5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 ETIOLOGÍA DE LA ENFERMEDAD “CLAVO DEL GUAYABO”. Rosaura Dorina Montiel-Montoya. Unidad Académica Agronomía, Autónoma de Zacatecas, Km 15.5 carr Zacatecas-Guadalajara Cieneguillas, Zac. CP 98600. J. Jesús Avelar Mejía. Unidad Agronomía, Universidad Autónoma de Zacatecas, Km 15.5 carr Guadalajara (vía corta). Cieneguillas, Zac. CP 98600. Universidad (vía corta). Académica Zacatecas- RESUMEN. La etiología de la enfermedad “clavo del guayabo” se estudio en condiciones de laboratorio, invernadero y campo. El patógeno asociado con esta enfermedad se aisló de frutos enfermos y se inoculó a frutos sanos desprendidos del árbol (laboratorio) y a frutos adheridos al árbol (invernadero y campo). Se encontró que el agente causal de la enfermedad “calvo del guayabo” es el hongo Pestalotia sp, según resultados de campo e invernadero. En laboratorio, no se logró reproducir a la enfermedad. Palabras clave adicionales: Guayabo, hongos, clavo del guayabo, Pestalotia sp. ABSTRACT. Guava canker etiology was studied under laboratory, greenhouse and field conditions. The associated pathogen with the disease was isolated from an infected fruit and inoculated to healthy fruits. The inoculation was made either to fruits fallen from the tree (laboratory) or to the ones still adhered to it (greenhouse and field). It was found that Pestalotia sp is the causal agent of guava canker, a fungal disease. The fungus infected fruits under greenhouse and field conditions, however fruits under laboratory conditions did not present the disease. Additional keywords: Guava, fungus, guava canker, Pestalotia sp 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 2 INTRODUCCION El guayabo (Psidium guajava L.), es uno de los frutales de mayor importancia en México; ocupa el segundo lugar a nivel mundial en superficie plantada (17, 664 ha) y en producción de fruta (209, 717 t). Los estados de mayor importancia en producción y superficie cultivada son Aguascalientes, Michoacán y Zacatecas. El área de producción de guayaba más importante en lo económico y en lo social del país, se localiza en el municipio de Calvillo, Ags y en el Cañón de Juchipila, Zac., que comprende los municipios de Apozol, Huanusco, Jalpa, Juchipila, Moyahua, Tabasco y Villanueva, la cual representa el 75% de la superficie dedicada a este frutal en México con un volumen de producción cercano al 84% y genera 326, 400 jornales anuales (SARH, 1996). La producción de fruta en promedio en la región Calvillo-Cañón de Juchipila es de 10-12 t/ha, la cual se considera baja; es probable que los factores que mayor influencia tienen en la reducción de la producción de guayaba son el manejo inadecuado del cultivo (fertilización, riego, estrés hídrico), los factores ambientales, las características de la planta, la presencia de plagas (Velázquez, 1979; Velázquez, 1989) y el ataque de enfermedades. Dentro de estas últimas, el clavo de la guayaba, se considera como un problema prioritario en la región y del cual se desconoce su agente causal. Los síntomas de la enfermedad se manifiesta en la epidermis de frutos jóvenes donde aparecen manchas circulares, levantadas, de consistencia corchosa y de color café las cuales impiden el desarrollo normal del fruto o bien, este se cubre de costras irregulares de color café constituidas por material descompuesto que en casos severos provocan la apertura del mismo. Los frutos atacados se momifican y se quedan adheridos a la planta. Las hojas presentan manchas de color café brillante tanto en los bordes como en su parte central. Los resultados del estudio de la etiología de la enfermedad no son concluyentes; algunos investigadores (Córdoba, 1963), consignan al hongo Pestalotia versicolor como el agente responsable de la inducción del clavo de la guayaba. En la India donde la enfermedad se conoce como roña, cáncer o “enfermedad blister”, se 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 3 considera que es ocasionada por el efecto de insectos y hongos y se reporta la asociación Pestalotia psidii, Glomerella cingulatum y Gnoesporium psidii, éstos dos últimos se les estima como parásitos débiles, y su daño ocurre después del ataque de la chinche Heliopeltus antonii (Hayes, 1960). Das (1993), reportó la presencia de un hongo asociado al guayabo y que no había sido consignado con anterioridad en la India y lo identifico como Pestalotia sapotae. Otros estudios con relación a esta enfermedad son los de Tsay (1991) quien aisló e identificó a Pestalotiopsis psidii como causante de pudriciones de frutos de guayabo