investigación sobre la etiologia, manejo y control integrado

INVESTIGACIÓN SOBRE LA ETIOLOGIA, MANEJO Y CONTROL
INTEGRADO DE HONGOS FITOPATÓGENOS DEL SUELO QUE LIMITAN
LA PRODUCCIÓN DE MELÓN EN COLIMA
INTRODUCCIÓN
LA MARCHITEZ DEL MELóN (CUCUMIS MELO L.) FUE DESCRITA POR
PRIMERA VEZ EN AMéRICA DEL NORTE POR LEACH Y CURRENCE EN 1938,
IDENTIFICáNDOSE A FUSARIUM OXYSPORUM F. SP. MELONIS , COMO EL
AGENTE CAUSAL DE ESTA ENFERMEDAD (SNYDER Y HANSSEN, 1940). EL
PATóGENO SUELE PROVOCAR GRAVES EFECTOS SOBRE EL CULTIVO Y SI
BIEN EXISTE RESISTENCIA VARIETAL BASADA EN DOS GENES, éSTA ES
PARCIAL PUESTO QUE SE HA RECONOCIDO LA EXISTENCIA DE POR LO
MENOS CUATRO RAZAS DEL PATóGENO (RISSER ET AL., 1976), LO QUE HA
DETERMINADO LA CONSTANTE BúSQUEDA DE NUEVAS FUENTES DE
RESISTENCIA COMO ESTRATEGIAS DE CONTROL. DENTRO DE ESTE
CONTEXTO, EL CONOCIMIENTO DE LAS ESTRUCTURAS DE LAS
POBLACIONES DEL PATóGENO, ES DECIR, EL CONOCIMIENTO DE SU
DIVERSIDAD GENéTICA Y FENOTíPICA, Y SUS CAMBIOS EN EL TIEMPO Y
ESPACIO, SON ELEMENTOS DE RECONOCIDA IMPORTANCIA PARA UN
MANEJO EFICIENTE DE LA ENFERMEDAD.
ANTECEDENTES
COLIMA ES UNO DE LOS PRINCIPALES PRODUCTORES DE MELON
CON 50 TON/HA, EN LOS QUE RECIENTEMENTE SE HA VISTO AFECTADA
SU PRODUCCIóN DEBIDO A PROBLEMAS DEL SUELO OCASIONADOS POR
EL COMPLEJO DE FUSARIUM OXYSPORUM. LA NECEDIDAD DE NUEVAS
TECNICAS DE CULTIVO MAS AMIGABLES CON ELMEDIO AMBIENTE Y LA
POSIBILIDAD DE INCREMENTAR LA COMPETITIVIDAD EN LA
EXPORTACIóN DEL MELóN, MEDIANTE LA PALICACIóN DE INGERTOS Y EL
CONTROL Y MANEJO DE ENFERMEDADES RADICULARES MEDIANTE LA
APLICACION DE CONTROLADORES BIOLóGICOS REPRESENTA UN
IMPORTANTE RETO PARA POSICIONAR A COLIMA COMO LIDER EN LA
PRODUCCION Y EXPORTACION DE MELON EN MéXICO.
PROBLEMÁTICA
UNA PRIMERA CONDICIóN EN ESTUDIOS EPIDEMIOLóGICOS O DE
POBLACIONES, ES LA CORRECTA IDENTIFICACIóN DEL PATóGENO
AISLADO. PARA IDENTIFICAR ESPECIES DEL GéNERO FUSARIUM SE HAN
PROPUESTO DIFERENTES SISTEMAS TAXONóMICOS, LOS CUALES SE
BASAN PRINCIPALMENTE EN CARACTERES MORFOLóGICOS, TALES COMO
TAMAñO Y FORMA DE MACROCONIDIAS; TAMAñO, PRESENCIA O
AUSENCIA DE MICROCONIDIAS; FORMACIóN DE CLAMIDOSPORAS Y
ESTRUCTURA DE CONIDIóFOROS ( WINDELS, 1992). SIN EMBARGO,
MUCHAS VECES, ESPECIES MUY RELACIONADAS ENTRE Sí DIFIEREN EN
UN SOLO CARáCTER, FORMA DE LA CONIDIA O CONIDIóFORO, POR
EJEMPLO, LO QUE PUEDE INDUCIR A UNA MALA IDENTIFICACIóN.
POR OTRA PARTE, LA APLICACIóN DE ESTA TéCNICA TRADICIONAL
ES LABORIOSA Y REQUIERE DE GRAN CANTIDAD DE MATERIAL, LO QUE
DIFICULTA LA IDENTIFICACIóN DE UN GRAN NúMERO DE MUESTRAS A LA
VEZ QUE REQUIERE DE GRAN EXPERIENCIA TAXONóMICA PARA
OBTENER RESULTADOS CORRECTOS. ESTA LABOR PODRíA COMPLICARSE
DEBIDO A LA ALTA VARIABILIDAD MORFOLóGICA QUE PRESENTAN
AISLAMIENTOS DE FUSARIUM EN CULTIVOS DE LABORATORIO.
OBJETIVOS
1. AISLAR UN COMPLEJO DE HONGOS FITOPATÓGENOS QUE AFECTEN
EL CULTIVO DE MELÓN EN LOS MUNICIPIOS DE COLIMA,
IXTLAHUACÁN, TECOMÁN, ARMERÍA, COMALA Y VILLA DE
ÁLVAREZ.
