PRÁCTICA 6 - biblioteca upibi

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
INOCUIDAD ALIMENTARIA
PRÁCTICA 6
ENTEROCOCOS
1. OBJETIVOS
a)
El alumno conocerá la normatividad oficial y la importancia de la
determinación de Enterococos en alimentos frescos y/o precesados.
b)
El alumno conocerá la metodología establecida para la determinación
de Enterococos en alimentos frescos y/o precesados.
c)
El alumno aplicará las técnicas oficiales para la identificación y
cuantificación de Enterococos en muestras de alimentos procesados
y/o frescos.
d)
El alumno interpretará la presencia de Enterococos como indicadores
de malas prácticas de manufactura y calidad sanitaria.
2. INTRODUCCIÓN
Enterococcus es un género de bacterias del ácido láctico de la división
Firmicutes. Los miembros de este género fueron clasificados como Grupo D
Streptococcus hasta 1984 cuando los análisis de ADN genómicos indicaron que
un género separado era más apropiado.
Los Enterococcus son cocos Gram positivos, catalasa negativa, inmóviles,
anaerobios facultativos y no forman endosporas ni cápsulas. Entre las
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características fisiológicas que distinguen al género Enterococcus se encuentra
la habilidad para crecer en presencia de 6.5% de NaCl; a 10°C y 45°C y pH 9.6.
Son capaces de hidrolizar la esculina en presencia de 40% de bilis. Típicamente
exhiben gamma-hemólisis en agar sangre de cordero.
Desafortunadamente, no existe una característica de las mencionadas que sea
única para este género; las cepas de bacterias en forma de cocos, Gram
positivos y catalasa negativa de los géneros Streptococcus, Lactococcus,
Aerococcus, Gemella, Leuconostoc y Lactobacillus pueden mostrar una o más
de las características típicas del Enterococcus.
Dos especies son organismos comensales en el intestino de humanos: St.
faecalis y St. faecium. El Enterococcus es un organismo facultativo anaeróbico,
i.e. prefieren usar oxígeno, pero sobreviven bien en su ausencia.
Importantes infecciones clínicas causadas por Enterococcus incluyen la vejiga,
bacteremia, endocarditis, diverticulitis, y meningitis. Especies sensibles de estas
bacterias pueden tratarse con ampicilina y vancomicina.
Los alimentos de origen animal o vegetal obtenidos por fermentación pueden
tener unos contenidos muy altos en Enterococcus del grupo D que están
presentes como flora natural. En cualquier caso, números excesivamente altos
de estos microorganismos pueden causar problemas toxicológicos porque son
productores de aminas vasopresoras.
3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR
a)
¿En que medios se puede aislar Enterococcus? Indique cuales son los
macronutrientes en dichos medios. Discuta.
b)
Menciona que alimentos pueden presentar Enterococcus y por que se
encuentran en estos.
4. MATERIALES Y REACTIVOS
Autoclave u Horno a 180°C
Balanza digital
Cuenta colonias
Potenciómetro
Refrigerador
Incubadora a 352°C
4 cajas Petri
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1 pipetero metálico
1 cilindro metálico para cajas Petri
4 pipetas de 2 mL
4 pipetas de 10 mL
1 probeta de 250 mL
1 vaso de precipitados de 500 mL
1 espátula
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL
4 frascos de dilución
1 mechero
1 soporte
1 varilla
Benzal
Regulador de pH
Agua destilada
4 frascos con 90 ml de agua peptonada al 0.1%
1 matraz con 200 ml de agar etil violeta (EVA)
1 matraz con 200 ml de agar púrpura de bromocresol
Leche
Queso fresco
Yogurt
Jamón
Queso de puerco
Agua
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL
5.1. CUANTIFICACIÓN DE Enterococcus POR LA TÉCNICA DE
VACIADO EN PLACA
a) Pesar 10 gramos del alimento en condiciones de esterilidad.
b) Hacer lavados de las muestras en agua peptonada al 0.1%.
c) Realizar diluciones hasta 10-4 (según se requieran) en frascos que
contengan 90 ml de agua peptonada al 0.1%.
d) Colocar 1 ml de la dilución que le indiquen en una caja de Petri y realizar
el procedimiento por duplicado.
e) Agregar de 12 a 15 ml de agar etil violeta, mantenido a 45°C.
f) Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el
sentido de las manecillas del reloj, 6 en el sentido contrario y 6 de atrás a
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adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr un completa
incorporación del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la
cubierta de la caja.
NOTA: El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora
al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no
debe exceder de 20 minutos.
g) Dejar solidificar.
h) Incubar las cajas en posición invertida, entre 24 y 48 horas a 352°C.
i) Contar las colonias que se encuentren en un intervalo de 15 a 150 UFC.
j) Calcular el número bacterias por mililitro o por gramo de producto,
multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución
correspondiente.
5.2.
RECUENTO DE Enterococcus EN PLACA
Solución diluyente agua peptonada al 0.1%. Aplicar el método de vaciado en
placa con Agar púrpura de bromocresol; después de solidificar el medio. Incubar
a 352°C durante 48 horas.
a) Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado
como: menos de una bacteria del género Enterococcus por 1/d por gramo,
en donde d es el factor de dilución.
b) En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa
“No desarrollo de Enterococcus por mililitro”.
c) Informar UFC/g o ml en agar púrpura de bromocresol, incubadas a
352°C durante 48 horas.
6. INFORME DE RESULTADOS
a) Analizar la presencia o ausencia de Enterococcus.
b) Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos y los
objetivos de la práctica.
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7. BIBLIOGRAFÍA
a) Fernández, E.E. 2000. Microbiología e inocuidad de los alimentos.
Universidad Autónoma de Querétaro. México. Pags. 48-51.
b) Fischetti V. A.; Novick R. P.; Ferretti J. J.; Portnoy D. A.; Rood J. I. 2000.
Gram-Positive Pathogens. ASM Press.
c) NOM-109-SSA1-1994 Bienes y Servicios. Procedimiento para la toma,
manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico. Secretaría de Salud. México.
d) NOM-110-SSA1-1994 Bienes y Servicios. Preparación y dilución de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaría de
Salud. México.
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