en Taiwan. Ramaswany et al, en 1984 estudiaron la germinación de las esporas de Pestalotia psidii y mencionaron que es el responsable del cáncer de la guayaba, en un trabajo posterior (Ramaswany et al, 1988) estudiaron el rango de hospederos de Pestalotia psidii y de nueva cuenta indicaron que se trata del agente causal del cáncer de la guayaba y al mismo tiempo evaluaron fungicidas contra este patógeno. Patel y Patel (1988), reportan a Pestalotia psidii como el hongo más frecuentemente aislado de guayabas en poscosecha y que ocasionó pudrición seca y momificación de frutos atacados. En México se reporta como agente causal del clavo de la guayaba al hongo Pestalotia sp (Laksminarayana y Moreno, 1978) y a Colletotrichum gloesporoides (González y Perales, 1994), pero ninguno de estos trabajos describen pruebas de patogenicidad; por otra parte, Nieto (1996) aíslo al hongo Pestalotia psidii en la región de Uruapan, Mich., al realizar pruebas de patogenicidad en campo no se logro reproducir los síntomas ocasionados por la enfermedad. En Calvillo, Ags., este mismo autor aisló al hongo Alternaria sp de frutos de guayabo con síntomas de clavo, pero tampoco reprodujo los síntomas típicos de la enfermedad. García et al (1998), en Sinaloa aislaron a Pestalotia sp causando daños en frutos de guayabo en poscosecha, los síntomas que el hongo ocasionó en frutos sanos que fueron inoculados no correspondieron a los ocasionados por el clavo de la guayaba. Con base en la información anterior y debido a que en la región Calvillo-Cañón de Juchipila no se tiene información que verifique con seguridad el agente causal de la enfermedad “clavo de la guayaba” se planteo el presente trabajo con el objetivo 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 4 de determinar su etiología, en la región Calvillo-Cañón de Juchipila. La hipótesis de trabajo fue que el clavo de la guayaba es una enfermedad ocasionada por un microorganismo patógeno. MATERIALES Y METODOS Localización del área de estudio La investigación se realizó en campo con productores de guayaba de los estados de Zacatecas y Aguascalientes y en el laboratorio de fitopatología de la Unidad Académica de Agronomía de la UAZ. El área de estudio se localiza en la región Calvillo-Cañón de Juchipila ubicada al sur de los estados de Aguascalientes y Zacatecas entre 21º-04’ a 22º-13’ de latitud norte y a 102º-43’ a 103º-42’ de longitud oeste, con una altitud que varía de 1100-2800 msnm (INEGI, 1986). El clima de esta región es BS hw (w) (e), con una temperatura media de 18-22º C, humedad relativa de 60% y precipitación pluvial de 600-700 mm (García, 1973). Aislamiento del patógeno Frutos de guayaba atacados por la enfermedad “clavo de la guayaba” se colectaron de huertos de Zacatecas y el municipio de Calvillo, Ags. Los frutos se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% durante dos minutos, las lesiones ocasionadas por la enfermedad se desprendieron y se sembraron en el medio de cultivo PDA. Frutos completos y desinfestados, se colocaron en cámara húmeda durante 5-7 días, los crecimientos fungosos que se obtuvieron se sembraron en PDA. Los aislamientos obtenidos, en ambos casos, se clasificaron de acuerdo a sus características morfológicas con la ayuda de claves taxonómicas especializadas (Barnett y Hunter, 1972). De los aislamientos obtenidos, y una vez caracterizados, se tomaron rodajas de cuatro milímetros de diámetro, se coloco una en cada matraz (10 en total), que contenían 50 ml del medio de cultivo líquido papa-dextrosa acidificado; enseguida, se pusieron en agitación constante durante 5-10 días a 100-200 rpm. Pasado este 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 5 tiempo el contenido de cada matraz se filtro en manta de cielo con el objeto de separar los conidios del micelio del hongo. Los conidios obtenidos se sembraron en PDA y una vez que germinaron se sembraron en cajas Petri con PDA para así obtener cultivos monospóricos. Pruebas de patogenicidad Frutos de plantas de guayabo jóvenes y sanas se inocularon con los aislamientos fungosos que se encontraron asociados con frutos atacados por el “clavo de la guayaba”. El inoculo que se utilizó fue cultivo monospórico de siete días de edad. La inoculación se hizo en laboratorio, invernadero y campo, y se utilizaron los métodos siguientes: 1) mediante una inyección de 1 ml de una suspensión de 1000 esporas por ml y otros tres frutos con 1 ml de agua destilada estéril como testigo. Los frutos inoculados se cubrieron con tela de tul que permitía la aireación pero no el paso de insectos. La humedad se proporcionó mediante un trozo de algodón que se humedecía diariamente con agua destilada estéril. 