o pieza de alambre de
aproximadamente 15 cms. de longitud, los cuales son esterilizados y empaquetados
dentro de un tubo de ensayo o estuche cerrado.
En la actualidad se utilizan hisopos embebidos en suero que incrementan
enormemente la viabilidad de las bacterias en condiciones donde es fácil que se
retrase el envío de material.
Los hisopos son de mucha utilidad para recoger material procedente de:
-la piel, particularmente heridas, pústulas, abscesos y otras heridas infectadas.
-secreciones. Por ejemplo de la vulva o del prepucio.
-los oídos, ojos, cavidades nasales, faringe, boca, etc.
Los hisopos son económicos y es conveniente hacer 2 muestras de cada sitio para:
1) Hacer un frotis directo por desplazamiento sobre un portaobjetos;
2) Otro para el cultivo. Una vez obtenida la muestra el hisopo es colocado en
un tubo con caldo glucosado y lo incubamos durante media hora. A
continuación extraemos el hisopo y sembramos en placa de agar sangre
mediante un trazado en zig-zag sobre su superficie. Sembramos mediante el
asa una segunda placa de agar sangre con el caldo incubado. Llevamos
ambas placas a la estufa durante 24 hs y observamos las colonias.
Frotis de órganos.
Cuando hacemos frotis a partir de órganos, podemos recurrir a 2 técnicas diferentes:
frotis por aposición (de superficie de hígado) y frotis por impresión (corte de bazo).
NUNCA SE HACE FROTIS DE SUPERFICIE DE BAZO Y CORTE DE
HÍGADO.
El frotis por aposición es el frotis de la superficie de un órgano. Para el caso del
hígado se estudia la presencia de bacterias en su superficie: Cl. chauvoei, Cl.
septicum, etc. se levanta el hígado y se hace contactar con la lámina 4 o 5 veces,
obteniéndose una película delgada que se deja secar posteriormente para colorear.
El frotis por impresión es el frotis realizado con la superficie de corte de algún
órgano como ser riñón, bazo, etc. se corta el órgano y con la superficie de corte se
realizan 4 o 5 impresiones sobre la lámina, para luego dejar secar y posteriormente
colorear.
Frotis de orina
La muestra de orina para examen bacteriológico (cultivo, frotis, etc) debe obtenerse
en las condiciones mas asépticas posibles. Lo ideal es por cateterismo uretral,
recogiendo la porción media del chorro de orina así obtenido en un recipiente
estéril. El frotis se efectuará previa toma de orina con el asa, etc.
Frotis de materia fecal
La materia fecal se debe obtener evitando la contaminación excesiva, aunque
generalmente no es necesario emplear recipientes estériles.
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Se debe tener cuidado en la recogida y manipulación de las heces para evitar la
autoinfectación, ya directamente de las muestras o de áreas del laboratorio
contaminadas accidentalmente. Si la materia fecal es sólida procederemos a su
dilución con suero fisiológico (o agua destilada) y después procederemos como en
los casos ya vistos de frotis a partir de materiales líquidos.
Frotis de sangre.
El secreto de preparar un buen frotis de sangre responde a:
1) El empleo de láminas nuevas y limpias
2) Obtención de una película fina, tratando de que los eritrocitos queden
dispuestos formando monocapa.
3) Un secado rápido.
La sangre debe ser recogida en forma aséptica mediante una jeringa y una aguja
estériles, inyectándose 1-2 cc de sangre a través de un tapón de goma en un
frasquito cerrado que contiene 10 ml de caldo dextrosado al 0,1% y un
anticoagulante que contrarresta la propiedad bactericida natural de la sangre. Una
vez extraída la sangre el frotis debe hacerse lo más rápidamente posible, pudiendo
preparase sobre portaobjetos o cubreobjetos.
a) Método del portaobjetos. Se realiza con 2 portaobjetos. En uno de ellos
depositaremos la gota de sangre y el otro será usado para extenderla (extensor) y
hacer el frotis.
