enraizamiento in vitro en presencia de kanamicina como

ENRAIZAMIENTO IN VITRO EN PRESENCIA DEL ANTIBIÓTICO KANAMICINA
COMO MÉTODO DE SELECCIÓN EFICIENTE EN LA TRANSFORMACIÓN
GENÉTICA DE GIRASOL.
Radonic L., Zimmermann J., Zavallo D., López N., López Bilbao M.
Instituto de Biotecnología, INTA-Castelar, De los Reseros y Las Cabañas s/n
(1712) Castelar. E-mail: [email protected]
Como parte del proceso de la transformación genética de los vegetales es
necesario incorporar un gen que otorgue una ventaja selectiva a aquellas células
que han sido transformadas frente a las que no lo han sido. En la transformación
de girasol, a pesar de las publicaciones existentes (Hewezi et al., 2002), no existe
hasta el momento un protocolo de transformación eficiente y reproducible, y en
parte se debe a que presentan un alto número de escapes, demostrando que el
método de selección no es efectivo. El objetivo de este trabajo es establecer el
uso del antibiótico kanamicina como agente selectivo, buscando relacionar la
presencia del transgén con un comportamiento diferencial in vitro.
Se transformaron tejidos meristemáticos de semillas en germinación del genotipo
HA89 utilizando la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens. Se utilizó como
vector de transformación un plásmido conteniendo GUS-intrón bajo el promotor
CaMV35S y el gen de resistencia a kanamicina nptII bajo el promotor nos
(Vancanneyt et al., 1990). Se utilizó el protocolo de transformación desarrollado en
el Instituto de Biotecnología. La selección se realizó a partir del tercer medio de
regeneración (Re3) utilizando 50mg/l de kanamicina. La expresión del gen
indicador se evidenció mediante ensayos de tinción histoquímica (Jefferson et al.,
1987) y la presencia del transgén se analizó mediante la amplificación de un
fragmento del gen GUS-intrón por PCR. Para analizar la respuesta in vitro de los
cultivos frente al antibiótico se compararon 4 situaciones: Controles no
agroinfectados (C), Controles tratados con kanamicina (C-Km), Agroinfectados (A)
y Agroinfectados con Km (A-Km). Los parámetros analizados para determinar si
existían respuestas diferenciales fueron: color/aspecto y altura de las plántulas,
formación de botón floral y de raíces in vitro. No se observaron diferencias
estadísticamente significativas (test 2-Chi cuadrado) entre las 4 situaciones para
ninguno de los parámetros estudiados. En el caso de la formación de raíz in vitro
se observó que este fenómeno fue fuertemente afectado por la presencia del
antibiótico ya que ningún C-Km fue capaz de enraizar in vitro mientras que 2
plántulas A-Km enraizaron. Estas 2 plántulas fueron transferidas al invernáculo y
se obtuvo descendencia de una de ellas (6 semillas) posibilitando el análisis de la
T1. Para el análisis molecular se extrajo ADN de: a) plántulas enteras obtenidas in
vitro, b) hojas de las plántulas A-Km que enraizaron in vitro y c) hojas de las 6
plantas correspondientes a la T1 crecidas en invernáculo ( a y b corresponden a
quimeras T0). La relación entre los resultados obtenidos en el análisis molecular y
la respuesta observada in vitro se logró cruzando los resultados para las plántulas
A-Km en su respuesta durante el cultivo de tejidos para los 4 parámetros
analizados con los datos de presencia o ausencia del transgén evaluada por PCR.
El análisis estadístico ( 2 ) muestra que no existe relación entre la presencia del
transgén con el color/aspecto y la altura de los brotes o la aparición de botón floral
ya que hay plántulas tanto positivas como negativas en idénticas proporciones
para cada carácter estudiado. En lo que se refiere a la formación de raíces in vitro,
al ser sólo 2 las plántulas que enraizaron en presencia de Km no se observa una
diferencia significativa pero cabe destacar que ambas tuvieron un resultado
positivo, así como que ninguna de las C-Km fue capaz de enraizar. En el análisis
de la T1 se obtuvieron resultados positivos para las 6 plantas mediante las
técnicas de PCR, tinción histoquímica de GUS y RT PCR. La eficiencia de
transformación con este método de selección fue del 0,7%. Todas las
publicaciones existentes en transformación de girasol realizan la selección en Km
teniendo en cuenta sólo el color/aspecto de las plántulas, sin embargo estos
trabajos presentan niveles de escapes elevados (10-79%). El enraizamiento en
Km no se utilizó en ninguna de las publicaciones como método selectivo. Las
conclusiones obtenidas de este trabajo son: i- La selección por formación de
raíces en presencia de kanamicina sería un método exitoso ya que no se
obtuvieron escapes y la eficiencia de transformación con este método selectivo fue
el 0,7% y ii- La coloración de los explantos no debería ser tomada como criterio de
selección ante el antibiótico Km.
Bibliografía
Hewezi T et al (2002) Plant Mol Biol Rep 20:335-345
Jefferson RA, et al. (1987) EMBO J. 6: 3901-3907.
Vancanneyt G, et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220: 245-250.