2) se inocularon discos con micelio y conidios de 4 mm diámetro que se colocaron en el interior de los frutos a una profundidad de 5 mm. La herida se cubrió con cellotape, según la metodología que propone Schiffman et al, 1985). 3) los frutos se desinfestaron con alcohol al 95%, en cada uno de ellos se ocasionaron heridas con una aguja estéril y se inocularon rociando sobre ellos un spray concentrado de 1000 conidios/ml. En tres frutos más se siguió el mismo procedimiento y se rociaron con agua destilada estéril. 4) los frutos seleccionados se inocularon con una suspensión 1000 conidios/ml y discos de micelio de 4 mm de diámetro que se colocaron en una incisión superficial que se les practicó con una aguja desinfestada a la flama. Antes de la inoculación la superficie del fruto a ser tratada se desinfestó con alcohol al 95%. En cada punto de inoculación se cubrió con un trozo de papel filtro estéril y este a su vez con un rectángulo de papel estaño que se perforo en su centro. El papel estaño se fijo al fruto con cinta adhesiva, se selló en sus cuatro lados y se cubrió 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 6 con una película de papel parafilm. La región inoculada se humedecio, aplicando en el papel filtro, agua destilada estéril que se introdujo levantando el parafilm. Se realizaron cinco evaluaciones, a los 8, 15, 22, 29 y 36 días después de la inoculación. Los frutos que mostraron síntomas, se desinfestaron y la lesión que presentaban se separo y sembró en PDA con el objetivo de aislar el patógeno que fue inoculado. En laboratorio se inocularon 48 frutos de guayabo los cuales se desprendieron del árbol cuando estos aún no llegaban a su madurez (color verde), 24 de ellos se inocularon crecimientos fungosos del hongo Pestalotia sp y el resto con agua destilada estéril; el experimento se realizó en dos ocasiones. Invernadero. Se utilizaron árboles jóvenes y sanos de guayabo obtenidos por acodo aéreo, el patógeno asociado con esta enfermedad se inoculó en tres frutos de guayabo jóvenes sin llegar a madurez (color verde), otros tres frutos con características similares se inocularon con agua destilada estéril (testigo). En total se inocularon 36 frutos provenientes de diversas plantas, 18 de ellos con el hongo Pestalotia sp y el resto con agua destilada estéril (testigo). El experimento se realizó en dos ocasiones Campo. Se seleccionaron dos huertos de guayabo uno en el municipio de Apozol y otro en Tabasco Zac. En cada huerto se seleccionaron cinco árboles que no presentaron síntomas de la enfermedad “calvo de la guayaba”. En cada árbol se inocularon 8 frutos que aún no habían alcanzado la madurez y cuyo diámetro fue de 10-15 mm. Los frutos seleccionados se desinfestaron con alcohol al 95%, en cuatro de ellos, se practico una incisión superficial con una aguja esterilizada y se coloco una porción de micelio y conidios de un cultivo monospórico de siete días de edad. En el resto de los frutos se siguió la misma metodología y se aplico agua destilada estéril. Los frutos inoculados se etiquetaron y se cubrieron con tela de tul. Pasado 15 días, los frutos se desprendieron del árbol, en laboratorio se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% durante dos minutos, se desprendió la región que mostró síntomas de la enfermedad y se sembraron en PDA con el objeto de recuperar al hongo que se utilizó en la inoculación. 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 7 RESULTADOS Y DISCUSION En el presente trabajo se aisló al hongo Pestalotia sp, de frutos que presentaron la sintomatología típica de la enfermedad “clavo del guayabo”. En frutos verdes esto fue posible cuando se sembraron en el medio de cultivo PDA lesiones ocasionadas por este hongo que se tomaron de la parte inmediatamente abajo de la lesión corchosa característica, en tanto que en frutos maduros se obtuvo al aislar y sembrar en PDA agregaciones compactas de conidios que se forman alrededor de la lesión corchosa. Los crecimientos fungosos que se obtuvieron fueron de un color blanco-cremoso de aspecto algodonoso que se observa por la parte superior de la caja Petri, en tanto que por abajo, presenta una coloración más oscura (café claro). El hongo cubre por completo una caja de Petri de 9 cm de diámetro en un tiempo aproximado de 15 días cuando las cajas se incubaron a una temperatura de 2226oC, en tanto que cuando se pone a crecer a temperaturas mayores de 30o C, el crecimiento es muy lento. Sobre el crecimiento fungoso y dentro de este, se