Técnica: 1.Tomamos un portaobjetos limpio y lo colocamos sobre el soporte o
sobre una superficie horizontal y depositamos sobre él una pequeñísima gota de
sangre (del tamaño de una cabeza de alfiler, previamente homogeneizada), cerca de
uno de los extremos de la lámina. La lámina debe tomarse por los extremos con la
yema de los dedos (pulgar por un lado e índice y mediano por el otro). Para pasar la
sangre contenida en el frasco al portaobjetos, utilizamos una pipeta capilar, un
palillo redondo o una varilla de vidrio. 2. Con el otro portaobjeto (extensor)
extenderemos la sangre. Este portaobjetos debe tener sus bordes perfectamente lisos
y sus ángulos deben estar truncados (cortados), de modo tal que el borde que obrará
como extensor sea menor que el ancho del portaobjetos en el que se extiende la
sangre. El portaobjetos extensor se apoya en la superficie del otro portaobjetos,
cerca de la gotita de sangre (con el ángulo obtuso cerca de la gotita de sangre), y
llevándolo hacia atrás se hace contactar con la gotita; ésta por capilaridad se
extiende por el borde del portaobjetos extensor y antes de que termine de llegar a
los bordes deslizaremos el portaobjetos suavemente hacia delante.
El ángulo en que sostiene el portaobjetos extensor determinará el grosor de la
película sanguínea; cuanto mayor es el ángulo, mas grueso será el frotis, y
viceversa. De ordinario conviene usar un ángulo de 30-40°.
Otro factor que interviene en el espesor del frotis es la velocidad con que se hace la
extensión; cuanto mas rápida la extensión más fino será el frotis y cuanto mas lenta
más grueso. 3. Inmediatamente de realizado el frotis debemos secarlo rápidamente.
Si el secado es lento al secarse primeramente el plasma sanguíneo y hacerse
hipertónico, los hematíes ceden agua y se produce el fenómeno de crenación,
quedando los eritrocitos arrugados como ruedas de reloj. Ver figura.
b) Método del cubreobjetos. 1) Sosteniendo por sus bordes un cubreobjetos con una
mano (entre índice y pulgar) colocamos una gota de sangre (1-2 mm de diámetro)
bien en su centro con ayuda de una varilla de vidrio. 2) dejamos caer suavemente
otro cubreobjetos sobre el primero, de forma tal que deben quedar cruzados (ver
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Figura 4). Si el cubreobjetos está limpio la sangre se extenderá por capilaridad
rápida y uniformemente entre ambas superficies.
3) Poco antes de que la sangre termine de extenderse, separamos los 2 cubreobjetos
en forma horizontal. 4) Agitar rápidamente los frotis para secarlos al aire.
Las características de un buen frotis sanguíneo son:



Ser uniforme, de aspecto liso y sin huecos. El frotis ondulado es producido
por movimientos irregulares al hacer la extensión; los huecos suelen
producirse por suciedad o grasa en la superficie del portaobjetos. Las estrías
longitudinales se forman cuando el borde del portaobjetos extensor está
mellado, o es del lado en que cortó el diamante el vidrio.
Debe tener bordes largos y rectos, situados a 2 mm. del borde del
portaobjetos.
Los eritrocitos deben estar situados en monocapa en la mayor parte del frotis
(frotis delgado). Los frotis demasiado gruesos son difíciles de examinar.
Cuidado del frotis:
1) De ser posible el frotis debe ser inmediatamente coloreado. De no ser así
hay que guardarlo en un sitio protegido y hacer la tinción pasadas las 24 hs
para obtener mejores resultados. Si es un frotis que remitiremos a
laboratorio convendrá fijarlo con alcohol metílico unos 5 minutos.
2) Los frotis efectuados en el campo, deben protegerse contra moscas, que
posándose sobre el frotis pueden ingerir eritrocitos y en pocos minutos dejar
llena de huecos la película de sangre.
3) Los frotis deben ser identificados. Este procedimiento se hace con lápiz de
grafo, escribiendo sobre la sangre (en la parte más gruesa del frotis),
conservándose ese número aun después de la coloración.
Frotis de leche.
Si la leche es normal el frotis sale bastante bien, pero frecuentemente la leche
patológica llega tan alterada al laboratorio microbiológico que se parece mas a un
suero-pus que a leche. Deberemos tomar ciertas precauciones, debido que al
quemarse la grasa que contiene crepita y pueden haber proyecciones que lleguen a
contaminarnos a nosotros y al laboratorio.
Se toma una gotita de leche con el asa, se hace el frotis, tratando siempre de que no
llegue a los bordes del portaobjetos, dejamos secar el asa a una distancia prudente
de la llama, para luego esterilizar al rojo, etc.
COLORACIONES Y COLORANTES
Generalidades
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Los procedimientos de coloración tienen una gran importancia en los trabajos de
laboratorio.
