Manual de Fitoquimica Marina
Anuncio
Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Marinas Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Dr. Enrique Hernández Garibay Responsable de la elaboración del manual de Fitoquímica Marina. [Avalado, Validado] el [fecha] por Consejo Técnico Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Ciencias Marinas Directorio Dr. Felipe Cuamea Velázquez Rector UABC Dr. Oscar Roberto López Bonilla Vicerrector, UABC Campus Ensenada Dr. Juan Guillermo Vaca Rodríguez Director FCM Dr. Victor Antonio Zavala Hamz Subdirector, FCM Índice Índice ..................................................................................................................................................................................................... iii Introducción ........................................................................................................................................................................................ 1 Encuadre del Sistema de Prácticas ............................................................................................................................................. 3 Competencias a las que contribuye ........................................................................................................................................... 4 Ubicación dentro del mapa curricular ...................................................................................................................................... 5 Programa de Prácticas..................................................................................................................................................................... 6 Propósito General de las Prácticas de Fitoquímica ............................................................................................................. 8 Práctica 1: Análisis proximal de Algas Marinas.................................................................................................................... 12 Práctica 2. PIGMENTOS ALGALES ...............................................................................................................................................27 POLISACARIDOS ALGALES ....................................................................................................................................................................................................................34 Práctica 3: Extracción de Agar......................................................................................................................................36 Práctica 4: Extracción de Carragenanos.....................................................................................................................43 Práctica 5: Extracción de ALGINATOS........................................................................................................................................49 Práctica 6: Reología é histéresis de los geles de agar y carragenano....................................................................56 PRÁCTICA 7. ESTIMACIÓN DE LA 3,6 ANHIDROGALACTOSA EN AGAR Y CARRAGENANO.....................63 Práctica 8: Viscosidad de los alginatos, propiedades gelificantes y la Influencia de la concentración y el efecto de contra-ion.....................................................................................................................................................69 Práctica 9: Aglutinación de células sanguíneas por Lecitinas y Polifenoles de algas marinas.....................78 Práctica 10: Aplicaciones..............................................................................................................................................82 RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO....................................................84 COMPORTAMIENTO EN EL LABORATORIO...........................................................................................................84 Normas Generales de Seguridad e Higiene................................................................................................................85 Medidas Generales en Caso de Accidente.................................................................................................................................87 Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Introducción Página 1 Este manual está diseñado para estudiantes de Ciencias Naturales. Está destinado a servir de complemento a la materia de Fitoquímica Marina de la carrera de Oceanología de la Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad Autónoma de Baja California, pero podrá, mediante adaptaciones y modificaciones leves, ser usado en cualquier carrera afín. INTRODUCCIÓN Las algas marinas se encuentran en todas la costas del mundo, además de su papel como nicho ecológico y aporte de alimento para diferentes organismos, también representan, un recurso natural de suma importancia en la economía de las poblaciones costeras. El éxito de las aplicaciones de los vegetales marinos y de sus compuestos derivados, en diferentes aspectos de la vida diaria, se debe a la investigación sistemática de este recurso y a la aplicación de sus resultados. La Fitoquímica Marina es una ciencia que incorpora varias disciplinas con la finalidad de aportar nuevos conocimientos y aplicaciones de los constituyentes bioquímicos de los vegetales marinos. Las algas marinas, son productores primarios; la energía solar es atrapada por el sistema pigmentario para realizar la fotosíntesis; es un grupo de plantas muy heterogéneo y en función de sus características de pigmentación, se agrupan en varias divisiones; siendo estas, las algas verdes o clorofitas, algas rojas o rodofitas y algas cafés o faeofitas. La utilización de las algas marinas se remonta hasta tiempos muy antiguos (600-800 AC) y sus usos han variado con el tiempo y la localización geográfica. Tradicionalmente las algas han tenido diferentes aplicaciones, desde aquellas en que se usa en forma directa, como alimento humano, forrajes, abono, etc., hasta aplicaciones en las que se requiere cierto tipo de procesamiento, por ejemplo, la combustión directa fue usada para la obtención de iodo, potasio y sodio; por pirólisis, se obtienen solventes, carbón activo etc., por fermentación se logra la obtención de ácidos orgánicos, solventes, gas etc. Una extracción empleando solventes orgánicos, logra la separación de compuestos lipofílicos, como esteroides y otros compuestos orgánicos importantes, mientras que por extracción acuosa, se logra la obtención de los ficocoloides tales como el agar, Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Introducción Página 2 carragenanos y alginato, compuestos que por sus características fisicoquímicas únicas de viscosidad y gelificación, desde su descubrimiento han alcanzado una aceptación cada vez mayor, siendo en la actualidad compuestos indispensables en la vida diaria. A nivel mundial pueden distinguirse 2 patrones de utilización principales; primeramente en el oriente incluyendo países como China, Japón y Corea, el aprovechamiento de las algas está orientada principalmente a la alimentación humana (Indergaard, et.al. 1991), donde los recursos para este propósito provienen tanto de praderas naturales como de cultivo. Por otra parte en los países de occidente y Europa oriental las algas se emplean preferentemente como fuente de coloides, forrajes y fertilizantes (Jensen, 1993). Es importante mencionar que además de las aplicaciones anteriores, las algas son fuente de una amplia diversidad de metabolitos secundarios, tales como, polisacáridos, proteínas, lípidos, ácidos nucléicos, todos ellos importantes para las funciones algales (Kloareg y Quatrano, 1988; Lobban y Harrison, 1994); muchos de los cuales además, pueden presentar actividad biológica (compuestos bioactivos), por ello han ido ganando terreno en nuevas aplicaciones en agricultura, medicina, Biotecnología e Ingeniería Genética entre otras. El contenido de este manual, va dirigido principalmente a los alumnos del Curso de Fitoquímica Marina, que se imparte en el séptimo semestre dentro del paquete de Química marina, en la carrera de Oceanología de la Facultad de Ciencias Marinas de la UABC. La secuencia de las prácticas descritas en el manual, están en función del orden que siguen los temas en el programa teórico, esto con la finalidad de comprender y reafirmar los conocimientos mediante su aplicación. Este manual, incluye ejercicios relacionados con aspectos nutricionales de los vegetales marinos, ficocoloides y compuestos con actividad biológica, métodos de análisis, obtención y evaluación de sus propiedades fisicoquímicas. Espero que este manual sea también de utilidad para los alumnos de licenciaturas de otras carreras, investigadores, ficólogos, y en general a todas aquellas personas interesadas en el estudio de los vegetales marinos. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Encuadre del Sistema de Prácticas Página 3 Encuadre del Sistema de Prácticas Introducción El Manual de Laboratorio de Fitoquímica Marina que presentamos no es más que un ensayo al que seguramente le faltará mucha madurez. Confiamos que a lo largo del tiempo siga recogiendo más y más experiencias y que nunca nos deje absolutamente conformes. Pretendemos terminar con la enseñanza magistral y los Libros Sagrados. Creemos firmemente que todo es cuestionable. Todo se debe cuestionar para desarrollar en los estudiantes un espíritu crítico que les permita manejara ideas más que acumular conocimientos, aunque las ideas que no están fundamentadas en conocimientos de nada sirven. Las ideas, críticas y conocimientos nacerán del trabajo en equipo. Los estudiantes compartirán libros, material de laboratorio y especímenes. La viabilidad de este esquema de trabajo supone la aceptación de responsabilidades y el cumplimiento estricto de las mismas. Por ello, en la presentación del curso, se ponen en claro las actividades de los estudiantes y de los profesores. En resumidas palabras, quisiéramos que el estudiante descubra, de acuerdo a sus propias capacidades, lo que tradicionalmente se le ha entregado como la verdad absoluta. Es decir, quisiéramos enseñar a aprender. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Encuadre del Sistema de Prácticas Página 4 Competencias a las que contribuye Niveles de Desempeño El conjunto de prácticas del presente manual te permitirá llegar a un desempeño de nivel 4 de acuerdo la clasificación de CONOCER, a saber “Nivel 4.- Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos para conciliar intereses. Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo”. Las razones por las que asumimos que obtendrás un nivel de desempeño tan alto son: 1. La realización de las prácticas en forma y tiempo, presupone el dominio de diferentes habilidades y conocimientos. 2. La elaboración de un protocolo y un informe por práctica requiere de disciplina y laboriosidad, así como la utilización de herramientas computacionales. 3. El trabajo en el laboratorio podrá ser realizado tanto en lo individual así como en equipo, lo que requiere de la participación armónica de los participantes. La capacidad de liderazgo deberá ser usada en forma óptima para realizar los diversos pasos de la práctica. El reporte de la práctica se entregará de manera individual. Conocer la composición de las algas marinas y como varía de una división a otra, así como por efecto de los parámetros ambientales, es una herramienta que ayudará a entender las relaciones de las algas marinas con el medio ambiente en que se desarrollan, para de esta manera estar en posibilidades de proponer alternativas de aprovechamiento integral de éstos recursos marinos en un contexto de sustentabilidad. Los usos de las algas marinas abarcan diferentes maneras de aplicación, desde usos directos hasta la aplicación de productos obtenidos de las algas con un uso particular. Las algas marinas son una fuente importante de minerales, así como de diversas biomoléculas tales como, ácidos grasos, proteínas, aminoácidos y carbohidratos, entre otros, algunas de los cuales pueden provocar cierta bioactividad en otros organismos; es por ello importante identificar en las diferentes especies de macroalgas de la región su contenido y características químicas que coadyuven a su óptimo aprovechamiento. Durante el desarrollo del curso, el alumno aprenderá a obtener diferentes productos de las algas marinas y evaluará sus características principales; podrá extrapolar los resultados obtenidos para comprender su relación con el ambiente y otros organismos, su importancia ecológica, médica y/o económica, con una actitud responsable basada en la ética y el respeto por el medio ambiente. . Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Encuadre del Sistema de Prácticas Página 5 Ubicación dentro del mapa curricular Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Encuadre del Sistema de Prácticas Página 6 Programa del Sistema de Prácticas Tema Práctica o prácticas programadas Ninguna 1. INTRODUCCIÓN Práctica 1: Análisis Proximal Parte 1 Ámbito de desarroll o Repaso de elaboració n de un reporte científico Laboratorio Duración * Semana 1: 3 horas Semana 2: 3 horas VEGETALES MARINOS Y Práctica 1b: Análisis Proximal Parte 2 Laboratorio Semana 3: SU CALIDAD 3 horas NUTRICIONAL Práctica 2: Determinación de Pigmentos Laboratorio Semana 4: en Algas Marinas. 3 horas Práctica 3: Extracción de Agar. Laboratorio Semana 5: 3 horas 2. POLISACARIDOS Práctica 4: Extracción de Carragenanos. Laboratorio Semana 6: ALGALES 3 horas Práctica 5: Extracción de Alginatos. Laboratorio Semana 7: 3 horas Práctica 6: Cuantificación de Laboratorio Semana 8: carbohidratos totales y anhidro 3 horas galactosa en agar y carragenanos 3. EVALUACÍON DE Práctica 7: Evaluación de Propiedades Laboratorio Semana 9: CARACTERÍSTICAS Reológicas de Agar y Carragenanos. 3 horas DE CALIDAD Práctica 8: Evaluación de Propiedades Laboratorio Semana Reológicas de Alginatos. 10: 3 horas Práctica 9: Aglutinación de células Laboratorio Semana sanguíneas por Lecitinas y Polifenoles 11: 3 de algas marinas horas 4. APLICACIONES Práctica 10: Aplicaciones de algas Laboratorio Semana marinas y productos derivados. 12: 3 horas * Duración en horas para cada práctica, y semana del semestre en la que se realizará. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Contenido de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Dr. Enrique Hernández Garibay Responsable de la elaboración del manual de Fitoquímica Marina Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Página 8 Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad Autónoma de Baja California Responsable(s): Dr. Enrique Hernández Garibay Número de alumnos por práctica: 6 Propósito General de las Prácticas de Fitoquímica Conocer los diferentes componentes de las algas marinas y correlacionar el contenido y características de estos con el tipo de macroalga del que se obtiene y su correlación con el medio ambiente en que crecen; ya que estas características son producto de la historia de vida de las algas marinas, debido a que su composición es producto del efecto de los factores que afectan el medio ambiente en que se desarrollan. Los componentes de las algas marinas en general tienen muchas aplicaciones por sus características únicas, son materia prima para muchas industrias a nivel mundial, en México al contar con estos recursos en abundancia nos corresponde conocer su composición química, ya que es la base para su aprovechamiento óptimo. Formato para la Elaboración de Reportes de Laboratorio y de Salidas de Campo de Fitoquímica Marina. Especificaciones Durante el desarrollo del curso, se elaborarán reportes en diferentes formatos, el primero de ellos debido a que cada estudiante analizará una macroalga diferente, el reporte que se genere, deberá ajustarse al formato de una publicación, con el propósito de crear un catálogo de especies de la región. En general el reporte debe ajustarse a las siguientes especificaciones: Escrito en computadora, con letra de 12 puntos, espacio sencillo. Carátula: nombre de la universidad, facultad, carrera, materia, número y título de la práctica o salida. Nombre completo del estudiante, nombre completo de los profesores y fecha de entrega. Introducción (15 puntos) Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Página 9 Comenzar con una exposición del tema a tratar que ayude al lector a ubicarse dentro del tema de interés (no más de una página). Debe indicarse el propósito u objetivos de la práctica o salida. Gran parte de la información de esta sección es obtenida de trabajos de otros autores, por lo tanto se deben citar al final del párrafo correspondiente. El trabajo de un autor se cita: (Jones, 2001). El de dos autores: (Jones y Hanes, 2004). El de más de dos autores: (Grids, et al., 1999). Muchos autores latinos prefieren utilizar sus dos apellidos, si este es el caso se cita: (Álvarez-Borrego, 1985). No se deberá extraer información del manual de laboratorio. Metodología (15 puntos) Si procede, debe describirse el área de estudio. Incluir un mapa de la misma. Deben describirse los procedimientos seguidos, con detalle suficiente para que el lector pueda reproducirlos. Se puede incluir una lista de los ejemplares de macroalgas, materiales, reactivos y equipos utilizados. En el caso de los equipos se debe incluir la marca y modelo; los datos deben ser suficientes para poder repetir el experimento en condiciones similares. Resultados y Discusión (40 puntos) En este apartado se deben incluir tablas de resultados o gráficas y una breve descripción de estos. Las tablas, gráficas y figuras deben ser numeradas progresivamente en cada caso. Las tablas van numeradas con números romanos y una leyenda como encabezado que describa su contenido general. Las gráficas, figuras e imágenes se enumeran con números arábigos y un pie de figura o leyenda al calce que describa su contenido general. Las leyendas de tablas y figuras deberán escribirse a renglón seguido. Se deberán citar los autores o fuentes (internet) de las imágenes, dibujos, tablas, gráficas o figuras que se incluyan. Es importante acompañar la figura con una descripción clara y concisa de lo que estamos observando (análisis de los resultados), y siguiendo una secuencia coherente y uniforme. Los nuevos hallazgos deben ser relacionados con resultados previos publicados por otros autores (citar). Conclusiones (20 puntos) Enumeración de los aspectos más relevantes de la práctica. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Página 10 Evaluación del alcance la práctica (revisar objetivos). Literatura citada (10 puntos) Presentarse en orden alfabético. Incluir únicamente las Referencias para consulta citadas en las secciones previas. Un trabajo de más de dos autores se cita en el texto como (Lara-Lara et al., 1980), pero en esta sección se tienen que escribir siguiendo los siguientes lineamientos. Artículos científicos Autor(es). Año de la publicación. Título completo de la publicación (en el idioma en que fue publicado). Nombre de la revista en que fue publicado (abreviado adecuadamente). Volumen (únicamente el número). Número de la revista (entre paréntesis y únicamente si la revista lo indica): páginas del artículo. Ejemplo: Lara-Lara, J.R., S. Álvarez-Borrego y L.F. Small. 1980. Variability and tidal exchange of ecological properties in a coastal lagoon. Estuar. Coastal Mar. Sci. 2(1): 613637 p. Autores de libros Autor(es). Año en que fue publicado el libro. Título completo del libro (en el idioma en que fue publicado). Nombre de la editorial. Número de edición. Ciudad en que se encuentra la editorial (cuando se encuentra en varias, incluir únicamente la primera). Número total de páginas del libro. Ejemplo: Blakeslee, T.R. 1975. Digital design with standard MSI and LSI. John Wiley and Sons, Inc. Primera edición. New York. 357 pp. Autor de capítulo de un libro editado por otra persona: Autor(es) del capítulo. Año en que fue publicado el libro. Título completo del capítulo. En: nombre(s) del editor(es) (ed.). Título completo del libro (en el idioma en que fue publicado). Nombre de la editorial, ciudad en que se encuentra la editorial (cuando se encuentra en varias, incluir únicamente la primera), páginas del capítulo. Ejemplo: Hammann, M.G. 1991. Spawning habitat and egg larval transport, and their importance to recruitment of pacific sardine, Sardinops sagax caeruleus, in the Gulf of Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Página 11 California. En: T. Kawasaka, S. Tanak, Y. Toba y A. Taniguchi (eds.). Longterm variability of pelagic fish populations and their environment. Pergamon Press, New York, 110-118 p. Handbook of Marine Macroalgae: Biotechnology and Applied Phycology editado por Se-Kwon Kim Internet: Escribir toda la liga e incluir la fecha de consulta. Ejemplo: taxonomicon.taxonomy.nl/ consultado el 27 de enero de 2010. Ortografía: Se restará un punto por cada 10 errores ortográficos encontrados en el reporte. Se restarán los 10 puntos de la sección de ortografía si se encuentran errores ortográficos básicos como: Autónoma, zoología, también, práctica, nombres propios sin la primer letra en mayúscula, nombres científicos no en cursiva, negritas o subrayados, etc. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 12 Práctica 1: Análisis proximal de Algas Marinas Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 13 1.1. Introducción El propósito principal de un análisis proximal es determinar, en un alimento, el contenido de humedad, grasa, proteína y cenizas. Estos procedimientos químicos revelan también el valor nutritivo de un producto y como puede ser combinado de la mejor forma con otras materias primas para alcanzar el nivel deseado de los distintos componentes de una dieta. Es también un excelente procedimiento para realizar control de calidad y determinar si los productos terminados alcanzan los estándares establecidos por los productores y consumidores. La caracterización química de las algas marinas, permite ubicarlas dentro de la amplia variedad de usos que actualmente tiene este recurso marino. Aplicaciones tales como fertilizantes agrícolas, complementos alimenticios y alimento humano (como vegetal), forrajes, materia prima para la extracción de ficocoloides y fuente de compuestos biológicamente activos. El análisis de macroconstituyentes bioquímicos (aquellos cuya proporción es mayor al 1%) implica la estimación en base seca (*) de: lípidos, minerales, proteínas fibra cruda y carbohidratos. Carbohidratos.- Es uno de los componentes que se encuentra en mayor proporción en las macroalgas, representa alrededor del 50% de su peso seco. Los carbohidratos en las algas marinas, cumplen un papel fisiológico como carbohidratos de reserva energética y estructurales (Kloareg & Quatrano, 1988, en Darcy-Vrillon, 1990). Entre las diferentes divisiones de macroalgas hay diferencias en cuanto al tipo de carbohidratos presentes; en particular los carbohidratos de reserva se constituyen por azúcares libres (glucosa el principal) y estructuras polisacáridas formadas principalmente por glucanos (polímeros de glucosa), donde para algas verdes encontramos al almidón, en algas rojas almidón florideano y en algas pardas el laminarán. Respecto a los carbohidratos estructurales, estos son de dos tipos, los fibrosos (insolubles) y los viscosos (solubles); el primer grupo representa cerca del 10 % del peso seco del alga y es el componente que se conoce como fibra cruda, está formado por polisacáridos tales como la celulosa (polímero de glucosa) y la hemicelulosa, esta última fracción es muy heterogénea y en algas verdes y rojas está representada por xilanos y mananos, mientras que el algas pardas está constituída por el ácido gulurónico (Painter, 1983, Lobban y Harrison, 1994). Por otra parte, los polisacáridos viscosos, son de alto peso molecular y se caracterizan por su alto peso molecular y alta solubilidad en agua debido a la presencia de grupos iónicos tales como Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 14 grupos hemiester sulfato (OSO3-) y grupos carboxilo (COO-); entre los polisacáridos viscosos se encuentran los poliscáridos de importancia comercial de las algas marinas, como agares y carragenanos en algas rojas, alginatos, fucanos en algas pardas y ulvanos en algas verdes (Painter 1983; Lahaye, 1985). La forma tradicional en que se cuantifican los carbohidratos es por la diferencia del 100% de la suma del resto de componentes (Humedad + cenizas + proteínas + lípidos). Otra manera es mediante el empleo de técnicas espectrofotométricas específicas para el tipo de carbohidratos presente, o bien gravimétricamente; sin embargo estas técnicas pueden ser aplicadas después de una separación de otros materiales presentes. Fibra Cruda.- Esta fracción corresponde a la fracción fibrosa de los carbohidratos estructurales (celulosa y hemcelulosa). No hay una definición precisa para este componente, sin embargo se define como el material orgánico remanente después de una hidrólisis ácida, seguida de una hidrólisis alcalina, se resta el contenido de minerales después de calcinar a 450 C. Se considera que los principales componentes que forman la Fibra Cruda, insoluble, son polisacáridos estructurales como la celulosa, xilanos y manannos (Lahaye et al., 1991 en Darcy-Vrillon 1993). Por otra parte La presencia de Fibra en un alimento favorece la absorción y transito de nutrimentos por el tracto digestivo. El contenido de fibra en macroalgas es superior al de los vegetales terrestres. Cenizas.- Las algas son una rica fuente de minerales, el componente de cenizas es la fracción inorgánica de las algas y está formada por sales inorgánicas, donde se pueden encontrar todos los minerales presentes en el agua de mar. El contenido de cenizas en macroalgas, es generalmente alto, va desde un 10 hasta un 50% de su peso seco (Jensen, 1993), su principal función biológica es la de crear un balance de cargas en los procesos de osmoregulación. Para su estimación se pesan las cenizas remanentes después de calcinar la materia orgánica a temperaturas de 450 a 550 C. Proteínas.- Representan de un 5 a un 15% en algas pardas y de un 10 a un 30% en algas verdes y rojas (Darcy-Vrillon 1990). Los porcentajes de proteínas en algas marinas son similares al de los vegetales terrestres (alrededor de un 20% del peso seco: Dupin et al. 1992 en Darcy-Vrillon 1993). Sin embargo, su calidad y digestibilidad no son similares, en la mayoría de las veces es inferior. Tradicionalmente, la cuantificación de proteínas se lleva a cabo mediante el análisis de nitrógeno con el método Kjedahl. Que se basa en digerir el material biológico (tejido) en presencia de ácido sulfúrico concentrado y catalizadores, con esto, se hidroliza la materia orgánica y el nitrógeno que contiene la muestra queda atrapado en forma de sulfato de amonio. Después, la sal de amonio formada, se descompone por una solución alcalina Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 15 fuerte que libera amoniaco, este es arrastrado por una corriente de vapor que se recibe en una solución saturada de ácido bórico, el amoniaco atrapa protones del ácido bórico y forma boratos en cantidad estequiométrica equivalente al nitrógeno presente; para conocer la cantidad de nitrógeno, esta solución se titula con HCL valorado (titulación por reversión). 1) Digestión, (*N*)+H2SO4 CO2+H2O+NH3--->2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 2). Destilación (NH4)2SO4+2NaOH Na2SO4+2NH3+3H2O 3NH3+ H3BO3 (NH4)3BO3 3). Titulación; (NH4)3BO3 + 3HCL *H3BO3 + 3nH4Cl * Cambio de color Se considera que al multiplicar el contenido total nitrógeno por un factor; 6.25, el resultado equivale al contenido de proteínas. Se acepta este método para evaluar proteínas en macroalgas, por ser un método estándar de determinación de proteínas en materiales biológicos, pero también se discute que la presencia de nitrógeno no proteico almacenado en las células algales produce variaciones y sobreestimaciones de proteínas (Haug & Jensen, 1954; Indergaard & Knutsen, 1990). Lípidos.- La fracción lipídica en macroalgas representa, en peso seco, de un 1 a un 5% (Jensen, 1993) y está formada por una mezcla de diferentes compuestos como; aceites, pigmentos, vitaminas liposolubles, esteroles y otros componentes no-polares. Los lípidos son solubles en solventes no-polares como el éter y/o Cloroformo. Ha sido demostrado que los esteroles de algunas algas pardas reducen el nivel de colesterol en plasma sanguíneo (actividad hipocolesterolémica). 1.1.1. Objetivo general Mediante un análisis proximal, evaluar el contenido de los Macroconstituyentes (MC) en algas marinas. 1.1.1. 1 Objetivos didácticos El alumno, aprenderá los fundamentos químicos de los procesos de cuantificación de cada Componente bioquímico y será capaz de evaluar las ventajas y limitaciones de cada método, de acuerdo a la naturaleza de la muestra a analizar. Evaluará, de acuerdo al contenido porcentual de los MC, sus aplicaciones. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 16 El alumno será capaz de estimar los MC bioquímicos de cualquier material biológico. 1.2. Materiales, Reactivos y equipo 1ª Sesión; Minerales, Proteína (digestión), Grasas, Fibra Materiales Reactivos 3 Cápsulas de porcelana K2SO4 Sólido 3 Crisoles de porcelana CuSO4.5H2O Sólido 0.12gr 1 Espátula H2SO4 Concentrado 15 mL 1 Probeta de 250 ml Cloroformo: Metanol (2:1) 450 mL 1 Pinzas para crisol 2 Vasos de pp de 100 ml 5 Matraces vol. de 25 ml 1 Soporte universal 1 Pinzas para bureta 1 Embudo pequeño para los matraces vol. de 25ml 3 Matraces bola de 250 ml Cantidad 6.0gr H2SO4 1.5% mL 450 NaOH 2.5 mL 300 Etanol (técnico) mL 50 Asbesto Jabón 3 gr 3 Cuadritos de Parafilm (2 cm2) 3 Refrigerantes Sencillos 1 Matraz kitazato de 500 ml Equipo 3 Crisoles gooch 1 Digestor Microkjedahl 1 camisa de Gooch 1 destilador Microkjeldahl 1 Piceta con etanol 1 Plancha de calentamiento y agitación 12 Perlas de ebullición 5 Piezas de papel filtro 12.5 cm W#1 Dr. Enrique Hernández Garibay Balanza. Estufa de convección Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 17 Mufla Bomba de vacío Baño María a T cte. 2ª. Sesión. 6 Matraces Erlen-meyer de 50 ml H3BO3 4% 250 mL 1 Bureta de 10 ml NaOH 40% 50 mL HCL 0.01N 50 mL 1 Espátula 1 Piceta Indicador Shiro-Tashiro Destilador Microkjedhal 1 Magneto 1 Pipeta de 2 ml Agitador magnético Balanza 1 Pipeta de 5 ml 1 Pipeta vol. 10 ml 1 Pipeta de 10 ml 2 Cepillos 10 Cuadritos de Parafilm (2 cm2) 2 Goteros Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 18 1.3 Métodos Colecta Registra, la especie colectada para análisis, anotar la localidad y época de colecta. Preserve por herborizado un individuo o segmento representativo de las muestras colectadas. Transporte las muestras, seca, a un tamaño de partícula ≥ 2mm, Almacenar la muestra en frasco cerrado y etiquetado. Muestreo Independientemente del análisis a ser realizado, la primera etapa en cualquier análisis es siempre el muestreo. Los resultados del análisis no serán mejores que la calidad de la muestra tomada. Un buen análisis en una mala muestra carece de utilidad. Molienda - muestreo del producto La molienda, tiene el propósito de homogenizar la muestra y con ello facilitar la toma de porciones para el análisis. El producto a ser muestreado debe estar muy bien mezclado y molido previamente al muestreo. El muestreo consiste en tomar varias cantidades pequeñas del producto desde diferentes lugares del recipiente que contiene el alimento. Posteriormente, se realiza un mezclado intenso de modo de obtener una muestra homogénea y representativa de la muestra original recibida para el análisis. Molienda - mezclado La muestra homogénea es mezclada y molida varias veces para asegurar que una muestra de ensayo tomada en esta etapa será una muestra representativa del producto. Usualmente, una muestra de 10 gramos se toma de esta muestra homogeneizada y sobre esta cantidad se realiza el análisis Humedad Pese 2 gr de muestra (p1) sobre una cápsula de porcelana, previamente tarada. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 19 Introduzca la cápsula en la estufa de convección a una temperatura de 100110°C y manténgala, al menos, durante 4 horas*. Coloque la cápsula en el desecador con drierita, hasta que alcance la temperatura ambiente y pese. Cuantifique él % de humedad por diferencia de pesos: (P1 – P2) % Humedad = ___________ gr muestra x 100 *Se puede emplear temperatura de 60°C, esto preserva la integridad de los componentes orgánicos, sin embargo el tiempo de secado debe ser de 72 horas. **El porcentaje de humedad, será la referencia para estimar los demás constituyentes en base seca** Cenizas: Pese de 0.5 a 1 gr de la muestra de macroalga (de preferencia molida y homogénea). Colocar en un crisol de porcelana a peso constante (opcionalmente pueden emplearse cápsulas de aluminio previamente calcinadas). Introducir el crisol dentro de una mufla. Calcinar la materia orgánica; eleve gradualmente la temperatura de la mufla hasta los 450°C y mantenerla durante 4 horas. Retire el crisol de la mufla, enfriar en desecador y pesar. % Cenizas = (Peso de cenizas x 100)/ gr muestra Determinación de calcio (método espectrofotométrico) a. Preparación de la muestra: la muestra de cenizas obtenida se humedece con agua y 10 mL de HCl (1+1) b. Evaporación a sequedad: la muestra se evapora a sequedad en baño de agua durante 1 hora. c. Aforado a 250 ml: la muestra se enfría, se adiciona 20 ml HCl y se filtra recibiendo en matraz aforado de 250 mL. d. Determinación en espectrofotómetro a 422.7 nm: se determina el contenido de calcio contra una curva estándar previamente preparada, a 422.7 nm. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 20 Determinación de fósforo (método fotométrico) a. Preparación de la muestra: la muestra calcinada y reducida a cenizas se adicionan 40 ml HCl (1+3) y gotas de HNO3. b. Calentamiento y transferencia a matraz volumétrico de 200 mL: se calienta la muestra y se enfría, trasladándola a un matraz volumétrico de 200 mL. c. Filtrado y toma de la alícuota: se filtra y se toma una alícuota en un matraz volumétrico de 100 mL. d. Adición del reactivo molibdovanadato: se adiciona 20 ml del reactivo de molibdovanadato, se diluye a volumen con agua. Se deja reposar 10 minutos y se lee el % T a 400 nm contra una curva estándar previamente preparada. Lípidos: (modificado de Bligh y Dyer, 1959)* Pese 100 mgr de alga seca y molida colocarlos en un tubo de ensayo con rosca y tapón. Agregar 25 ml de una solución de Cloroformo: Metanol (2:1). Calentar en baño maría a 40 C por 15 minutos. Ajustar el volumen a 25 mL con la misma. Filtrar en embudo con papel filtro whatman N.1, recuperar 20 mL del extracto. Agregar 4 mL de agua destilada, agitar enérgicamente y reposar por 30 minutos. Centrifugar por 5 minutos a 1000 rpm (fase de cloroformo sin turbidez). Drenar la fase superior (metanol-agua). Deshidratar a 40 C hasta un volumen mínimo (de ser posible en cámara de vacío). Transferir a una cápsula a peso constante y deshidratar a sequedad. Pesar la cápsula que contiene los lípidos. Calcular el contenido de lípidos mediante la siguiente relación. % Lípidos = 4/5 (Peso de lípidos/ gr de muestra) x 100 *Esta técnica puede ser empleada para el análisis de lípidos en microalgas, usando las proporciones correctas, mediante espectrofotometría Ver Valenzuela-Espinoza (2008). Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 21 Fibra Cruda: (Método Kennedy) Pese 0.5gr de muestra e introducirla a un matraz bola de 500mL, agregar 150mL de H2SO4 al 1.5%, ensamblar un refrigerante y reflujar a ebullición durante media hora. Enfríe y filtrar sobre malla fina. Descarte la solución y lavar las partículas con, aproximadamente, 200 mL de agua destilada. Regresar las partículas al matraz, añadir 100 mL de NaOH 2.5% y unas cuantas perlas de ebullición, ensamblar el refrigerante y reflujar otra media hora. Filtrar sobre crisol Gooch, preparado con asbesto y a peso constante, lavar las partículas con aproximadamente 200 mL de agua destilada caliente y 15 mL de etanol. Seque el crisol en estufa de convección a 100-110°C durante 4 horas. Enfríe en desecador y register el peso como F1. Transfiera el crisol a una mufla y calcinar a 500°C durante 12 horas. Enfríe en desecador y registrar el peso como F2. Calcule él % de fibra cruda mediante la fórmula: [(F1 – F2) x 100] % Fibra Cruda = ______________________ gr de Muestra Proteínas: (método microkjeldahl). Digestión Introduzca, 0.1gr de muestra, en un matraz microkjedhal. Agregue 2gr de K2SO4, 0.04gr de CuSO4-5H2O y 2ml de H2SO4. Preparar un Blanco agregando en un matraz todos los reactivos excepto la muestra. Caliente los matraces, muestras y blanco, hasta que la mezcla presente un color verde-azul cristalino. Después cada digerido se enfría, se disuelve en agua y se afora a 25 ml. Destilación Coloque 5ml de la muestra digerida y 8mL de NaOH (40%) dentro de la cámara de un equipo de destilación por arrastre de vapor. Iniciar la destilación y recoger 45 ml del destilado dentro de una solución que contiene Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 22 10 mL de ácido bórico saturado y 4 gotas de indicador Shiro-Tashiro (violeta): durante la destilación, debido a la presencia de nitrógeno, el indicador vira a un color verde esmeralda. Titulación Titule la solución; de muestras y blanco, con HCL valorado (0.01N) hasta el vire a violeta del indicador. El contenido de proteínas se calcula mediante la fórmula: %N= [(mL Muestra- mL Blanco) * N (HCl) * 1.4 * Factor de Alícuota] ___________________________________________________________ gr de muestra % Proteínas = % N x Factor Protéico Donde: Factor de alícuota = Volúmen total de digerido / Vol. De muestra usada para destilar Factor Protéico = 6.25* *Este es el factor comúnmente aceptado para el método Kjeldahl, sin embargo, se puede incurrir en una sobreestimación de proteínas, debido a que este factor considera un contenido constante de nitrógeno en la proteína (16%), además el método cuantifica la reserva intracelular de nitrógeno presente. Carbohidratos: El contenido de carbohidratos, se realiza por diferencia de porcentajes de los otros constituyentes, con respecto al 100% % CHOS = 100 – (Lípidos+ Cenizas+ Proteínas+ Fibra cruda + Humedad) Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 23 1.4. Registro de datos Humedad (P1) (P2) (P3) % Hum P1= Peso de la cápsula P2=Peso cápsula + Muestra P3= Peso cápsula + Muestra seca PA= P3-P2 = Peso de agua PM = (P2-P1)= Peso de muestra Prom = σ= Cenizas (P1) (P2) (P3) % Hum P1= Peso del Crisol P2=Peso Crisol + Muestra P3= Peso Crisol + minerales PA= P3-P2 = Peso de agua PM = (P2-P1) = gr de Muestra PC = (P3-P1) = gr de Minerales Prom = σ= Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 24 Lípidos PM (P2) (P3) % Lip PM = Peso de Muestra P2=Peso Cartucho P3= Peso Cartucho + Lípidos* PL= P3-P2 = Peso de Lípidos * Considerar el % de Humedad que se pierde en este paso Prom = σ= Proteínas ml Mta ml Bco %N % Prot Muestra original = Prom = Dr. Enrique Hernández Garibay gr σ= Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 25 Fibra Cruda P1 F1 P2 % FC P1 = Gooch + Filtro F1 = P1 + Remanente de Hidrólisis (Org. É Inorg.) F2 = P1 + Remanente de Hidrólisis Inorgánico Fibra Cruda = F1- F2 Prom = σ= * Los valores de Cenizas, Lípidos, Proteínas, Fibra Cruda y Carbohidratos, se reportan en “base seca”; deben ser corregidas de acuerdo al % de humedad. 1.5. Referencias para consulta A.O.A.C. 1990. Official Methods of Analysis of the Assoc. of Off. Anal. Chemists. Eilliam Horritz, Editor. Ed. Badui Dergal Salvador. 1986 Química de los Alimentos. Ed. Alhambra. México. 430pp. Bligh, E.G. and W.J. Dyer. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. Biochem. Physiol. 37: 911-917. Darcy- Vrillon B. 1993. Nutritional aspect of the developing use of marine macroalgae for the human food industry. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 44(1):2335. Egan, H.; Kirk, R. y Sawyer, R. 1988. Análisis Químico de alimentos de Pearson. p. 39. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 26 Fleurence, J., Le Coeur, C., Mabeau, S., Maurice, M. and Landrein, A. 1995. `Comparison of diferent extractive procedures from the edible seaweeds Ulva rigida and Ulva rotundata' in Journal of Applied Phycology 7, 577±582. Fleurence, J., 1999. Seaweed proteins: biochemical, nutritional aspects and potential uses in Trends in Food Science & Technology 10 (1999) 25±28 Haug A y A. Jensen. 1954. Seasonal Differences in ash, carbon, fiber and nitrogen components of Furcellaria lumbricalis (Gigartinales, Rhodophyceae), Norway”. Botanica Marina 33: 327-334. Jensen A. 1993. “Present and Future Needs for Algae and Algal Products”. Hydrobiologia 260/261:15-23. Schmidt-Hebbe, H. 1981. Avances en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Sergio O. Lourenço1,*, Elisabete Barbarino1, Joel C. De-Paula2, Luis Otávio da S. Pereira4, Ursula M. Lanfer Marquez3 2002. Amino acid composition, protein content and calculation of nitrogen-to-protein conversion factors for 19 tropical seaweeds Phycological Research Volume 50, Issue 3, pages 233–241. Plummer D.T. 1981. Introducción a la bioquímica práctica. Ed. McGraw-Hill Latinoamérica Bogotá Colombia 485pp. Valenzuela-Espinoza, E. 2008. Razón de pigmentos accesorios/clorofila a, consumo de nutrientes y composición celular de tres especies de microalgas marinas cultivadas en diferentes condiciones de luz y nutrientes. Tesis de doctorado. Facultad de Ciencias Marinas, UABC, Ensenada, México. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 27 Práctica 2. PIGMENTOS ALGALES 2.1. INTRODUCCIÓN Los vegetales marinos (macro y micro algas) contienen pigmentos fotosintéticos cuya función es la absorción de la energía luminosa en diferentes longitudes de onda, y transferir esta a los centros de reacción donde es utilizada para realizar la fotosíntesis (Lobban & Harrison, 1994). Estos pigmentos están divididos en tres grupos: Clorofilas (a, b, c1, c2, c3), Carotenoides (carotenos y sus derivados oxigenados conocidos como xantofilas), y Biliproteínas (aloficocianinas, ficocianinas, ficoeritrinas). En el reino vegetal, la clorofila a es el pigmento universal y la cantidad de clorofila a respecto a otros componentes celulares y o pigmentos presentes en el tejido va a variar de acuerdo a factores como limitación de luz y nutrientes entre otros. Cada grupo algal posee un sistema de pigmentos característico. Las clorofilas y carotenos, son moléculas solubles en grasas y pueden extraerse de las membranas tilacoides con solventes orgánicos, tales como acetona, metanol o DMSO. En contraste las ficobilinas y la peridinina son solubles en agua y pueden extraerse del tejido algal después de haber extraído las clorofilas y carotenoides con solventes orgánicos. La técnica de extracción, implica el rompimiento tanto como sea posible de la integridad de la célula, para remover las moléculas de pigmentos de la membrana proteica intrínseca. Congelar el tejido con nitrógeno líquido y molerlo en estado congelado con mortero u homogeneizador, evita algunos de los problemas de trabajar con material que produce una gran cantidad de polisacáridos viscosos. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 28 El congelado-descongelado de los tejidos, también rompe las membranas celulares, sin embargo, libera más polisacáridos. El tejido finamente molido se coloca en el solvente orgánico para lograr un rompimiento adicional de las membranas celulares y liberar las membranas de pigmentos de los complejos que capturan la luz (proteína-Pigmento). Puede estimarse la concentración de pigmentos en los solventes en que se extrajo; sin embargo las fórmulas son predictivas y puede sobreestimar la concentración de algunos pigmentos. Durante la extracción, el rompimiento del complejo Proteína-Pigmento, puede cambiar los patrones de absorción de los pigmentos, resultando en elevar el máximo en 10 a 50 nm, comparado cuando el espectro se mide en tejido intacto. Es importante que tome en cuenta que la luz, calor, pH extremos y el oxígeno, cause la degradación de los pigmentos, por ello, los extractos deben mantenerse fríos y con luz lo más baja posible, para evitar su degradación. El espectro electromagnético. La luz es una forma de energía electromagnética, se comporta como una onda. La luz de longitud de onda corta, tirene la mayor energía. La luz visible, representa solo una pequeña parte del espectro electromagnético entre 400 y 740 nanometros. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 29 Espectro de absorción de la clorofila. Los picos representan la longitud de onda de la luz solar dondeabsorben fuertemente las dos formas de pigmentos fotosintéticos, (clorofila a (línea sólida) y clorofila b (línea punteada). Esos pigmentos, absorben predominantemente la luz violeta-azul y luz roja en dos bandas estrechas del espectro y reflejan la luz verde en la parte media del espectro. Los carotenoides (no mostrados aquí) absorben principalmente la luz azul y verde y reflejan la luz anaranjada y amarilla. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 30 2.1.1Objetivo Que el alumno: Identifique los principales pigmentos presentes en organismos fotosintéticos. Sea capaz de identificar las diferencias en el sistema de pigmentos entre los diferentes grupos algales. Sea capaz de correlacionar el contenido pigmentario de los organismos estudiados con los factores ambientales en que se desarrollan. 2.2. Material Material algal fresco (de preferencia de las diferentes divisiones algales) Mortero de porcelana y mano de mortero. Probeta de 10 mL Tubos eppendorf Hielo Preparaciones 1. Acetona 2. Acetona al 90 % 2.2.1 Instrumental Espectrofotómetro UV-Vis 2.3 Procedimiento: Extracción en Acetona: Puede aplicarse en algas verdes, cafés y rojas, así como para pastos marinos. Algunas de las algas pueden ser extraídas sin moler en nitrógeno líquido (verdes y pastos); sin embargo en rojas y cafés puedes ser necesario el uso de medidas más extremas. 1. Tomar entre 0.5 g de peso fresco del alga en cuestión. Moler en un mortero con nitrógeno líquido (el mortero y la mano es recomendable que estén previamente en el congelador antes de su uso). Moler el tejido hasta pulverizar. Aunque la molienda con nitrógeno líquido es lo más recomendable, no siempre está disponible, en tal caso se puede moler con acetona fría. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 31 2. Transferir el tejido pulverizado a un homogeneizador de vidrio. Agregar de 2 a 3 ml de acetona al 90% enfriada en hielo. Moler sobre hielo hasta que las partículas queden incoloras. 3.- Transferir a un tubo de centrifuga y centrifugar a 1000 rpm por 2 minutos. Decantar el sobrenadante. Nota: Si las partículas quedan aún con color, repetir el paso 2 y 3, hasta que quede incoloro. Las muestras pueden almacenarse en la obscuridad a -4 °C por cierto tiempo. Leer absorbencias a las diferentes longitudes de onda: Λ (nm) Clorofilas Absorbencia 630 647 664 Carotenos 470 480 510 581 610 664 Determinar el contenido de Clorofilas y carotenos con las fórmulas de Jeffrey y Humphrey (1975) siguientes: CLOROFILA a: v x[(11.85 x A664)-(1.54 x A647)-(0.08 x A630)]/ g alga. CLOROFILA b: v x[(21.03 x A647)-(5.43 x A664)-(2.66 x A630)]/ g alga. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 32 CLOROFILA c: v x[(24.52 x A630)-(1.67 x A664)-(7.60 x A647)]/ g alga. CAROTENOS: v x[(7.60 x A480)-(1.49 x A510)]/ g alga. FUCOXANTINA: (A470-1.239x(A631+A581-0.3A664)-0.0275A664)/141 EXTRACCIÓN DE FICOBILINAS Las Ficobilinas (Ficoeritrina y Ficocianina), son pigmentos solubles en agua. Estos pigmentos pueden ser obtenidos del pellet extraído con solvente orgánico; sin embargo, puede haber cierta pérdida en la fase orgánica. 1. Pesar aproximadamente 0.1g del talo algal fresco. Transferir a un mortero y moler en arena con 5 ml de buffer de fosfatos 0.1 M pH 6.8. 2. Centrifugue para eliminar turbidez. 3. Transferir a un matraz volumétrico y aforar. Medir las Absorbencias. Λ (nm) Absorbencia 565 620 650 4. Determinar la concentración de Ficobilinas usando las siguientes fórmulas: FICOERITRINA: v x (124 x A565)/ g Mtra. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 33 FICOCIANINA A650/5.79-A620/5.79 ALOFICOCIANINA A650/6.29-A620/6.29 Observe el espectro de absorbencia realizando un barrido entre 400 a 750 nm y determine los puntos de máxima absorción. Averigüe la estructura de las moléculas de los diferentes pigmentos evaluados. 