presentan puntos de color negro brillante y de consistencia dura y que solo aparecen cuándo el hongo a cubierto perfectamente la caja Petri Los puntos de color negro brillante de consistencia dura y algunos de ellos húmedos corresponden a grupos de conidios del hongo. Los conidios son alargados y multiseptados, en su mayoría presentan de 3-5 células y las de ambos extremos son hialinas en tanto que las otras son de color oscuro. El conidio presenta dos apendices en uno de los extremos y solo uno en el otro y también son hialinos en tanto que el resto del conidio es de color oscuro, estas agrupaciones de conidios se podrían considerar como un acervulo pero que al crecer en un medio sintético su crecimiento es amorfo y crecen de manera delimitada con el resto del micelio del hongo. No se determinó el porque en algunas ocasiones se produce una gran cantidad de estos en tanto que en otras cajas son de mayor tamaño pero en número reducido. Estas características corresponden al género Pestalotia sp, según lo indican varios investigadores. 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 8 Las pruebas de patogenicidad que se realizaron en laboratorio no fueron satisfactorias. Sólo en dos y tres frutos respecto al experimento 1 y 2 se logró reproducir los síntomas de la enfermedad lo que corresponde a una eficiencia de 8.3 y 12.5% respectivamente; además, los síntomas que se observaron correspondieron a una necrosis alrededor de la lesión corchosa que no corresponde a los síntomas típicos de la enfermedad, sin embargo al realizar los reaislamientos se logró recuperar al hongo que se había inoculado. Los frutos utilizados como testigos, no presentaron ningún síntoma. Es probable que las condiciones ambientales en especial temperatura humedad y luminosidad que prevalecieron en el laboratorio durante el tiempo en que se llevo el experimento (solo se midió temperatura y fue de 19-21o C), no son las que requiere el patógeno. En invernadero en ambos experimentos se logró reproducir los síntomas que ocasiona la enfermedad en porcentajes elevados; en el primer experimento la eficiencia fue de 44% y en el segundo ésta aumentó a 67%, lo que indica la posibilidad de que el hongo Pestalotia sp es el causante de la enfermedad “clavo de la guayaba”, los frutos que resultaron infectados se llevaron al laboratorio para reaislar al patógeno inoculado y de ellos se logro obtener al hongo Pestalotia sp. En los frutos que se utilizaron como testigo (agua destilada estéril), no apareció ningún tipo de síntoma. Los resultados obtenidos en invernadero se corroboraron con los obtenidos en campo donde también se realizaron dos experimentos. Los síntomas ocasionados por el hongo se empezaron a observar a partir de la segunda semana, 42 días después de la inoculación los frutos se desprendieron y se llevaron al laboratorio. En el municipio de Apozol, Zac. , de los 20 frutos inoculados con Pestalotia sp, en 15 de ellos se logro reproducir la enfermedad y de estos se logró reaislar al hongo que fue inoculado, del resto de frutos inoculados, tres se perdieron antes de hacer la evaluación y dos más se momificaron, de estos últimos no se recupero el patógeno inoculado. En ninguno de los testigos se observó algún tipo de daño. Resultados similares se obtuvieron en Tabasco, Zac., aunque el porcentaje en que se reprodujo la sintomatología ocasionada por el “calvo de la guayaba” fue 5as Jornadas de Investigación Universidad Autónoma de Zacatecas 25 al 29 de Junio del 2001 Trabajo: AP/UAGRO-06/006 9 ligeramente menor. De los 20 frutos inoculados, solo 11 presentaron los síntomas típicos de la enfermedad y de ellos también se logró recuperar al patógeno que se inoculó, cinco frutos se perdieron antes de la evaluación y el resto no produjeron síntoma alguno. Los frutos que se utilizaron como testigo no presentaron ningún tipo de síntoma. A la fecha se esta trabajando con la determinación de la especie involucrada. CONCLUSIONES Se encontró al hongo Pestalotia sp, como el agente causal de la enfermedad clavo del guayabo. Pestalotia sp, crece bien en PDA a una temperatura de 22-26oC y su crecimiento se ve limitado cuando esta aumenta a 30 o C o más. El hongo presenta conidios con dos apendices en uno de los extremos y solo uno en el otro y son hialinos en tanto que el resto del conidio es de color oscuro Los conidios crecen agrupados y se cree que constituyen al acervulo del hongo pero como se encuentra en un medio sintético su crecimiento es amorfo LITERATURA CONSULTADA Barnett, H. L., and Hunter, B. 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