Fue Weigert (1875) el pionero en el uso de los colorantes para la visualización de
las bacterias.
Cuando se observa al microscopio una preparación: frotis, sin colorear, el ojo del
observador recoge imágenes de refracción, de mala calidad, salvo en los
microscopios de contraste de fase o interferencia en los cuales las imágenes que se
obtienen son buenas. Como los diversos elementos constitutivos de las células y
tejidos tienen índices de refracción muy semejantes, sería muy difícil o casi
imposible hacer un diagnóstico diferencial seguro, en preparados sin colorear, salvo
los ya mencionados.
Cuando se observa al microscopio una preparación coloreada, las imágenes que se
pueden obtener son de absorción, más fáciles de interpretar que en fresco, porque
tienen un índice de refracción diferente. Como los diferentes elementos celulares
tienen pocas imágenes contrastadas es fácil el empleo de colorantes.
Coloración: es el proceso en virtud del cual un cuerpo puesto en contacto con un
colorante, es coloreado, y ese color no es removido cuando se emplea el disolvente
presente en la solución colorante.
Color: es una sensación producida en los organismos que tienen receptores
sensibles cuando los rayos de luz visible tienen una longitud de onda situada entre
400-800 milimicras, llegando a la retina de un ojo normal.
Cuando la luz compuesta por todas esas longitudes de onda combinadas entre 400800 milimicras, incide sobre una sustancia que refleja prácticamente todas las
radiaciones, el ojo humano ve esa sustancia como blanca, excepto la luz que está
fuera del espectro, y que son la luz ultravioleta y el infrarrojo. Si la sustancia
absorbe todas las longitudes de onda se dice que la luz es negra. Si las longitudes de
onda de la luz absorbida por una sustancia caen fuera del campo visible (no se
reflejan ni se absorben) decimos que esa sustancia es incolora. Si un sólido incoloro
(sacarosa) o un líquido incoloro (vaselina) se dividen en una multitud de superficies
refractantes, la sustancia puede tomar un color blanco.
Colores complementarios
Una sustancia puede tener determinado color cuando absorbe una cierta longitud de
onda; si aparece verde absorberá al complementario: rojo.
LONGITUD DE ONDA
400
450
510
550
590
640
COLOR ABSORBIDO
Violeta
Azul
Verde
Amarillo
Anaranjado
rojo
COLOR OBSERVADO
Amarillo
anaranjado
Rojo
Violeta
Azul
verde
Colorante
Es una sustancia coloreada que puede comunicar su color a otras sustancias (cuando
es puesta en contacto con ellas), cuerpos, tejidos o células (bacterias o no),
pudiendo ser de procedencia animal o vegetal, naturales o artificiales, etc. de
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plantas (algodón, lino, etc); de animales (lana, cuero, etc); del hombre (pelo, piel,
tejidos, etc.). Todas ellas son Naturales. Los colorantes llamados anilinas se
obtienen de los hidrocarburos.
Teoría de Otto-Witt
En 1876 este investigador soviético trabajando en Alemania hizo pública su teoría
que en muchos conceptos tiene aun vigencia. Sostuvo que el color está
condicionado a ciertos radicales químicos a los que denominó cromóforos (del
griego: yo llevo), que eran productores del color en los compuestos orgánicos.
Generalmente son no saturados y aportan color a las moléculas de que forman parte.
Se pueden dividir en:
a) Cromóforos básicos (electropositvos): el grupo Azoico; los grupos Azina y
Azonium de las safraninas. Tienen Nitrógeno.
b) Cromóforos ácidos (electronegativos). Caracterizados por la presencia de
Oxígeno. Encierran grupos muy importantes: el grupo Nitro (N:O2) y el grupo
Cetónico (C: O), quinona, indofenoles, trifeniletanos, pironina, acridina,etc.
Cromógenos. Son sustancias que tienen cromóforos en sus moléculas. Estas
sustancias tienen por lo tanto bandas de absorción en el espectro visible ultravioleta.
Pueden tener uno o mas cromóforos y pueden ser incoloras; así por ej en el ácido
pícrico el cromógeno (trinitrobenceno con 3 cromóforos NO2) es incoloro; se
vuelve coloreado por la introducción del radical salificable OH auxocromo (del
griego yo aumento).
Auxocromos. Son agrupamientos no saturados que no son cromóforos pero, al ser
introducidos en la molécula de un cromógeno, modifica su espectro de absorción,
exaltando la coloración y/o confiriendo el poder tintorial.