2.4 Referencias para consulta: Andersson M, Schubert H, Pedersén M 2006. Different patterns of carotenoid composition and photosynthesis acclimation in two tropical red algae. Mar Biol 149: 653-665. Cabello-Pasini A, Aguirre-von-Wobeser E, Figueroa F 2000. Photoinhibition of photosynthesis in Macrocystis pyrifera (Phaeophyceae), Chondrus crispus (Rodophyceae) and Ulva lactuca (Chlorophyceae) in outdoor culture systems. J Photoch Photobio B 57: 169-178. Félix L. Figueroa, Alvaro Israel, Amir Neori, Brezo Martínez, Erik-jan Malta, Put Ang Jr., Sven Inken, Ronny Marquardt, Nathalie Korbee 2009. Effects of nutrient supply on photosynthesis and pigmentation in Ulva lactuca (Chlorophyta): responses to shortterm stress Vol. 7: 173–183, AQUATIC BIOLOGY. Lobban C. S.,Paul J. Harrison 1994. Seaweed Ecology and Physiology. Motten, A. F. 2004. Diversity of photosynthetic pigments. Pages 159-177, in Tested studies for laboratory teaching, Volume 25 (M. A. O’Donnell, Editor). Proceedings of the 25th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), 414 pages. Valenzuela-Espinoza, E. 2008. Razón de pigmentos accesorios/clorofila a, consumo de nutrientes y composición celular de tres especies de microalgas marinas cultivadas en diferentes condiciones de luz y nutrientes. Tesis de doctorado. Facultad de Ciencias Marinas, UABC, Ensenada, México. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 34 POLISACARIDOS ALGALES Las macroalgas, como productores primarios que son, emplean la energía y mecanismos de la fotosíntesis para producir compuestos de carbono orgánico; quizás sea por ello, que las plantas se componen predominantemente de carbohidratos (Kloareg y Quatrano, 1988). Los carbohidratos en las algas marinas se presentan formando una amplia variedad de polisacáridos, en donde cumplen diferentes funciones; principalmente como reserva energética y estructurales (McCandless, 1981; Lobban y Harrison, 1994). En relación a los carbohidratos estructurales, la situación es compleja; este grupo comprende el material insoluble de la pared celular y los polisacáridos solubles de la matriz inter y extracelular. Los polisacáridos de este grupo, se diferencian de las plantas terrestres, en la abundancia de los componentes de la matriz, en relación a los componentes esqueletales y por la prevalescencia de polisacáridos polianiónicos sobre los polisacáridos neutros (Kloareg y Quatrano, 1988; Lobban y Harrison, 1994). Como característica común de este grupo, es de que son polisacáridos de alto peso molecular indigeribles por el cuerpo humano, son usados en la elaboración de alimentos bajos en calorías y tienen similitud con el componente nutrimental conocido como “fibra”, ya que aumenta el volumen de la ingesta reduciendo el consumo de alimentos y además favorece su evacuación de los intestinos. Los hidrocoloides de las algas marinas tienen la particularidad de absorber grandes cantidades de agua, por lo que en la mayoría de las aplicaciones, difícilmente rebasan el 1 %, en esta concentración tienen la habilidad de incrementar en forma notable la viscosidad de soluciones o de formar geles de consistencia firme. De las paredes celulares de las algas marinas se obtienen los ficocoloides de importancia comercial tales como agar y carragenanos de algas rojas y alginatos de algas pardas. GENERALIDADES EN LA OBTENCIÓN DE FICOCOLOIDES: En términos generales para propósitos de este manual podemos definir la composición de las algas marinas desde un punto de vista práctico de la siguiente manera: 1.- Productos a ser separados: Alginatos, Agar ó Carragenanos. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Composición química de macroalgas. Página 35 2.- Impurezas: Estas se agrupan en dos categorías: a) Solubles: Sales, azúcares relacionados, polisacáridos, proteínas, aminoácidos, pigmentos etc. b) Insolubles: Celulosa, proteínas desnaturalizadas, material graso, materiales extraños, etc. Para obtener los productos de interés, debemos separarlos presentes y para ello podemos adoptar los siguientes procesos: de las impurezas 1.- Molienda de la materia prima 2.- Lavado 3.- Solubilización ó extracción. 4.- Remoción de impurezas insolubles. 5.- Separación del producto. Para cada caso los procesos de obtención deben cumplir con las siguientes condiciones: 1.- Máximos rendimientos. 2.- Máxima pureza y calidad. 3.- Mínima degradación ó reducción del tamaño de la cadena del polímero. (Evitando temperaturas extremas, excesiva agitación mecánica, pHs extremos, blanqueo de los productos en solución). Propiedades Funcionales de los Ficocoloides (Schweiger, 1992): Formación de Gel Formadores de Películas Impartición de Viscosidad. Propiedades de enlace Estabilización de Emulsiones Estabilización de Suspensiones. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 36 Práctica 3: Extracción de Agar 3.1. Introducción El Agar es un polisacárido que se obtiene de diferentes géneros de algas rojas, tales como, Gelidium, Gracilaria, Pterocladia, Gracilariopsis, Gelidiella entre otros (Craigie, 1990). La palabra agar-agar proviene del malayo que significa gelatina, en Francia y Portugal es conocido como “gelosa”. Este producto de las algas es el más antiguo en su uso; se considera que fue descubierto por M. Tarozaemon en 1658 (Armisén, 1993); ha sido un artículo de comercio desde el siglo XVII en Japón y fue introducido a Europa en el siglo XIX. Él celebre bacteriólogo Robert Koch hace mención de este producto en 1882, al lograr aislar bacilos de la tuberculosis también en medios preparados a base de Agar. Sus soluciones (a un 1.5%) son capaces de formar geles termo-reversibles fuertes, de elevada histéresis (alrededor de 50°C) y resistentes a la hidrólisis bacteriana. Se emplea en la industria alimenticia, en bacteriología y en técnicas de separación bioquímica (cromatografías, inmunoprecipitación, electroforesis). El agar se obtiene de la materia algal por; solubilización en agua caliente (autoclave o por ebullición). Filtración del extracto y separación del Agar, de la solución clarificada y gelificada, por congeladodrenado o por prensado-sinéresis (eliminación de agua del gel). Las principales fuentes de materia prima para la extracción de agar a escala industrial son, por orden de importancia, las algas de los géneros; Gracilaria; de Chile, Gelidium; España y Pterocladia; Portugal y Nueva Zelanda (McHugh, 1991). El Agar es un polímero lineal compuesto por la sucesión de dos unidades alternantes; β-D-galactosa y α-L-3,6 anhidrogalactosa con enlaces (1-4) y (1-3) respectivamente. AGAROBIOSA (1-3) -D-Galactosa ,(1-4) -3,6 Anhidro -L- galactosa Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 37 Estructura de la agaropectina. Estructura repetitiva de la agarosa. Araki, 1937, divide el agar en dos fracciones; Agarosa y Agaropectina, la primera se caracteriza por ser un polímero neutro esencialmente libre de grupos electronegativos (sulfatos y ácido pirúvico) con una proporción menor al 0.35% y una proporción variable de grupos metilo (1 al 20%); produce geles muy fuertes (> 800 gr/cm2). La Agaropectina representa la fracción de Agar con mayor contenido de grupos electronegativos (4-9%) por lo tanto de carácter hidrofílico muy fuerte y de muy baja o nula capacidad gelificante. El rendimiento y calidad del Agar depende de la especie de que se obtiene; los géneros de Gelidium se caracterizan por producir Agares de alta capacidad gelificante y debido a sus características el agar que producen se conoce como agar verdadero ya que cumple con la definición de la farmacopeia que dice que el agar en solución al 1.5 % forma geles fuertes que funden a temperaturas superiores a 85 C y que en el enfriado gelifican a temperaturas entre 42 a 35 C; por otra parte, los agares nativos de Gracilaria producen los llamados agaroideos, ya que no gelifican, debido a su alto contenido de grupos iónicos (alta proporción de agaropectinas). Sin embargo, debido a que se descubrió un procedimiento químico (tratamiento alcalino) para eliminar los grupos sulfato de las moléculas de agar, se logró que Gracilaria produjera un agar con características similares al de Gelidium (Painter, 1983, Craigie, 1990). El tratamiento alcalino que se aplica a los géneros que producen agaroideos, esta causa la hidrólisis de grupos sulfato de la Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 38 Galactosa-6-sulfato para transformarla a 3,6 anhidrogalactosa (neutra) con lo cual se incrementa notablemente la capacidad gelificante (Armisén & Galatas, 1987). Variaciones en la composición química de los agares producidos por las diferentes especias, son provocadas por los factores ambientales como luz, nutrientes y temperatura relacionados con el crecimiento del alga (Craigie & We, 1984; Lahaye & Rochas, 1991; Knutsen, 1992; Armisén, 1993). Gelidium robustum se cosecha en la costa noroccidental de la península de Baja California, representa la base para la extracción de Agar que se procesa en México por la compañía AGARMEX; una parte de las cosechas se exporta como materia prima. La producción anual promedio es de aproximadamente 1000 toneladas secas mientras que la producción de Agar es de alrededor de 100 toneladas (Hernández-Garibay, 2006). En el Golfo de California se han observado extensos mantos de Gracilaria lemaneiformis en los meses de febrero a junio (Pacheco-Ruiz et al., 1999), 1995 comm. pers.) y su Agar (extracción con pretratamiento alcalino) produce geles con una fuerza de 825 gr/cm2, unidades Nikkan (Arellano, et al. 1999). 3.2. Objetivo Aplicar las técnicas de extracción de Agar para especies de Gelidium y Gracilaria. Cuantificar el rendimiento de Agar colectadas en la península de Baja California. 3.2.1 Objetivos Didácticos Evaluar los procesos físico-químicos que intervienen en la extracción del agar. Determinar la metodología de extracción adecuada según el género de alga que se utilice como materia prima. Purificar el agar de un extracto crudo y estimar su rendimiento. 3.3. Materiales, Reactivos y Equipo Materiales Equipo 3 Vasos de pp de 600mL 3Planchas Calentamiento/Agitación 1 Termómetro 1 Potenciómetro 3 Navecillas 1 Baño maría a T cte. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales 1 Piceta Balanza 1 Cepillo Autoclave Página 39 1 Espátula 3 charolas metálicas Estufa 1 Probetas de 250mL Bomba de vacío 10 Piezas de papel filtro GFC de 11cm 1 Desecador 3 Magnetos 3 Cedazos 4´´, 550µ 3 Goteros 1 Vaso de pp de 1LT Reactivos: Jabón (cbp) NaOH al 2.5 (600 ml por equipo) H2SO4 0.03% (750 ml por equipo) H3PO4 al 10% (2 goteros) NaOCl 3gr de Cl/Lt (750 ml por equipo) Tierra de Diatomeas (20 gr por equipo) Etanol al 90% (500 ml por equipo) Na2CO3 al 0.06% (600 ml por equipo) Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 40 3.4. Métodos 3.4.1. Extracción de Agar de Gracilaria Pretratamiento Pesar 20 gr de alga seca. Agregar 200 ml de solución, caliente de NaOH al 2.5%. Mantener a 90°C durante una hora. Filtrar sobre cedazo fino, conservar las partículas, colectar una alícuota de líquido (50 ml) para control de * calidad y descartar el sobrante. Lavar las partículas durante 5 minutos con agua fría (250 ml) Neutralizar con solución de H2SO4 0.03% durante 10 minutos (250 ml) Lavar durante 5 minutos con agua fría (250 ml) Blanquear con Hipoclorito de Sodio (3 gr de Cl activo/Lt) durante 10 minutos (250 ml) Lavar las partículas con solución de H2SO4 0.03% durante 10 minutos (250 ml) Lavar durante 5 minutos con agua fría (250 ml) Extracción Agregar a las partículas lavadas 300 ml de agua caliente. Calentar y justo después de hervir enfriar la solución a 80°C y ajustar el pH de 6.8 a 7.2 con ácido fosfórico al 10%. Extracción durante 30 minutos a ebullición con agitación continua Agregue 8 gr de tierra de diatomeas y filtre en caliente en filtro de presión (precalentado) Vierta el precipitado sobre una charola rectangular y deje gelificar la solución. Aislar el agar por congelado y descongelado de la solución gelificada. Lave el agar con alcohol al 90%. Secar en estufa de convección a 60%. Cuantifique él % de agar. 3.4.2. Extracción de Agar de Gelidium Pretratamiento Pese 10 gr de alga. Agregue 200 ml de solución de Na2CO3. Calentar a 80°C durante 20 minutos. Filtrar sobre cedazo fino, conservar las partículas, colectar una alícuota de líquido (50 ml) para control de *calidad y descartar el sobrante. Lavar las partículas durante 10 minutos con agua fría. Filtrar sobre cedazo fino, descartar el líquido y conservar las partículas. Extracción Agregar a las partículas lavadas 300 ml de agua caliente. Calentar y justo después de hervir enfriar la solución a 80°C y ajustar el pH de 6.8 a 7.2 con ácido fosfórico al 10%. Trasferir a la autoclave y extraer durante dos horas a 15 lbs de presión (121°C). Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 41 Agregue 8 gr de tierra de diatomeas y filtre en caliente (80°C) con filtro de presión precalentado. Vierta el filtrado, caliente, en una charola y deje enfriar a temperatura ambiente hasta que gelifique la solución. Congele la solución gelificada Drene el gel congelado a temperatura ambiente Lave con; agua destilada (2 veces) y con etanol al 90% (3 veces), escurra y seque el Agar. Cuantifique él % de Agar. 3.5 Registro de datos Rendimiento Muestra a b c Prom Σ *Lim.Cf. Gelidium Gracilaria 3.6. Referencias para consulta Armisén, R. & F. Galatas. 1985. Production properties and uses of agar. En: production and utilization of products from commercial seaweeds. D.McHugh (Ed). FAO Fish. Tech. Paper No.288. Roma. Pp.1-57. Armisén, R. 1993. Productos derivados de Gelidium: producción, estructura y aplicaciones. Ed. J.A. Juanes & S. González Diputación Regional de Cantabria, España. 27 pp. Arellano-Carbajal, F. Pacheco, I. & Correa-Díaz, F. 1999. Variación estacional en rendimiento y calidad de agar de Gracilariopsis lamaeniformis (Bory) Dawson, Acleto et Foldvik, del Golfo de california, México. Ciencias Marinas. 25(1):51-62. Craigie, J.S. & Z.C. Wen. 1984. Effects of temperature and tissue age on gel strength and composition of agar from Gracilaria tikvahiae (Rhodophyceae). Can. J.Bot. 62:1665-1670. Espinoza-Avalos, J. E. Hernandez Garibay, J. A. Zertuche-González y M. E. Meave del Castillo, 2003. Agar de dos especies coexistentes de Gracilaria (Gracilariaceae) del Caribe mexicano.Ciencias Marinas, Vol.19 N. 2 Junio. González-Leija.J.A; E. Hernández-Garibay; I.; J. Guardado-Puentes; J. Espinoza-Avalos; J.M. López-Vivas and J. Bautista-Alcantar, 2009. Optimization of the yield and quality of agar Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 42 from Gracilariopsis lemaneiformis (Gracilariales) from the Gulf of California using an alkaline treatment. J Applied Phycology 21:321–326 Hernández-Garibay E, Guardado-Puentes J, Bautista-Alcantar J y Reyes-Tisnado R. 2006. Pesquería de Macroalgas del Océano Pacífico. En: Sustentabilidad y Pesca Responsable en México. Evaluación y Manejo. Instituto Nacional de Pesca. SAGARPA. México. Hurtado-Oliva MA, M. Manzano-Sarabia, E. Hernández-Garibay, I. Pacheco-Ruíz, J.A. Zertuche-González, 2011. Latitudinal variations of the yield and quality of agar from Gelidium robustum (Gelidiales, Rhodophyta) from main commercial harvest beds in western coast of Baja California, México. (Journal of Applied Phycology 23:727–734. Knutsen, S.H. 1992. Isolation and analysis of red algal galactants. Dr.Sci.Thesis. Univ. of Trondheim. NTH, Norway. 87 pp. Lahaye, M. & C. Rochas. 1991. Chemical structure and physical chemical properties of agar. Hydrobiologia. 221:137-148. McHugh, D. 1991. Worldwide distribution of comercial resources of seweeds including Gelidium. Hidrobiologia. 221:19-29. Pacheco-Ruíz, I., J. A. Zertuche-González, F. Correa-Díaz, F. Arellano-Carbajal and A. CheeBarragan. 1999. Gracilariopsis lemaneiformis beds along the west coast of the Gulf of California, Mexico. Hydrobiologia 398/399: 509-514. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 43 Práctica 4: Extracción de Carragenanos 4.1. Introducción Los carragenanos son polisacáridos galactanos sulfatados de cadena lineal, se encuentran presentes en la matriz y pared celular del tejido de algunos géneros de algas rojas tales como Chondrus, Eucheuma, Kappaphycus, Chondracanthus, entre otros. Su consistencia gelatinosa le confiere a las algas flexibilidad y resistencia mecánica en tanto que su carácter aniónico le da propiedades de regulador osmótico. Se emplean en la industria alimenticia, principalmente en productos lácteos, como agentes texturizantes y estabilizadores. También, en medicamentos, en cosméticos, en pinturas y tintes. Hace mas de 600 años los residentes del condado de Carraghen, Irlanda, empleaban las infusiones del “musgo de Irlanda” (Chondrus crispus) en alimentos y medicinas (Sanofi, 1994). En 1844 Schmidt reporta el aislamiento del polisacárido del musgo de Irlanda (Santos, 1979) y en 1871 G. Boungarde registra, en E.U.A. la primera patente para su extracción. En 1882 Standford le da el nombre de “Carrageenin” (Stanley, 1987). En los 30´s se estableció en Nueva Inglaterra una planta de producción de Carragenano el cual se usó como estabilizador de bebidas lácteas de chocolate. El éxito de esta aplicación y el desabasto de Agar, durante la Segunda Guerra Mundial, impulsó la producción de Carragenanos en otras localidades y el desarrollo de nuevas aplicaciones (Waaland, 1981). Actualmente las principales fuentes de carragenanos por orden de importancia, son las algas rojas, de los géneros; Euchema; de Filipinas, Chondrus; Canadá y Francia, Gigartina é Iridaea; Chile, Hypnea; Brasil y Furcellaria; Dinamarca (McHugh, 1991). El proceso de extracción de carragenanos implica básicamente; el lavado de la materia algal y difusión de álcali en el tejido. Solubilización en agua caliente (≥90°C) a pH alcalino (8-10) y separación de la solución por evaporación del agua o bien por precipitación con alcohol. Aunque, los carragenanos se describen como polímeros híbridos compuestos de una mezcla de diferentes fracciones, cada una con una proporción diferente de grupos sulfatos y de 3,6-anhidrogalactosa, se reconoce el predominio de cuatro tipos; “β” (Beta) o furcelaran, “κ” (Kappa), “ι” (Iota) y “λ” (Lambda). Los tres primeros producen, en diferente grado, soluciones gelificantes mientras que los carragenanos tipo “λ” (Lambda) son más sulfatados y producen soluciones viscosas y se emplean como estabilizadores. Las algas del género Furcellaria contienen carragenanos tipo β en tanto que las del género Eucheuma (Familia Solieriaceae) son productoras del carragenano tipo κ y/o de ι. Las especies de Hypnea (Familia Hypneaceae) producen κ, mientras que las algas de la familia Gigartinaceae (*Gigartina, Chondrus, Iridaea) exhiben una alternancia bioquímica en la composición de sus carragenanos; en la fase sexual gametofita predomina la combinación de carragenanos κ/ι mientras que en las fases tetraspóricas predomina las fracciones más sulfatadas del tipo λ. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 44 CARRABIOSA (1-3) -D-Galactosa galactosa (1-4) 3,6 Anhidro -D- En México, en la costa noroccidental de Baja California, el alga roja Chondracanthus canaliculatus ha sido cosechada, desde 1966, como fuente de materia prima de exportación para la industria de carragenanos (Hernández-Garibay, 2006). En la década de los sesenta se colectaban alrededor de 1200 toneladas secas por año; mientras que para 1991, disminuyó hasta cerca de 300 toneladas secas McHugh, 1991; es probable que esta disminución se deba a la introducción al mercado de materia prima proveniente de cultivos de Eucheuma de Filipinas y de Gigartina de Chile. Actualmente la producción se ha mantenido cercana a las 200 toneladas secas anuales, sin embargo, durante el 2012, se incorporaron nuevas localidades de cosecha por lo que es factible incrementar la cosecha anual. Además de Chondracanthus canaliculatus en las costas de Baja California existen otras especies como Chondracanthus squarrulosuis, Mastocarpus papillatus, Mazaella leptorinchos y Eucheuma uncinatum las cuales representan un recurso potencial para la extracción de carragenanos (López – Acuña, 1992; Correa-Díaz, 1987; Correa – Díaz, et al. 1990). Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 45 Tabla 1.- Algas productoras de carragenano y tipo de carragenano que contienen: ESPECIE CARRAGENANO Eucheuma gelatinae Beta Kappaphycus alvarezii Kappa Eucheuma spinosum Iota *Eucheuma uncinatum Iota Furcellaria fastigiata Kappa Chondrus crispus G Kappa/Iota Chondrus crispus T Xi, Lambda *Chondracanthus harveyanus G Kappa/Iota *C. harveyanus T Xi *C. canaliculatus G Kappa/Iota *C. canaliculatus T Xi, Lambda *C. pectinatus G Kappa/Iota *C. pectinatus T Xi, Lambda *Mastocarpus papillatus Kappa/Iota *Mazaella leptorinchos Kappa/Iota * Especies regionales G. Fase gametofita, T: Fase Tetrasporofita CARACTERISTICAS Gel Gel Gel suave Gel suave Gel Gel Viscosidad Gel Viscosidad Gel Viscosidad Gel Viscosidad Gel Gel 4.1.1. Objetivo Extracción y purificación de carragenanos de algas de la región de Baja California. Evaluación de rendimientos entre un proceso normal y uno con pretratamiento alcalino. 4.1.1. 1. Objetivos Didácticos Evaluar los procesos físico – químicos que intervienen en la extracción del carragenano. Determinar la metodología de extracción adecuada según el género y estadio reproductor del alga que se utilice como materia prima. Purificar el carragenano de un extracto crudo y estimar su rendimiento. 4.2. Materiales, Reactivos y Equipo Materiales 3 Vasos de pp de 600 mL Equipo 3 Planchas Cal/Ag 1 Termómetro 1 potenciómetro Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 46 1 Piceta Balanza 1 Cepillo Estufa 1 Espátula Compresor/Vacío 3 Matraces Erlenmeyer de 1 L 1 Probeta de 250 ml Embudo buchner 10 Piezas de papel filtro GFA de 11 cm 1 desecador 3 magnetos 1 vaso de precipitados de 1000 mL Reactivos Jabón (cbp) KOH al 6% en agua de mar (800 mL por eq.) NaHCO3 0.1 M (800 mL por equipo) H3PO4 al 10% (2 goteros) KCl sólido NaCl sólido Tierra de diatomeas (20 gr por equipo) Etanol grado técnico (Destilado) 4.3. Métodos 4.3.1. Extracción normal Agregar 3 gr de alga seca molida (2mm) en 300 ml de solución, caliente de NaHCO 3 0.1 M. Extraer los carragenanos a 95-100°C durante una hora con agitación contínua. Registrar el pH de extracción. Disolver en la solución, aun caliente, 1.7 gr de NaCl sólido y agregar 5 gr de tierra de diatomeas. Filtrar la solución caliente a través de un filtro buchner (previamente calentado) a vacío. Precipitar con 2 volumenes de etanol concentrado. Separar la fibra de carragenano y prensar para eliminar toda la solución. Para eliminar sales, lavar 2 veces con etanol al 60% y una vez con etanol concentrado. Secar en estufa a 60 C, hasta peso constante. Pesar para calcular el rendimiento. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 47 4.3.2. Extracción con tratamiento alcalino. Colocar 5 gr de alga molida en 100 mL de una solución caliente de KOH 6% (en agua de mar). Continuar el tratamiento alcalino a 90 C por una hora, con agitación de la solución. Filtrar sobre cedazo fino, conservar las partículas, colectar una alícuota de líquido (50 ml) para control de *calidad y descartar el sobrante. Lavar las partículas durante 15 minutos con agua fría. Decantar el agua de lavado, verter sobre las partículas 200 ml de agua destilada caliente y calentar. Extraer el carragenano a 95-100°C durante una hora con agitación contínua. Disolver en la solución, aun caliente, 2 gr de KCl sólido y agregar 5 gr de tierra de diatomeas. Filtrar la solución caliente a través de un filtro buchner (previamente calentado) a vacío. Colocar la solución clarificada en una charola y enfriar hasta gelificar. Congelar y descongelar el gel formado. Escurrir y enjuagar con agua. Secar en estufa de convección a 60 C hasta peso constante. Calcular el rendimiento. 4.4. Registro de datos Rendimiento Muestra a b c Promedio Σ *Lim. Cf. *Límite de confianza al 95% = 1.96 [σ/sqr(n)] 4.5 Referencias para consulta Correa-Díaz, F. 1987. Variación anual de los carragenanos de Eucheuma uncinatum de Bahía de los Ángeles, México. Tesis de licenciatura. Facultad de Ciencias Marinas. Universidad Autónoma de Baja California. Ensenada, B.C. México. 54 pp. Correa-Díaz, F., Aguilar, R. & L.E. Aguilar. 1990. Infrared analysis of eleven carragenophytes from Baja California, México. Hydrobiologia. 204/205:609-6014. López-Acuña, L.M. 1990. Cuantificación y caracterización estacional de los carragenanos Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 48 de Gigartina pectinata Dawson (Rhodophyta, Gigartinales) en muestras de campo y de cultivo. Tesis de licenciatura. Universidad Autónoma de Baja California. Facultad de Ciencias Marinas. Ensenada, B.C. México. 28 pp. McCandless, E.L., West, A. & M.D. Guiry. 1983. Carrageenan patterns in the gigartinaceae. Biochem. Syst. Ecol. 11(3):175-182. McHugh, D. 1991. Worldwide distribution of commercial resources of seaweeds including Gelidium. Hydrobiologia. 221:19-29. Molina-Martínez, J.M. 1988. Las algas marinas, un recurso de interés comercial en Baja California. En: Los recursos pesqueros del país, Secretaría de Pesca. México. 99. 75-93. Myslabodski, D.E. 1990. Red-algae galactans: Isolation and recovery procedures – effects on the structure and rheology. Ph. D. Thesis. University of Trondheim, NTH. Norway. 225 pp. Sanofi Bio-Industries. 1993. Hydrocolloids in dairy products. Technical Handbook #15. Carentan. France. 105 pp. Stanley, N. 1987. Production, properties and uses of carrageenan. En McHugh D.J. (ed.), Production and utilization of products from commercial seaweeds. FAO. Fish Tech. Pap. 288:116-146. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 49 Práctica 5: Extracción de ALGINATOS: 5.1. Introducción. Las algas pardas de la familia de las "feofíceas" constituyen la materia prima principal en la producción de alginato, ya que es un componente de la pared celular, donde se encuentra formando un complejo insoluble de ácido algínico y sus sales cálcica, magnésica y de metales alcalinos en varias proporciones. En 1883, el químico inglés E. C. C. Stanford, por digestión de frondas de ciertas algas pardas con carbonato sódico, obtuvo una masa gelatinosa que evaporada a sequedad presentaba "aspecto algo semejante al de la goma tragacanto". A esta nueva sustancia su descubridor le dio el nombre de "algina", derivado de alga. Este término se usó en un principio para designar la sustancia in situ en la planta; mientras que a los distintos productos comerciales que se obtuvieron posteriormente se les dio otras acepciones: ácido algínico, alginatos solubles, compuestos algínicos en general. La producción comercial de alginatos comenzó en 1929 por la compañía Kelco en California. En 1934 se inició la producción en Gran Bretaña y más tarde, durante la Segunda Guerra Mundial, surgió la industria de alginatos en Noruega, Francia y Japón. La variedad de compuestos algínicos de que se dispone en la actualidad son el resultado de una intensiva tarea de investigación, desarrollo, marketing y programas de servicio que se han extendido durante un período de cerca de treinta años en los principales países productores. Las algas pardas crecen en todas las regiones de aguas templadas y frías del mundo, en los hemisferios norte y sur. Existe una enorme variedad de especies que varían en tamaño, forma, así como en el porcentaje y calidad del alginato que producen. De interés para su aplicación industrial, podemos mencionar especies de los géneros: Lessonia (nigrescens, flavicans,trabeculata), Macrocystis pyrifera, Durvillea antártica, Laminaria (digitata, saccharina y cloustoni), Ascophyllum, Fucus, etc. , todos ellos, corresponden a organismos de grandes tamaños, conocidas también como Macroalgas, Kelp o sargazos, que alcanzan de 1 a varios metros de longitud. Los alginatos son las sales del ácido algínico, polisacárido lineal constituido por dos unidades monoméricas, el ácido b -D-manurónico (M) y el ácido a -L-gulurónico (G). Estos se agrupan en bloques de secuencias MM, MG, unidos por enlaces glucosídicos β (1-4); y bloques GG, GM, unidos por enlaces glucosídicos α (1-4). Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 50 Las fórmulas clásicas de Haworth para los dos monómeros se muestran en la figura 1, mientras la figura 2 ilustra las llamadas fórmulas de silla que permiten ver en forma más clara el arreglo tridimensional de las moléculas: Figura 1. Fórmulas de las unidades monoméricas del ácido algínico Acido β-D Manurónico Acido α-L Gulurónico Figura 2. Fórmulas en formas de silla Acido β-D Manurónico Acido α-L Gulurónico Los alginatos disponibles en el mercado se comercializan, en su mayoría, en forma de sales hidrosolubles, libres de celulosa, blanqueadas y purificadas, entre las que se incluyen algunos: Ácido algínico, Alginato de sodio, Alginato de potasio,también se producen compuestos combinados, tales como: Alginato de amonio-calcio y Alginato de sodio-calcio. 5.1.1 Objetivo Extracción y purificación de los alginatos de diferentes algas pardas de las costas de Baja California. 5.1.1.1. Objetivos didácticos Aplicar el proceso de intercambio iónico, para la extracción de alginatos de algas pardas. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 51 Evaluar el efecto de diferentes cationes, en las propiedades de solubilidad de los alginatos. 5.2. Materiales, Reactivos y Equipo Materiales 3 Vasos de pp de 600ml Pipeta Pasteur con bombilla Agitador magnético Espátula Embudo buchner de porcelana Matraz Kitazato de 500 mL Probeta de 250 mL Papel filtro para flujo rápido Tierra de diatomeas Equipo Plancha de Agitación Balanza Estufa Bomba/Vacío Desecador REACTIVOS HCl 0.1N Na2CO3 0.5% CaCl2 1% NaCl cristales Etanol Tierra de diatomeas 5.3. Procedimiento: Los alginatos se encuentran, dentro del alga, neutralizados por la unión de diferentes cationes que forman un gel lo suficientemente flexible y rígido para que el alga se pueda desarrollar en el medio ambiente marino. La extracción de los alginatos se da simplemente por intercambio iónico. Primero los alginatos, dentro de la partícula algal, se trasfieren, por tratamiento con ácido a su forma insoluble protonada o ácido algínico. Subsecuentemente al neutralizar las partículas con hidróxido de sodio se reemplazan los protones por sodio y se forma un alginato de sodio soluble el cual se separa del material algal por filtración y de la solución clarificada por precipitación con etanol o por adición de calcio o ácido. Los aginatos se extraen en el ámbito comercial, principalmente de algas de los géneros Laminaria (China, Noruega y Francia), Ascophyllum; Irlanda, Noruega y Canadá; Macrocysitis; USA y México, Lessonia; Chile y Durvillaea; Australia (McHugh, 1991). El proceso de extracción de alginatos a partir de diferentes especies de algas pardas, se fundamenta en el hecho de que este compuesto se encuentra inmerso en la pared y matriz celular de las algas y sus propiedades de solubilidad son de carácter iónico, donde las sales de metales divalentes y trivalentes (Ca, Sr, Ba etc), además de la forma ácida son Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 52 compuestos insolubles, mientras que las sales con metales monovalentes (Na, K y el NH4) forman compuestos solubles. En forma breve, podemos obtener los alginatos con una serie de pasos, los cuales se describen a continuación. 5.3.1. Preextracción Suspender 5 gr de alga, seca y molida, en 100 mL de HCl 0.1 M y se agita durante 30 minutos y decantar el líquido; repetir éste procedimiento 2 veces más (Si se usa alga fresca considere un contenido de humedad de aproximadamente 80% y procure, previamente, desintegrar el material en licuadora o molino de laboratorio.). Decante el ácido y lave el material algal 3 veces con agua destilada. Desechar el extracto ácido y el líquido de lavado (este líquido dependiendo de la estación puede contener un precipitado blanco; Laminarán). 5.3.2. Extracción Suspender las partículas algales en 150ml de Na2CO3 0.1M y agite. Considere que el proceso de neutralización es lento, después de 15 minutos de iniciado, revise el pH de la solución, si el pH es inferior a 6, requiere la adición de algunas gotas de NaOH 1M. Después de neutralizar (pH aproximadamente de 7), continúe la agitación para favorecer la extracción de los alginatos, las partículas se vuelven flácidas. Filtre la solución viscosa resultante de alginato de sodio, use tierra de diatomeas, un embudo buchner y aplique vacío. 5.3.3. Precipitación Mida el volumen del extracto y agregue NaCl sólido hasta alcanzar una concentración de 0.1 M; agite para solubilizar. Precipite el alginato agregando el extracto a un recipiente que contenga un volumen de etanol al 96%. Vierta lentamente el extracto mientras agita suavemente con una varilla de vidrio y vaya recubriendo esta con las fibras del precipitado. Si no se forman fibras, el alginato se puede recuperar por filtración o centrifugación. Alternativamente, la solución de alginato, se puede verter con agitación suave en una solución de CaCl2 1% , esto formará alginato de calcio insoluble el cual deberá convertirse a la forma soluble, convirtiendo primero en ácido algínico y posteriormente en alginato de sodio. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 53 5.3.4. Desalado La fibra de alginato precipitada en etanol, contiene el NaCl que se agregó para favorecer la precipitación, entonces este paso consiste en eliminar el exceso de NaCl, para ello se hacen 2 lavados con etanol al 60% (entre cada enjuague exprimir la fibra para eliminar el etanolagua), y después dos veces con etanol al 96% esto último es para desplazar la humedad presente en la fibra de alginato.. Deje secar el alginato a 60°C durante una noche y posteriormente en desecador por 15 minutos y pesar. Porcentajes de ácido manurónico y ácido gulurónico, relaciones M/G y contenido de alginato para varias especies comerciales de algas pardas Especie % M %G M:G Contenido de alginato de sodio (% sobre algas secas) Laminaria hyperborea 30 70 0.45 25 –27 Laminaria digitata 55 45 1.20 20 – 26 Macrocystis pyrifera 60 40 1.50 26 Ascophyllum nodosum 65 35 1.85 26 - 28 Lessonia nigrescens 60 40 1.50 35 Ecklonia maxima 55 45 1.20 40 Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 54 5.4. Resultados Especies utilizadas gr de Muestra % de Alginato obtenido Límite de confianza al 95% = 1.96 [σ/sqr(n)] Presentar los datos de otros equipos 5.5. Referencias para consulta Larsen, B. 1994. Curso 6: Alginatos. Maestría en Algología Aplicada. Universidad de las Palmas de Gran Canaria, España. 340 pp. Pronova, 1994. Technical Information: Alginates. Pronova Biopolymer. Noruega. 45 pp. McHugh, D.J. 1987. 'Production, Properties and Uses of Alginates. In McHugh, D.J. (ed) Production and Utilization of Products from Commercial Seaweeds, FAO Fisheries Technical Paper (288): p58–115. McHugh,D. 1991. Worldwide distribution of commercial resources of seaweeds including Gelidium. Hydrobiologia. 221:19-29. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC DIAGRAMA DE FLUJO QUE MUESTRA LA EXTRACCIÓN DE ALGINATOS Algas Frescas Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Molienda Polisacáridos algales HCl 0.1 N Pre-extracción Ácida Página 55 ALG-H+ Lavado Na2CO3 Extracción Alcalina ALG-Na Filtración HCl 1 N Precipitación Acida ALG-H ETANOL Enjuague ALGINATO DE SODIO SOLUBLE Na2CO3 Neutralización ALGINATO DE SODIO SOLUBLE ALG-Na CaCl2 1% Alginato de Calcio ALG2-Ca Enjuague HCl 0.1 N Conversión Ac Alginico ALG-H Enjuague Na2CO3 Conversión ALGINATO DE SODIO (Alg-Na) Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 56 Práctica 6: Reología é histéresis de los geles de agar y carragenano 6.1. Introducción La reología (**) y la histéresis (***) de los geles formados con agar y/o carragenanos, son dos características que determinan las aplicaciones que encuentran estos polisacáridos algales en alimentos, industria y en biotecnología. Los agares y carragenanos (tipo; Beta, Kappa é Iota) forman geles termorreversibles, su disolución, en caliente, produce la dispersión al azar de unidades poliméricas las cuales al decrecer, gradualmente, la temperatura reducen su movilidad y su longitud por la generación de enlaces intercatenarios lo cual inicia la formación de hélices dobles o sencillas. Posteriormente, agregados a estas hélices producen redes tridimensionales tan extensas que son capaces de inmovilizar al solvente y formar el estado de Gel (sólidoelástico), Los geles de agar son por lo regular fuertes y rígidos, de elevada histéresis (50°C) y no requieren la adición de catalizadores (gel físico). Mientras que los geles de los carragenanos son generalmente débiles y flexibles de baja o nula histéresis y requieren la adición de cationes (K y Ca principalmente) para formar el estado de gel (gel fisicoquímico). La reología é histéresis de los geles de agar y carragenano y su contenido de 3,6 anhidrogalactosa (3,6 AG) son propiedades íntimamente relacionadas. La presencia de grupos sustituyentes en posiciones donde no interfieren con la conformación, α(4C1), de la 3,6AG (****) no alteraran la capacidad gelificante, del polímero, pero si modifican las características reológicas y de histéresis de los geles formados; por ejemplo, los grupos metilo modifican la temperatura de gelación y fusión, mientras que los grupos sulfatos, presentes en carragenanos (20 a 50%) y en menor proporción en agar (1-9%), confieren al gel mayor afinidad al agua y por ende menor rigidez. Los valores de fuerza de gel de agares y carragenanos deben de ser interpretados con cuidado ya que estos varían dependiendo del método de medición aplicado. Varios dispositivos han sido descritos para la evaluación de la reología de geles de agar y carragenano de los cuales el método Kobe con el gelómetro Nikkan es ampliamente aceptado. Este método mide la fuerza de compresión que actúa durante 20 segundos y que rompe un gel de, aproximadamente, 3 cm de grosor a 20°C. la desventaja de este método es que requiere aproximadamente 8 gr de polisacárido y esta es una cantidad relativamente alta si se considera que bajo condiciones de extracción de laboratorio el proceso de purificación y refinación de tal cantidad requiere la aplicación de equipo de volumen superior a un litro (vasos pp, filtros, etc.) y el gasto de gran cantidad de reactivos (Hidróxidos, amortiguadores, alcohol, etc.) y una cantidad de materia prima superior a 100 gr (si se desean hacer por lo menos 3 evaluaciones). Además si la muestra proviene de cultivos experimentales la cantidad de esta es, por lo general, baja. Por lo cual, la evaluación de la fuerza del gel mediante esta técnica representa una seria limitante si se desean probar diferentes condiciones de cultivo y examinar varias muestras. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 57 ** Fuerza de gel y flexibilidad *** Margen entre las temperaturas de fusión y gelificación **** Por ejemplo en β4 o en α y β 2 En esta práctica de laboratorio evaluaremos geles de agar y carragenano con el gelómetro Nikkan y también la fuerza del gel medida con un dispositvo mecánico, utilizando una balanza granataria de 2 platos y un flujo constante de agua. 6.1.1. Objetivo Evaluar la reología é histéresis de geles de agar y carragenano 6.1.2. Objetivos Didácticos Evaluar la influencia de la materia prima y el proceso de extracción, sobre las propiedades visco-elásticas de los geles de agar y carragenano. 6.2. Materiales, Reactivos y Equipo Materiales Equipo 3 Refrigerantes medianos 24/40 Balanza analítica 1 Piceta 3 Planchas de C y A 1 Cepillo Estufa 1 Espátula Baño maría 3 Matraces fondo plano 24/40 (500 ml) Gelómetro Nikkan 1 Probeta de 100 ml 3 Magnetos grandes 1 Desecador Reactivos 3 navecillas medianas Jabón (cbp) 3 Soportes universales KCl (granular) 2 Charolas metálicas medianas 3 Pares de mangueras 3 Pinzas para soporte Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 58 12 Vasos de pp de 10 ml 2 Termómetros 3 Tubos de ensaye de 18*15 2 vasos de pp de 600 ml 6.3. Procedimiento 6.3.1. Preparación de los geles Se preparan soluciones de agar al 1.5% y carragenano al 2% con KCl al 1%. Las soluciones se someten a ebullición con reflujo sobre una plancha de calentamiento y agitación. Vierta la solución caliente sobre; un molde rectangular de 6X30X4.5 cm (a 3 cm de altura), en 4 vasitos de 10 ml y cubra a la mitad 3 tubos de ensaye de 18 mm x 15 cm. Se deja enfriar la solución a temperatura ambiente y cuando se gelifique el gel se invierten los recipientes con el fin de evitar la pérdida de agua por sinéresis. Se dejan reposar los geles durante una noche. 6.3.2. Punto de fusión Se sumergen los tubos de ensaye, que contienen los geles, en un vaso de precipitado de 1 Lt con 700 ml de agua y un agitador magnético. Se coloca dentro del tubo (encima del gel) un balín o cuerpo esférico de aproximadamente 6 mm de diámetro. Se calienta gradualmente el agua y cuando la temperatura del baño maría es superior a los 60°C se comienza a monitorear periódicamente el estado físico del gel. Cuando la esfera empieza a penetrar el gel y cae libremente (se da el cambio de gel a líquido) en ese momento se introduce el termómetro dentro del tubo de ensaye y sr registra el punto de fusión. NO SAQUE EL TUBO DEL BAÑO MARIA. 6.3.3. Fuerza de gel Método Kobe con gelómetro “Nikkan” El gelómetro Nikkan consiste en un pequeño pistón de metal, de 1 cm2 de base, ensamblado a una varilla la cual posee una base plana diseñada para agregar pesas en ella. Se agregan pesos en la base de la varilla. Se coloca el gel (recipiente de 6X30X4.5) debajo del pistón y se baja el dispositivo. Cuando el pistón hace contacto con el gel se inicia el conteo del tiempo, si el gel no rompe en los siguientes 20 segundos, se levanta el dispositivo, se cambia de posición el gel, se agregan más pesos y se repite el proceso hasta lograr el rompimiento del gel. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 59 El gel puede romperse antes de los 20 segundos, en este caso la fuerza del gel se calcula sobre la base del peso agregado (más 100 gr del peso del pistón y la varilla) y el tiempo transcurrido mediante la fórmula: Log (w)20=Log(Wx)+K[log(tx)-log(20)] Donde: w20= Máximo pesos que puede resistir en 20 segundos wx= Peso soportado en un periodo de tiempo x K= Coeficiente (0.18 a 20°C) tx= Periodo, en segundos, resistido con un peso Wx Si la temperatura a la que se mide la fuerza del geles diferente a los 20°C se aplica una corrección de un 3% por cada grado centígrado de diferencia: Fza. gel (20°C)= Fza gel (X°C)+0.03*(X°C-20°C)*[Fza gel (X°C)] Método dinámico con el equipo Gel-Lab Se coloca el gel (vaso de 10 ml) sobre el plato de la balanza y debajo del pistón. La señal que genera el sensor de presión se ajusta a cero. Se agrega una pesa de 100 gr. Se da marcha al motor acoplado al embolo y al avance del programa Cuando el embolo hace contacto con el gel simultáneamente se empiezan a registrar los datos de esfuerzo vs. deformación. Cuando la señal de esfuerzo, en la pantalla, desciende bruscamente en ese momento el embolo a penetrado el gel y se suspende el proceso. Se da marcha inversa al motor del embolo (control de sentido de rotación) y se restablece el equipo para la evaluación de otro gel. Se calcula la fuerza del gel y la deformación mediante la interpretación de la gráfica de esfuerzo vs deformación. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 60 PROPIEDADES FÍSICAS DE AGAR Y CARRAGENANOS Agar: Solución al 1.5 % Carragenano: Solución al 2 % en KCl 1 % Disolver a reflujo por 30 minutos FUERZA DE GEL PUNTO DE GELIFICACIÓN 10 mL de Solución a T° 70 80 °C PUNTO DE FUSIÓN 5 mL de solución a 7080 °C enfriar a 20 °C /24 horas Colocar los tubos en baño a 80 °C Colocar los tubos en baño a 20 °C. enfriar a 20 °C /24 horas Determinar los gramos por unidad de área necesarios para la ruptura del gel. Dr. Enrique Hernández Garibay Enfriar progresivamente el baño maría (1°C/ min) hasta que la perla de vidrio quede en la superficie. Calentar progresivamente el baño María hasta que la perla de vidrio se hunda. Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 61 6.4. Registro de datos Estimación de Fuerza de gel, Método Nikkan Muestra Peso (gr) Tiempo (s) (Wx) Gelidium (tx) Fuerza Fza. gel (W)20 (20°C) a Log(w)20=Log(Wx)+K[log(tx)log(20)] b c K=0.18 Gracilaria a b Carr. N c Temp. Amb.= a *Fza.gel=Fuerza * Factor temperatura b c Carr.A a b c Fuerza del gel Nikkan Muestra a b c Prom a Fuerza Gel-Lab b c Pfus Pgel Hist. Prom CNik Gel Gra C.N C.A Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 62 6.5. Referencias para consulta Armisén, R. 1993. Curso 4. En: Master degree course in applied algology. Universidad de las Palmas de Gran Canaria. España. Tommo III: 45-62. Goring, D.A.I. 1956. A semimicro gelometer. Canadian Journal of Technology. Vol. 34:5359. Istine, S; M. Ohno and H. Kusunose Methods of Analysis for Agar, Carrageenan and Alginate in Seaweed Bull. Mar. Sci. Fish.. Kochi Univ. No. 14, pp.49-55, 1994 Ohno, M, D.B. Largo and T. IKumoto, 1994. Growth rate, carrageenan yield and gel properties of cultured kappa carrageenan producing red alga KaPPmphyeus alvarezii CDoty) Doty in the subtropical waters of Shikoku, Japan. Apt) Phycology, 6. pp. 1-5 Rochas, C., Rinaudo, M. y S. Landry. 1989. Relation between the molecular structure and mechanical properties of carrageenans gels. Carbohydrate polymers. 10. 99:115127. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales PRÁCTICA 7. ESTIMACIÓN CARRAGENANO DE LA 3,6 Página 63 ANHIDROGALACTOSA EN AGAR Y 7.1. Introducción Los agares y carragenanos se componen de una secuencia repetitiva de unidades disacáridas formadas por la β-D-galactosa (1-3) y la α-galactosa (1-4), Levo para agar (αL) y Dextro para carragenanos (αD). En la unidad α (1-4), se puede generar un anillo interno entre el carbón 3 y el 6 para formar la 3,6 anhidrogalactosa (3,6 AG). Es únicamente, en polisacáridos de algas rojas donde se puede encontrar esta molécula. El contenido y distribución de la 3,6 anhidrogalactosa se relaciona directamente con la calidad de estos polímeros. La capacidad gelificante del polímero, la alternancia de sus unidades disacáridas y la presencia de la 3,6 AG son propiedad íntimamente relacionadas. Además se observan, en estas unidades, diferentes grados de esterificación por grupos sulfato, piruvato y metilo los cuales alteran las propiedades reológicas, físicas y eléctricas de los geles de estos polisacáridos. Las moléculas poliméricas que poseen la 3,6 AG son capaces de formar un gel. Mientras que aquellas que en su lugar contienen la α-galactosa 6 sulfato o la αgalactosa no son capaces de formar geles y solo producen soluciones viscosas. La 3,6 AG se genera por la conversión de unidades de α-galactosa-6-sulfato de manera natural o in situ por enzimas sulfohidrolasas (Rees, 1961; Craigie & Wong, 1984) y de forma artificial por las condiciones de extracción del polisacárido bajo tratamiento alcalino (Kojima & Funoka en Myslabodsky, 1990). Por varios años la 3,6 AG no fue detectada en agares y carragenanos ya que debido a que bajo las condiciones de hidrólisis aplicados esta molécula es lábil. En 1954 Araki aísla la 3,6 AG por metanolisis parcial y posteriormente (1968) estableció la estructura de la misma por metilación y síntesis (Painter, 1983). Para evaluar la 3,6 AG el polisacárido debe ser depolimerizado en condiciones ácidas y derivatizado tan pronto se libera. Uno de los productos monoméricos de la reacción es el 5-Hidroximetil-2-furaldehido el cual también se forma con la fructosa y puede ser evaluado colorimétricamente con el reactivo de resorcinol aplicando el método descrito por Craigie y Leigh (1984) el cual es una modificación del original descrito por Yaphe y Arsenault en 1965. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 64 7.1.1. Objetivo Evaluar el contenido de 3,6-anhidrogalactosa en agares y carregananos, obtenidos de especies de algas rojas de la Península de Baja California, de diferentes hábitats y sometidas a diferentes condiciones de extracción. 