TRABAJO PRÁCTICO N° 2 ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA

TRABAJO PRÁCTICO N° 2
ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA -AMILASA (PARTE I)
OBJETIVO: Investigar y analizar el comportamiento de la -amilasa frente a diferentes
temperaturas y pH
1. INTRODUCCIÓN
La actividad de una enzima puede evidenciarse ya sea registrando la aparición de un
producto o bien la desaparición de un sustrato. Para esto pueden usarse tests colorimétricos en
donde la actividad enzimática puede detectarse a través de cambios en la coloración en el producto
final de la reacción.
Investigar la actividad de una enzima implica determinar cuáles son las condiciones óptimas
para su actividad: pH, temperatura, concentración de sustrato y concentración de producto.
La -amilasa es una enzima que degrada el almidón, principal polisacárido de reserva de las
plantas. El almidón está compuesto por monómero de glucosa.
La -amilasa rompe uniones entre los carbonos de dos glucosas. Por lo tanto, usando
almidón como sustrato, libera como productos polisacáridos compuestos por unas pocas unidades
de glucosa, en general disacáridos como la maltosa
En este TP, para analizar la actividad de la -amilasa, vamos a usar un test colorimétrico
que permite revelar la presencia de almidón en una solución de Iodo (lugol). Es decir que se
verificará la reacción de la enzima cuantificando la cantidad de almidón que se halla coloreado, esto
implica que se cuantifica el sustrato que queda remanente después de exponer la enzima ya que el
producto de la reacciónque es la maltosa, no se tiñe.
La reacción estudiada es:
ENZIMA
SUSTRATO-------------------------PRODUCTO
AMILASA
ALMIDÓN--------------------------MALTOSA
El almidón en presencia del lugol presenta una coloración azulada debido a la interacción
física entre el iodo y las moléculas de almidón. Cuando la -amilasa degrada el almidón, elimina
esa propiedad de interactuar con el iodo y, por lo tanto, de presentar coloración azulada.
Se trata de determinar cual es la temperatura y pH óptimos de esta enzima. Para esto se
realizaran, diferentes pruebas en las que se cambiaran estas variables de manera independiente.
 Formule la pregunta de investigación, la hipótesis correspondiente y sus predicciones. (El
docente a cargo formulará una pregunta de investigación como ejemplo y el alumno otra)
De acuerdo con lo explicado una forma de medir la actividad enzimática es a través de los
cambios en la coloración. Esto se puede medir utilizando un colorímetro.
¿Qué es un colorímetro?
Es un equipo de medición que “mide” o cuantifica la densidad o coloración de una muestra
obviamente coloreada. Esta medición se realiza haciendo pasar un haz de luz con determinada
longitud de onda sobre la muestra. La idea final es que si la muestra es muy coloreada (muy densa)
pasara poca luz, y por el contrario, si es poco coloreada, pasara mucha.
El colorímetro que se utilizara es de marca Vernier. La densidad óptica se mide a través de
la Absorbancia que tiene la muestra. La absorbancia es una medida adimensional (sin unidades)
cuyo valor indica la cantidad de luz que absorve la muestra.
Si se expone una determinada concentración de enzima (que se mantiene constante) a una
determinada concentración de almidón (que se mantiene constante) pero a diferentes temperaturas,
y observo la absorbancia, puedo determinar la temperatura óptima de la enzima.
Por el docente
 Pregunta de investigación:
 Hipótesis:
 Predicciones:
Por el alumno
 Variable indepenpendiente
 Variable dependiente
 Listar todas las variables de control (se mencionan dos en el texo y faltan otras dos)
 Indicar MÉTODO que utilizará para controlar las variables de control.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
-Solución de Almidón 1g/L (pH = 3;4;7; y 10)
-Solución de Almidón 1g/L ( TºC= 38, 45, 50 y 65)
-Lugol (stock)
-Pipeta graduada de 1 y 5 ml
-Vaso de precipitados
-H20 Destilada
-Vernier LabQuest y colorímetro
-Piseta
-Mechero
-Trípode
-Tela metálica
-Matraz 50 y 10ml
-Preparado enzimático 1,4g/10ml
-Cronómetro
2. 1 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
Métodos
Cubeta
Lugol (+ 0.01 ml)
H2O destilada (+0.1ml)
Almidón* (+0.05ml)
Preparado Enzimático (+ 0.01ml)
Cultivo Enzimático
0.05
0
2.7
0.3
Blanco
0.05
2.7
0
0.3
Tabla 1: Protocolo para la cuantificación de la enzima amilasa.*: Utilizar almidón de un pH adecuado.
-Colocar inmediatamente el colorímetro y medir la absorbancia a 635 nm a tiempo cero y registrar
el valor en una tabla, disparar un cronómetro y colocar la enzima en baño térmico (a la temperatura
adecuada).
-A los 6 minutos del baño térmico, secar la cubeta, y medir absorbancia y registrar el valor en una
tabla.
-Realizar 5 réplicas.
2.2 Efecto del pH sobre la actividad enzimática
Si se expone una determinada concentración de enzima (que se mantiene constante) a una
determinada concentración de almidón (que se mantiene constante) pero a diferentes pH y observo
la absorbancia, puedo determinar el pH óptimo de la enzima.
A partir de lo explicado anteriormente INDICAR:
Variable indepenpendiente
Variable dependiente
Listar todas las variables de control (se mencionan dos en el texo y faltan otras dos)
Indicar MÉTODO que utilizará para controlar las variables de control.
Métodos
Para esta parte, realizar el mismo procedimiento que en el punto anterior pero utilizando las
soluciones de almidón a distinto pH sin utilizar el baño, simplemente dejándolo reposar a
temperatura ambiente.
En TODOS los casos (ya sea que se trabaje sobre variaciones del pH o variaciones de la
temperatura) se colocarán en la cubeta los siguientes reactivos en el orden indicado y luego el
tapón.
-No agregar el preparado enzimático (último paso) sin consultar previamente al docente o al
ayudante.
Resultados
-Realizar un gráfico de actividad de la enzima en función de la temperatura y en función del pH
-Se considera pH =7 y temperatura = 50ºC como condiciones estándar, si se trabaja analizando la
variación en el pH se fija la temperatura e 50ºC (se coloca la cubeta en baño térmico a 50ºC) y si se
trabaja analizando la variación en la temperatura se fija el pH en 7 (se utiliza solución de almidón a
pH = 7)