Se pueden dividir en:
Auxocromos propiamente dichos: grupos Oxidrilo OH, Amino NH2, sulfhidrilo SH.
Tintóforos. Son auxocromos cuya introducción hace aparecer el poder tintorial sin
modificar el color. Grupos carboxilo COOH, Nitroso, radical ácido sulfhidrilo. Los
auxocromos salifican la molécula.
Naturaleza de las coloraciones.
Para que exista verdadera coloración es necesario que la sustancia colorante se fije
sobre el objeto a teñir, de forma tal que si se lava el preparado con el disolvente que
se utilizó para preparar el colorante, no atenúe la coloración, ni se decolore.
Para explicar la naturaleza de las coloraciones se han emitido numerosas teorías
químicas, físicas, fisicoquímicas, etc, sin lograr acuerdo general por lo que no se
entrará en discusión.
Clasificación de los colorantes
Desde el punto de vista químico dividimos a los colorantes en:

Simples (encierran uno o más cromóforos ácidos o básicos, pero siempre del mismo
tipo. Se dividen a su vez en: colorantes artificiales: derivados del carbón (anilinas y
compuestos de síntesis) y colorantes naturales: carmín, hematoxilina, etc
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
Compuestos. Son sales que se forman por la unión de un cromóforo ácido y otro
básico. Corresponden a los colorantes neutros. La eosina se combina con las bases
del citoplasma y el azul de metileno tiñe el núcleo al combinarse con los ácidos
nucleicos. Si el azul de metileno y la eosina se mezclan en solución acuosa se produce
un precipitado de eosinato de azul de metileno, insoluble en agua, pero soluble alcohol
metílico.
Desde el punto de vista histológico, Erlich los dividió en:

Nucleares básicos. Los colorantes básicos son sales cuya base coloreada es
alcalina y el ácido incoloro.
 Citoplasmáticos o ácidos. En los colorantes ácidos la base es incolora y el ácido
coloreado.
Colorantes indiferentes. Son insolubles en agua, pero solubles en algunos solventes
orgánicos. Generalmente no tienen grupos capaces de formar sales: colorantes de las
grasas como el Sudán III, escarlata R.
Desde el punto de vista de su origen pueden ser: NATURALES O ARTIFICIALES.
Clasificación de los métodos de coloración.
A. Coloraciones difusas. No tiene
empleo en microbiología. Se
emplean en la tinción de hilos o
telas. Son coloraciones en bloque.
B. Coloraciones electivas. Son las
únicas usadas que permiten realizar
la diferenciación óptica. Se llaman
específicas cuando en un tejido se
colorea solamente un elemento o
grupo
de
elementos
(fibras
elásticas, colágeno, etc). se llaman
citológicas cuando permiten poner
en evidencia elementos particulares
del núcleo o citoplasma.
C. Coloraciones directas. Cuando sin
ningún tipo de procedimiento extra
la solución colorante tiñe al tejido,
ya sea sumergiéndolo (baño), o
volcando el colorante sobre el
tejido. No hay pues ningún tipo de
artificio.
D. Coloraciones
indirectas.
Son
aquellas en las que es necesaria, la
acción de un mordiente, para llevar
a cabo la unión con colorante y
sustrato a teñir, o para aumentar la
afinidad entre el colorante y el
elemento a teñir. El mordiente
puede ser físico (calor) o químico
(fenol). Como vemos el calor actúa
a la vez como mordiente y fijador.
Como mordiente también actúa el
alcohol metílico y etílico. El
mordiente universal es el ácido
fénico.
E. Coloraciones
progresivas.
Se
utilizan
soluciones
colorantes
débiles, en las cuales se sumerge la
preparación a colorear, hasta que
se considere que tiene un óptimo de
coloración, momento en el que
retiramos del baño el colorante. En
la coloración de Giemsa se deja
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actuar al colorante por un lapso
variable (15-45 minutos), y una vez
transcurrido
ese
tiempo
se
interrumpe la coloración por un
lavado con agua.
F. Coloraciones
regresivas.
Se
sobrecolorea el material, haciendo
actuar luego un diferenciador. Se
utilizan a veces para poner en
evidencia un elemento del material
en estudio (bacilo de Koch). El
diferenciador puede ser el alcohol
etílico, mezclas de alcohol metílico
mas acetona, ácido clorhídrico,
ácido nítrico, solución de ácido
sulfúrico, etc. se hacen entones
actuar sobre el preparado para
diferenciarlo, esto es extraer el
colorante de ciertas partículas de la
célula
o
bacteria,
quedando
coloreadas en forma específica
ciertas estructuras; ej: coloración de
Gram.