7.1.2. Objetivos didácticos Desarrollo de curva de calibración de fructuosa Aprender el fundamento de evaluación de la 3,6 anhidrogalactosa Evaluación del efecto de; el origen de la materia prima y el proceso de extracción sobre el contenido de la 3,6 anhidrogalactosa Correlacionar el contenido de 3,6 anhidrogalactosa con las propiedades viscoelásticas de los geles de agar y carragenano 7.2. Materiales, Reactivos y Equipo Materiales Equipo 1 Cepillo Baño con termostato 1 Piceta 2 Planchas de C y A 1 Espátula Espectrofotómetro 4 Gradillas Instalado en Lab. 3 Pipetas de 1 ml 3 Pipetas de 10 ml Reactivos 1 Pipeteador Jabón 1 Desecador Fructosa anhidra 0.5 g 1 Termómetro Resorcinol (0.15%) 50 ml 1 Vaso de precipitado de 600 ml Acetal (0.825%) 10 ml 4 Vasos de precipitado de 50 ml Acetal diluido (1 ml de acetal/25 ml) * 2 Matraces de aforación de 50 ml Hielo (cbp) 2 Matraces de aforación de 100 ml HCl concentrado 250 ml 1 Matraz de aforación de 25 ml *Se prepara fresco Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 65 2 Magnetos pequeños 1 Par de celdas 1 Repipet de 10 ml (para todo el grupo) 25 Tubos de ensayo (12 ml) con tapón de rosca 7.3. Método Curva de calibración y Blanco Disuelva 0.108 gr de fructosa en 100 ml de agua (stock). Transfiera 2 ml de este aforado y aforar ahora en 50 ml (sol. referencia), Calcule la concentración en μg/mL. Marque 8 tubos con tapón de rosca; 1s, 2s, 3s, 4s, 5s, 6s, 7s y 8s, trasferir 1 ml de la solución de referencia al tubo #1 y aforar a 10 ml y proceder respectivamente con los otros tubos (7ml de solución de referencia en el tubo 7 y aforar a 10 ml). Marcar 3 series de 8 tubos (1c, 2c, 3c, 4c, 5c, 6c, 7c, 8c) transferir 1 ml de los tubos de la serie s a los de la serie c. Procedan respectivamente con los otros tubos. Marque un tubo; BCO y agregue 1 ml de agua destilada. Muestra problema Muestras a1 agar de Gracilaria a2 agar de Gelidium, muestras c1 carragenano de Gigartina normal y c2 alcalino. Pese aproximadamente 0.060 gr de Agar y 0.080 gr de carragenano y aforar a 100 ml (4 aforados) Marque 4 tubos como; a1s, a2s, c1s, y c2s. Transfiera 1 ml de sus respetivos aforados y aforar a 10 ml. Marque 3 series de 4 tubos como; a1m, a2m, c1m y c2m. Trasfiera 1 ml del tubo a1s al tubo a1m y así sucesivamente con los otros tubos. Reacción Enfríe en hielo los tubos “c”, BCO y los tubos “m” (13 en total) Prepare el reactivo de resorcinol-acetal: 100 ml de HCl conc + 9 ml de resorcinol + 1 ml de acetal (DILUIDO 1/25). Agregue 5 ml de reactivo (frío) a cada uno de los trece tubos Mezclar, tapar ligeramente y mantener en el baño de hielo, por un mínimo de 3 minutos y máximo de 30. Colocar la gradilla de tubos en un baño a 20°C por 4 minutos Trasferir la gradilla con los tubos a un baño con termostato a 80°C y mantenerlos durante 10 minutos exactos. Enfriar en baño de hielo por 1.5 minutos Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 66 El cromóforo que se forma es muy inestable entonces tienes a partir de este momento 15 minutos para dejar la muestra 2 minutos a temperatura ambiente y leer en el espectro a 555 nm. Se debe evitar el contacto directo de la luz con el cromóforo. Convierta los datos de absorbancia a concentración a partir de la curva de calibración La concentración se calcula con la curva de calibración de fructosa y el resultado se multiplica por 1.087 para obtener la concentración correspondiente a 3,6 anhidrogalactosa. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 67 7.4. Registro de datos Curva de calibración Absorbancia Conc (y). a b µg/ml Prom 0 A partir de estos datos calcule la Regresión lineal: 4.32 8.64 Conc (y) 0 m[Abs(x)]+b 12.96 17.28 m= b= X2 = 21.6 25.92 Presente en resultados; la tabla de promedios y los 30.24 Datos de concentración, de la curva de calibración 34.56 Reacción Muestra Problema Muestr Absorbancia *Cx a a b Prom mg/ml Gel Gra *Cx= Concentración calculada en base a la curva de calibración Presente los Resultados una gráfica de Barras con los valores de porcentaje de 3,6 AG de cada muestra CarrN CarrA Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 68 7.5. Referencias para consulta Craigie, J.S. y C. Leigh. 1984. Carrageenans and agars. En: Handbook of phycological methods; physiological and biochemical methods. Hellebust, J.A. and J.S. Craigie (Eds). Cambridge University Press. 110-131. Craigie, J.S. y Z.C. Wen. 1984. Effect of temperature and tissue age on gel strength and composition of agar from Gracilaria tikvahiae (Rhodophyceae), Can. J. Bot. 62:1665-1670 Kojima, Y. y K. Funaki. 1951. Studies on the preparation of agar-agar from Gracilaria confervoides (part 2) Bull. Jap. Soc. Sci.Fish. 16:405-410. Myslabodski, D.E. 1990. Red-algae galactants: Isolation and recovery procedures – effects on the structure and rheology. Ph D. Thesis. University on Trondheim, NTH. Norway. 225 pp. Painter, T. J. Algal polysaccharides. In: ASPINALL, G. O. (Ed.). The polysaccharides. New York: Academic Press, 1983. p. 195-285. Rees, D.A. 1961a. Enzymic desulphation of porphyran. Biochem. J. 80:449-453. Yaphe,E, W., 1984. Chemistry of agars and carrageenans. Hydrobiologia, 116/117, 171-186 Yaphe, W. & G. P. Arsenault, 1965. Improved resorcinol reagent for the determination of fructose and 3,6- anhidrogalactose in polysaccharides. Analyt. Biochem. 13: 143-148. . Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 69 Práctica 8: Viscosidad de los alginatos, propiedades gelificantes y la Influencia de la concentración y el efecto de contra-ion. 8.1. Introducción El estado físico y las propiedades de las soluciones de alginatos, ya sea como geles o como soluciones viscosas, son un reflejo del ambiente iónico que lo rodea y de su concentración. El alginato al ser polianiónico tiene la capacidad de interactuar con diversos cationes; forma soluciones viscosas con cationes monovalentes, como el Na y K, mientras que los iones divalentes, Ca, Ba, Sr, inducen la formación de un gel. Algunos cationes, di o tri valentes, enlazan selectivamente al alginato é inducen la formación de geles ionotrópicos. Estos iones son predominantemente bivalentes (Ca++, Ba++, Sr++). Para formar gel los alginatos necesitan contener niveles adecuados de monómeros de guluronato y que una cierta proporción de estos monómeros ocurran en bloques homogéneos. Las regiones de monómeros de guluronato en una molécula de alginato pueden unirse a una región similar en otra molécula por medio del calcio u otro catión multivalente. Los cationes bivalentes, como el Ca, embonan dentro de las estructuras de guluronato como huevos en una caja de huevos. Esto agrupa los polímeros de alginato por formación de zonas de enlace, dando lugar a la gelificación de la solución (*)*. Desde un punto de vista químico, la formación de un gel de alginato de calcio proviene de un intercambio iónico porque este desplaza el sodio u otro catión monovalente. Un gel de alginato se puede considerar de naturaleza; parcialmente en estado sólido y parcialmente en un estado líquido. Las zonas de enlace representan la parte sólida, después de la gelificación, las moléculas de agua son, físicamente, embebidas por la matriz de alginato, pero aun pueden migrar. Esto es de gran importancia en varias Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 70 aplicaciones, por ejemplo en geles para inmovilizar células o para encapsulación. La capacidad de retención de agua por el gel se debe a fuerzas capilares. *Alta turbidez y bajo modulo de rigidez son características de alginatos ricos en unidades M (polimanuronatos). El polimanuronato de calcio se puede describir mejor como una voluminosa pasta de grumos más que un gel. Mientras que los poliguluronatos se caracterizan por su resistencia y trasparencia de gel. Es también posible hacer un gel de alginato sin la incorporación de calcio u otros cationes entrelazados. Al acidificar una solución de alginato se forma un gel de ácido algínico. Este evento se desarrolla cuando el polianión de alginato pierde sus cargas a bajos pH´s -cuando los grupos carboxilos de los ácidos urónicos se protonan- Esto atrae las cadenas adyacentes de alginato y favorece la formación de enlaces de bloques G. aquí de nuevo son los bloques G los que contribuyen a la fuerza de gel por el desarrollo de zonas de enlace con los bloques rígidos G alineados y ensamblados unos a otros por medio de enlaces de puentes de hidrógeno. Los geles de alginato son termo-estables. La fuerza de gel es generalmente independiente de la longitud de cadena molecular, siempre y cuando la cadena exceda cierta longitud crítica (el grado de polimerización deberá exceder las 200 unidades para alcanzar una fuerza de gel óptima). 8.1.2. La viscosidad es la fuerza que opone un líquido al fluir en relación con el esfuerzo que se le aplica para lograr el flujo. La viscosidad de las soluciones de alginatos depende de la concentración, de la extensión de la molécula y de su flexibilidad. La viscosidad se incremente conforme aumenta la concentración. A mayor peso molecular mayor viscosidad. Los pesos moleculares de los alginatos comerciales varían de 20,000 a 600,000 lo cual corresponde aproximadamente a un grado de polimerización de entre 100 y 3,000. Con relación a esto se observa que cuando se adicionan pequeñas cantidades de Ca, a las soluciones, estas exhiben un incremento en su viscosidad debida a que los átomos de Ca producen una unión entre las cadenas y aparentemente aumenta la longitud de los segmentos y por ende la viscosidad. En las regiones de los bloques G Las moléculas disueltas no son completamente flexibles; la rotación de los enlaces glicosídicos se reduce ligeramente, dando lugar a un reforzamiento de la molécula. Las soluciones de macromoléculas rígidas son altamente viscosas. En las soluciones de alginato, cuando se incremente el esfuerzo de flujo este causa un acomodo de las cadenas poliméricas y da como resultado una disminución de la viscosidad conforme este esfuerzo se incrementa. Una de las principales formas de comparar la calidad y el potencial de aplicaciones en alginatos, provenientes de diferentes fuentes algales, es mediante la evaluación de la viscosidad y de las propiedades gelificantes. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 71 Todos los polímeros, incrementan la viscosidad del solvente en el que se encuentran disueltos; éste incremento permite por métodos convenientes, determinar el peso molecular del polímero. Dado que el método de la viscosidad no está basado en rigurosas leyes físicas, este debe ser calibrado por estándares de peso molecular conocido, con una distribución del peso molecular apropiada. Para un sistema polímero-solvente dado a una temperatura fija, es posible determinar un peso molecular promedio para el polímero, el tamaño del enrollado o Radio de giro y el exponente de la ecuación de Mark-Houwink, que contiene información acerca de las interacciones Polímero-Solvente. El viscosímetro capilar, es el instrumento apropiado para medir la viscosidad de soluciones diluidas de un polímero. En el viscosímetro, la solución es liberada dentro de un capilar en el cual se registra el tiempo (t) que el menisco de la solución viaja una distancia (d) o tiempo de flujo, el cual se mide para varias concentraciones de la solución del polímero, así como para el solvente sin polímero. De la siguiente relación se obtiene la Viscosidad Viscosidad específica: Puede definirse como el relativa ( rel) incremento fraccional de la viscosidad causada rel = t / to por la presencia de el Donde: t = Tiempo de polímero disuelto en el flujo de la solución solvente. To = Tiempo de flujo del solvente. sp = Con la viscosidad relativa, se pueden obtener todas las otras viscosidades de la solución. Dr. Enrique Hernández Garibay [t - to] / to sp = rel –1 Con la viscosidad específica y la concentración (c) de la solución, se obtiene la viscosidad reducida ( red). Viscosidad reducida ( red). sp /c= red La viscosidad reducida cambia en función de la concentración, entonces graficando la viscosidad reducida respecto a la concentración obtenemos la siguiente gráfica: Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 72 η red = k’[η]2c + [η ] Donde la intersección con el eje Y obtenemos la viscosidad intrinseca [η], la cual está relacionada a la pendiente k’[η ]2. La viscosidad intrínseca es la cantidad que relaciona la viscosidad al peso molecular y las diferencias estructurales intrínsecas de las moléculas de soluto que son importantes para determinar el peso molecular. Sin embargo hay otra manera de calcular la viscosidad intrínseca. Este método implica el cálculo de la Viscosidad inherente (η inh) a partir de la viscosidad relativa. ln η rel / c = η inh También la viscosidad inherente cambia en función de la concentración, entonces graficando la Viscosidad inherente respecto a la concentración obtenemos la siguiente gráfica: De Nuevo la Viscosidad intrínseca [η], es la intercepción con el eje-y pero con pendiente diferente k"[ η ]2 donde η inh = k"[ η ]2c + [n] Ahora se obtuvo la Viscosidad intrínseca con 2 métodos diferentes; es un procedimiento normal hacer el cálculo empleando ambos métodos; si el resultado con ambos métodos se asemeja entonces las medidas que se realizaron, son correctas. Colocando ambos Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 73 resultados en la misma gráfica, ambas deben interceptar en el mismo punto indicando el valor de la Viscosidad intrínseca. Una tercera forma de calcular la viscosidad intrínseca es con la ecuación de Martin- Punto Único. Punto Unico: ln (η sp / c) = ln [n] + k1 [n] c. Con ese dato se tiene la información necesaria para calcular el Peso Molecular mediante la ecuación de Mark-Houwink. [η ] = K’ Ma Donde para alginatos tenemos que: K= 2 X 10-5 y a = 1 para NaCl 0.1 8.1.1. Objetivo Evaluar las propiedades viscoelásticas de los geles de alginato preparados en soluciones que contienen diferentes cationes y diferentes concentraciones de alginato. 8.1.2. Objetivos didácticos Explicar el mecanismo de gelificación de las moléculas de alginato y efecto del medio ambiente iónico sobre esta propiedad. Correlacionar las diferencias en las propiedades viscoelásticas de las soluciones de alginato con respecto al origen de la materia prima. Determinar el peso molecular de alginatos de diferentes fuentes. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 74 8.2. Materiales, Reactivos y Equipo Materiales Equipo 1 Cepillo 1 Espátula 1 probeta de 25 mL 2 Planchas de Calentamiento y Agitación 2 Matraces (24/40) 100 mL Viscosímetro capilar Ubbelhode N.1 2 Magnetos medianos Baño maría 2 Refrigerantes chicos (24/40) 2 Pipetas serológicas de 1 mL 2 Pipetas serológicas de 20 mL 6 Vasos de pp de 50 ml 2 Vaso de pp de 250 ml 12 Cilindros de plástico (1cm h) Reactivos (por equipo) Jabón (cbp) CaCl2 0.2 M 250 mL NaCl 0.2 M 250 mL HCl 0.2 M 250 mL MgCl2 0.2 M 250 mL Alginato de sodio 2gr Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 75 8.3. Método 8.3.1. Viscosidad relativa 1.- De los alginatos que obtuvo usted en practicas anteriores prepare 25 mL de una solución al 0.5 % (Solución A). 2.- Prepare una solución stock de Cloruro de Sodio 0.2 M 100 mL (Solución B). 3.- Con la Solución B prepare 100 mL de NaCl 0.1M (Solución C). Mida el t0 en el viscosímetro capilar. 4.- Para preparar la primer solución de trabajo, mezcle 20 mL de Sol A con 20 mL de Solución B. Características: Alginato 0.25% en NaCl 0.1M (1) mida el tiempo ts en el viscosímetro capilar. 5.- A partir de la solución 1 y 3 prepare diferentes diluciones de alginato conservando constante la concentración de NaCl. 6.- Con los datos obtenidos calcule Viscosidad relativa (η rel), Viscosidad específica (η sp ) y la viscosidad intrínseca [η] empleando las formulas respectivas. 7.- Calcule el peso molecular de su alginato. 8.3.2.Propiedades gelificantes Prepare, anticipadamente, soluciones al 4% de alginato de diferente origen algal. Prepare con cada solución al 4% una solución adicional al 2% (dilución 1:20). Enjuague los tubos de diálisis en agua destilada por lo menos 10 minutos, corte un pedazo y únalo, por medio de un “O-ring” al extremo de un cilindro de plástico. Llene el cilindro con la solución de alginato y cierre l otro extremo, evite atrapar burbujas. Deje reposar el cilindro inmerso en las soluciones de prueba por una hora y media. Retire los cilindros de las soluciones y evalué las propiedades viscoelásticas de cada tratamiento. Hierva, 5 minutos, tracitos de los geles y describa cual es la diferencia entre los geles de alginato y los de carragenano/agar. Soluciones de prueba; CaCl2 0.2 M, NaCl 0.2 M, HCl 0.2 M y MgCl2 0.2 M. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 76 8.4. Registro de datos Viscosidad Tabla de Resultados: Tiempo Conc en seg. 0 Alg 1 Alg 2 Alg 3 Alg 4 r sp ln ( sp /C rel ln rel/C Huggins Kraemer [2( sp ln rel)] **0.5/C Punto Unico Con los datos obtenidos en el viscosímetro determine la viscosidad intrínseca en forma gráfica. Con la viscosidad intrínseca encontrada, calcule el peso molecular de su alginato. Propiedades Gelificantes relativas Muestra Ca++ H+ Na+ Mg++ Describa lo sucedido después de someter a calentamiento el gel de alginato y que diferencia observa con respecto a los geles de agar y carragenano: Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 77 8.5. Referencias para consulta Ferry, J. D. (1980) Viscoelastic Properties of Polymers, 3rd ed. (JohnWiley & Sons, New York) or Sperling, L. H. (1986) Physical Polymer Science. (John Wiley & Sons, New York) Haug, A. 1964. Composition and properties of alginates. Norwegian Institute of Seaweed Research. Report 30. 123 pp. Martisen, A., Skjak-Braek,G. & O. Smidsord. 1987. Alginate as immobilization material: I Correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads. Biotechnology and Bioengineering. 33:79. Smidsrod, O. 1973. Molecular basis from some physical properties of alignates in solution. Farr. Disc. Chem. Soc. 57:263. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 78 Práctica 9: Aglutinación de células sanguíneas por Lecitinas y Polifenoles de algas marinas. 9.1. Introducción Las Lecitinas son proteínas o glicoproteínas, no relacionadas con el sistema inmunológico, que aglutinan células y/o precipitan carbohidratos complejos. El efecto aglutinante de estas moléculas, altamente específicas, es reversible y puede ser fácilmente inhibido por la presencia de monosacáridos libres, aunque en algunos casos se requieren di, tri y en ocasiones polisacáridos. Los polifenoles, son moléculas, que entre otras propiedades, tienen la capacidad de aglutinar células sanguíneas mediante la formación de complejos irreversibles. Las lecitinas se extraen de una amplia variedad de fuentes, dentro de las que se incluyen; algas, semillas, raíces, cortezas, hongos, bacterias, esponjas, moluscos, huevos de peces, fluidos corporales de invertebrados y de vertebrados menores y hasta de membranas celulares de mamíferos. La verdadera naturaleza del papel fisiológico de las lecitinas permanece, aun desconocida. Sin embargo, estas moléculas han demostrado ser muy valiosas en una amplia gama de aplicaciones in vitro como por ejemplo en: 1. 2. 3. 4. 5. Tipos de sangre y estudios de poliaglutinación de eritrocitos Estimulación mitogénica de linfocitos Estudios de subpoblación de linfocitos Fraccionación de células y otras partículas Estudios histoquímicos de condiciones normales y patológicas Actualmente encuentran aplicación las lecitinas de origen algal que se extraen de la alga verde Codium fragile, subespecie tometosoide y de la alga roja Ptilota plumosa. La primera exhibe afinidad hacia los glóbulos rojos del grupo A y tiene un costo aproximado de 41.2 dlls por miligramo, mientras que la de la segunda es muy específica al grupo sanguíneo B, el costo aproximado es de 23 dlls por miligramo (Roger & Blunden, 1980; Sigma, 1998). Los polifenoles, también conocidos como taninos, se encuentran en diversos tejidos vegetales. Su principal aplicación ha estado, tradicionalmente, en el curtido de pieles. Son polímeros de floroglucinol y poseen pesos moleculares entre 500 y 3000. Además, de presentar las reacciones fenolicas comunes, presentan propiedades muy especiales como la habilidad de precipitar alcaloides, gelatinas y otras proteínas, mediante la formación de complejos irreversibles. Diversas pruebas in vitro han exhibido la amplia variedad de propiedades biológicas y de actividad farmacológica de los polifenoles, entre muchas destacan (Haslam, 1996): Actividad bactericida Actividad antihelmíntica Inhibición de la replicación viral de inmunodeficiencia humana (HIV) Actividad antitumoral Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 79 Inhibición de la glucosil tranferasa de Streptococcus mutans (caries dental) Inhibición de enzimas Aglutinación de células En todo el mundo, se han hecho notables estudios relacionados con la actividad biológica y farmacológica de moléculas de origen algal. Es importante evaluar la presencia y propiedades de las moléculas “activas” provenientes de algas marinas, de nuestras costas, con el fin de desarrollar productos de importancia comercial. Que permitan una explotación sustentable de este recurso natural. 9.1.1. Objetivo Analizar el efecto de aglutinación de células, de diferentes tipos sanguíneos, provocado por Lecitinas y Polifenoles de algas marinas. 9.1.2. Objetivos didácticos Desarrollar ensayos con moléculas biológicamente activas Evaluar la actividad aglutinante y la especificidad de este tipo de moléculas 9.3. Materiales, Reactivos y Equipo Materiales Equipo 2 Vasos de pp de 50 mL Homogenizador 1 Pipeta automática de 200 µL Plancha de Cal y A 3 Camisas de centrífuga (15 mL) 1 Columpio de centrífuga (15 mL) Equipo en laboratorio 1 Pipeta Pasteur Centrífuga 1 Pipeta graduada de 1 mL Balanza 1 Pipeta graduada de 5 mL 1 Equipo soxhlet (250 mL) Reactivos 1 Soporte universal Etanol 2 Mangueras Bufer Salino : Fosfatos pH 7 1 Pinza para soporte En NaCl 0.9% 6 Tubos de ensayo 10*100 Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 80 1 Gradilla 9.4. Métodos Colecta de algas Colectar Codium fragile y Sargassum sp. Trasportar las muestras al laboratorio en contenedores refrigerados Extracto de Lecitina Homogenizar 100 gr de Codium fragile en 400 ml de bufer salino Centrifugar la mezcla y separar el sobrenadante claro Extracto de Polifenoles Introducir 100 gr de Sargassum sp. (fresca) en un cartucho de extracción Armar equipo soxhlet y someter a reflujo con metanol al 85% (aprox 125 ml), durante 6 horas Evaporar el metanol casi a sequedad y diluir el extracto con 10 ml de bufer salino Prueba de Hemaglutinación Preparar una suspensión al 4%, en bufer salino, de eritrocitos de diferentes tipos sanguíneos Preparar dos series de tubos (Lecitina y Polifenoles) y trasferir 5 ml de cada suspensión a su7 tubo de ensayo correspondiente Agregar a cada tubo 600 µl de extracto, según la serie; Lecitinas y/o Polifenoles. El tubo en el que sea muy evidente la precipitación de eritrocitos, se registra como prueba positiva. Observe si existe especificidad en la aglutinación de eritrocitos de distintos grupos 9.5. Registro de Datos Grupo Sanguíneo Extracto Lecitinas Polifenoles Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 81 9.6. Referencias para consulta Blunden,G. 1993. Marine algae as sources Interdisciplinary Science Reviews. 18(1):73-80. of biologically active compounds. Geiselman, J.A. O.J. McConell. 1981. Polyphenols in brown algae Fucus vesiculosus and Ascophyllum nodosum: Chemical defenses against the marine herbivorous snail, Littorina littorea. Journal of Chemical Ecology. 7(6):1115-1133. Haslam, E. 1996. Natural polyphenols (Vegetable tannins) as drugs: Possible modes of action. Journal of Natural Products. 59:205-215. Hori, K.; Miyazawa, K.; Ito, K. Some common properties of algae.Hydrobiologia. 1990, 204/205, 561-566. lectins from marine Rofers, D.J. G. Blunden. 1980. Structural properties of the Anti-B Lecitin from the red alga Pilota plumosa (Huds.) C. Ag. Botanica Marina. Vol.XXIII. pp.459-462. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Página 82 Práctica 10: Aplicaciones Esta hoja está esperando a que la llenes ejemplo: Elaboración de perlas de alginato como intercambiador iónico. Se sabe que los metales son esenciales para todos los seres vivos, sin embargo, cuando la concentración excede ciertos límites, pueden volverse tóxicos y peligrosos. Por esta razón se han ido implementando distintos métodos para remover tóxicos de ambientes o medios contaminados. La bio-absorción ha aplicado a este proceso y se refiere a la forma pasiva o no metebólica mediante la unión iónica a los grupos funcionales de la biomasa (Davis et al, 2003). En este estudio buscamos encontrar la capacidad que tiene el alginato de dos distintas especies en forma de pequeñas cápsulas de gel, de unirse o remover los cationes de Ca presentes en el medio; suponiendo que aquel presenta una mayor afinidad por los metales antes mencionados. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Polisacáridos algales Dr. Enrique Hernández Garibay Página 83 Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Anexos Página 84 Anexos RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO. TU ACTITUD Ocasionalmente los alumnos consideran que su trabajo consiste en seguir una receta de cocina y que llenar una hoja de resultados. Si esta es tu actitud, entonces pregúntate a ti mismo, “¿Estoy adquiriendo los conocimientos y habilidades que apoyen a mi formación y desarrollo en futuro?”. Regularmente durante el desarrollo de la práctica, tu instructor te preguntará “¿En qué paso vas?”, Si tú tienes que buscar la respuesta en el manual, quiere decir que no estás haciendo, completamente, bien tu trabajo. Procura llegar a tiempo, tú puedes ahorrar un valioso tiempo de laboratorio si estudias la práctica y si preparas tu material antes de llegar al laboratorio. El trabajo en equipo requiere cooperación y organización, se tomará en cuenta tu participación. No supervises el trabajo de los demás para que tú no hagas nada. No rompas la continuidad del trabajo, si requieres salir del laboratorio por alguna razón procura esperar cuando el proceso de trabajo lo permita o no tardes mucho si tus compañeros requieren de tu colaboración. Aunque, en algunas ocasiones es posible predecir, por los antecedentes, el resultado de nuestro trabajo en laboratorio. No consideres que un resultado, es incorrecto, solo por el hecho de contradecir esta expectativa, trabaja cuidadosamente y si tus resultados difieren de los antecedentes, repite el experimento o trata de tomar en cuenta que factores influyeron en tu “contradictoria” observación. En cualquier evento, cultiva la originalidad y la autoestima en tu trabajo. Tu instructor aceptara con gusto tus resultados y discusión, en el entendido que desarrollaste los experimentos como se indica en el manual y que tus resultados se basan en tu propia observación. COMPORTAMIENTO EN EL LABORATORIO La conducta en el laboratorio es más informal que en el salón de clases. Sin embargo, chiflar, gritar o cantar (mal), no está permitido. No fastidies a tu vecino por información. Si no puedes obtener las respuestas de tus observaciones, consulta a tu instructor. No tires sólidos en la tarja. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Anexos Página 85 Los sólidos y líquidos que se derramen en cualquier lugar del laboratorio deben de limpiarse inmediatamente. Normas Generales de Seguridad e Higiene 1. El uso de bata es obligatorio. 2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de seguridad disponibles. 3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos. 4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se esté en el laboratorio. 5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las salpicaduras de productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de las lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes. En estos casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de gafas de seguridad cerradas. 6. Sí un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción. Actúa siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta presión de agua de un grifo directamente al ojo porque podrías lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide asistencia médica. 7. El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son inevitables. 8. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias. 9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos químicos. 10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios. 11. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del laboratorio. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Anexos Página 86 12. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio. 13. Está prohibido fumar en el laboratorio por razones higiénicas y de seguridad. 14. No inhales, pruebes o huelas productos químicos si no estás debidamente informado. 15. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos. 16. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no absorber directamente con la boca. 17. Cuando caliente tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del líquido y con agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia ninguna persona. 18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del laboratorio. Sí tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales deben ser siempre transportadas cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la botella. 19. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos, bolsas, productos químicos vertidos. 20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar, etc. 21. No se puede hacer ningún experimento no autorizado. 22. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. 23. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes. 24. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto estado de uso. 25. Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias. 26. No inhales los vapores de productos químicos y trabaja siempre en vitrinas extractoras, especialmente cuando manipules productos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos. 27. Antes de dejar el laboratorio asegúrate que: (1) tu material y equipo está completo y en buen estado, (2) tu área de trabajo está limpia, (3) la tarja no tiene basura, (4) las llaves de gas y agua están cerradas, (5) los frascos de reactivos preparados y los desechos están bien cerrados y que los regresarás al almacén. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Anexos Página 87 Medidas Generales en Caso de Accidente Plan general de emergencia Dar la alarma. Ponerse a salvo. Ayudar a las personas. Luchar contra el fuego. Avisar al responsable del departamento. Evacuación del edificio en caso necesario. Avisar a ambulancias, bomberos. Fuego en el laboratorio Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o por la salida de emergencia, sí la principal está bloqueada. Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando siempre la calma. Sí el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado, arena cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue. Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente. Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, sí el fuego no se puede controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al servicio de extinción de incendios y evacuar el edificio. Fuego en el cuerpo Sí se te incendia la ropa, pide inmediatamente ayuda. Estírate en el suelo y rueda sobre ti mismo para apagar las llamas. No corras ni intentes llegar a la ducha de seguridad si no es que está muy cerca de ti. Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se está quemando, cúbrele con una manta antifuego, condúcele hasta la ducha de seguridad, si está cerca, hazle rodar por el suelo, no utilices nunca un extintor sobre una persona. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Anexos Página 88 Una vez apagado el fuego, mantén a la persona tendida, procurando que no coja frío y proporciónale asistencia médica. Quemaduras Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se tratarán lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos. Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata. No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves. Cortes Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el laboratorio. Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como mínimo. Sí la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y jabón y tápala con una venda. Sí la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica inmediata. Derrame de productos químicos sobre la piel Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15 minutos. Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en una pila. Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes posible mientras esté bajo la ducha. Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión de la herida. Proporcionar asistencia médica a la persona afectada. Corrosiones en la piel por ácidos y álcalis Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la ropa, lave con agua abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con bicarbonato de Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC Manual de Prácticas de Laboratorio de Fitoquímica Marina Anexos Página 89 sodio durante 15-20 minutos, sacar el exceso de pasta formada, seca y cubra la parte afectada con linimento óleo-calcáreo o parecido. Cuando se produce una corrosión por álcalis, lave la zona afectada abundantemente con agua corriente y aclárala con una disolución de ácido acético al 1%, seca y cubre la zona afectada con una pomada de ácido tánico. Corrosiones en los ojos En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se lave el ojo, menos grave será el daño producido. Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos como mínimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los ojos. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los párpados. Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión. Ingestión de productos químicos Antes de cualquier actuación pide asistencia médica. Sí el paciente está inconsciente, ponerlo en posición lateral de seguridad, con la cabeza de lado, y estirarle la lengua hacia fuera. Dr. Enrique Hernández Garibay Facultad de Ciencias Marinas de la UABC