G. Coloraciones simples. Se logran
con la acción de un solo colorante,
ya sea ácido o básico.
H. Coloraciones
combinadas.
Es
cuando actúa mas de una solución
colorante, pero siempre ácidas o
básicas en forma sucesiva o
simultánea.
I. Coloración panóptica. Es cuando se
usan colorantes neutros, lográndose
una coloración de todos los
elementos del frotis. Muy empleada
para sangre.
Solución pancrómica: es aquella solución en la que actúan todos los colorantes que se
necesitan. (Wright)
Mineral
Principios de los colorantes naturales
Óxido férrico rojo
óxido férrico amarillo
Azul de Prusia
Bermellón
Cromato de plomo amarillo
Vegetales
Animales
nitrosados
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Alizarina
Antocianinas
Carotenoides (caroteno)
Clorofila
Flavinas
Anilinas
Púrpura
Cochinilla
Puermes
Sepia
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UNIDAD 1 – LECTURA 1: Técnica de preparación de frotis. Coloraciones y Colorantes
nitrados
azoicos
oxazinas
tiazinas
indicoides
antraquinonas
acridinas
rosanilinas
ftaleínas
quinolinas
Principios de colorantes sintéticos
A continuación veremos una clasificación de los colorantes más comunes:
Naturales
Hematoxilina
tornasol
carmín
violeta de genciana
violeta de metilo
Azul de metileno
Fucsina básica
Rojo neutro
Pardo de Bismark
Tiomina
Básicos
Artificiales
ácido pícrico
fucsina ácida
eosina
amarillo victoria
Ácidos
Neutros
picrato azul de metileno
eosinato azul de metileno
Eosinato de Azue
Indiferentes
Sudán III
Rojo escarlata o escarlata red
TINCIONES SIMPLES
Cristal violeta fenicado
Composición: cristal violeta....................1 gramo
Ácido fénico......................2 gramos
Alcohol absoluto...............10 ml
Agua destilada.................100 ml
Se pesa la cantidad de polvo colorante usando 5-10 veces esta fórmula; se coloca en un
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mortero de vidrio y se le tritura con la mano del mortero hasta reducirlo a polvo.
Luego se agrega de a porciones alcohol. Se le añade ácido fénico previamente fundido al baño
maría (no debe estar oxidado y no debe tener ácido rosálico de color rojo). Se añade de a
porciones con una pipeta tomando cada vez 1 ml. Se agrega agua destilada a pequeñas
porciones. En una botella limpia y seca, y mediante un embudo, vertimos el colorante con los
demás constituyentes. Con el agua restante se lava el mortero, la mano y el embudo. Tapamos
y dejamos 24 hs para que sedimente. Luego filtramos (con papel de filtro plisado) sin agitar.
Está lista entonces para su uso. El cristal violeta es colocado encima del frotis, se deja actuar 1
minuto y luego se lava.
Azul de metileno fenicado.
Componentes: azul de metileno..................1,5-2grs
Ácido fénico........................2 grs. Actúa como mordiente
Alcohol absoluto.................10 ml
Agua destilada....................100 ml
Fucsina fenicada
Componentes: fucsina..................1gr
Ácido fénico..........5 grs
Alcohol absoluto...10 ml
Agua destilada.......100 ml. Se emplea al 1/10 para la coloración de bacterias
(Mycobacterium tuberculosis), o como coloración de contraste.
Solución colorante de Newman
Componentes: azul de metileno........................1,2 grs
Alcohol etílico (vehículo)...........54ml
Cloroformo (desengrasa).............40 ml
Ácido acético glacial (fijador)......6 ml
El alcohol etílico actúa como vehículo del colorante. Esta es una coloración especial para leche
, porque desengrasa (por el cloroformo), fija (por el ácido acético glacial) y colorea en un solo
tiempo.
Se introduce el portaobjetos en una caja de Coplin (con la cara del frotis próxima a una de las
paredes) y se le agrega la solución colorante preparada hasta cubrir el preparado. Se deja
actuar 5 minutos y a continuación se lava con agua lentamente y se seca al aire. Una vez seco
está en condiciones de observarse al microscopio.
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