2. IDENTIFICAR TAXONOMÍA Y DIVERSIDAD MOLECULAR DEL
COMPLEJO DE HONGOS FITOPATÓGENOS.
3. EVALUAR VARIEDADES DE MELÓN RESISTENTES Y SUSCEPTIBLES
AL COMPLEJO DE HONGOS FITOPATÓGENOS.
4. UTILIZAR INJERTOS Y CONTROL BIOLÓGICO COMO ALTERNATIVAS
DE RESISTENCIA AL COMPLEJO DE HONGOS FITOPATÓGENOS.
5. TRANSFERIR LA TECNOLOGÍA A LOS PRODUCTORES DE MELÓN EN
COLIMA.
JUSTIFICACIÓN
LAS TéCNICAS MOLECULARES, PRINCIPALMENTE AQUELLAS
BASADAS EN ANáLISIS DE DNA, CORRESPONDEN A METODOLOGíAS MáS
RáPIDAS, PRECISAS, OBJETIVAS Y APLICABLES A UN GRAN NúMERO DE
MUESTRAS. ESTE TIPO DE METODOLOGíAS PERMITE DIFERENCIAR
GENOTIPOS Y DE ESTA FORMA ESTABLECER LA VARIABILIDAD
GENéTICA EXISTENTE DENTRO DE UNA POBLACIóN.
UNA METODOLOGíA DE ANáLISIS DE ADN DENOMINADA RAPD
(RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA, WILLIAMS ET AL., 1990)
GENERA PATRONES DE BANDAS QUE CORRESPONDEN A FRAGMENTOS
DE ADN, ALGUNOS DE LOS CUALES SON COMPARTIDOS POR UN GRUPO
DE GENOTIPOS, ESTANDO AUSENTES EN OTROS. ESTE TIPO DE
POLIMORFISMO GENéTICO PERMITE DESARROLLAR MARCADORES
MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACIóN DE INDIVIDUOS, REALIZAR
MAPEO GENóMICO Y REALIZAR ESTUDIOS DE GENéTICA DE
POBLACIONES (EDEL ET AL., 1995; MACDONALD, 1997).
EN EL CASO DEL GéNERO FUSARIUM SE HA UTILIZADO LA
METODOLOGíA DE RAPD PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE
POBLACIONES DE DIVERSAS FORMAS ESPECIALES. ESTA METODOLOGíA
HA PERMITIDO ENCONTRAR MARCADORES MOLECULARES PARA
IDENTIFICAR ESPECIES TALES COMO F. AVENACEUM, F. CULMORUM, F.
GRAMINEARUM (SCHILLING ET AL., 1996), F. POAE (PARRY Y NICHOLSON,
1996) Y AISLAMIENTOS PERTENECIENTES A LA RAZA 2 DE F. OXYSPORUM
F. SP. DIANTHI (MANULIS ET AL., 1994).
EL OBJETIVO ESPECíFICO DE ESTE ESTUDIO SERA EVALUAR LA
METODOLOGíA DE RAPD PARA LA IDENTIFICACIóN DE ESPECIES DE
FUSARIUM PATóGENAS PARA MELóN (CUCUMIS MELO L.) Y COMPARAR
SUS RESULTADOS CON LA METODOLOGíA TRADICIONALMENTE
EMPLEADA,
BASADA
EN
CARACTERES
MORFOLóGICOS.
ADICIONALMENTE A ESTO, SE EVALUARA LA DIVERSIDAD GENéTICA
EXISTENTE EN UN GRUPO DE AISLAMIENTOS IDENTIFICADOS COMO F.
OXYSPORUM F. SP. MELONIS
MATERIALES Y MÉTODOS
EL MATERIAL EXPERIMENTAL SERá COLECTADO EN LOS CULTIVOS
COMERCIALES DE MELóN ESTABLECIDOS EN LOCALIDADES DE
TECOMAN, IXTLAHUACAN. EL MATERIAL COLECTADO SERA A TEJIDO
RADICULAR FINO, TEJIDO RADICULAR GRUESO Y TEJIDO DE VASOS
CONDUCTORES (CUELLO, CORONA Y TALLO), CON SíNTOMAS DE
INFECCIóN.
AISLAMIENTO Y MANTENCIóN DEL PATóGENO.
LOS PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA EL AISLAMIENTO DE
FUSARIUM SP. SE REALIZARAN DE ACUERDO A LA METODOLOGíA
DESARROLLADA Y UTILIZADA POR EL FUSARIUM RESEARCH CENTER DE
LA UNIVERSIDAD DE PENNSYLVANIA (NELSON ET AL., 1983; BURGESS ET
AL., 1994). EL TEJIDO RADICULAR FINO DE PLANTAS DE MELóN SERá
ESTERILIZADO PARCIALMENTE CON HIPLOCLORITO DE NA AL 2%,
MEDIANTE LAVADO CONTINUO EN AGUA CORRIENTE, ENJUAGADO EN
AGUA ESTéRIL TRES VECES Y SECADO EN FLUJO LAMINAR DE AIRE
ESTéRIL. EL TEJIDO RADICULAR MáS GRUESO Y EL MATERIAL
PROVENIENTE DE CUELLO, CORONA Y TALLO FUE ESTERILIZADO
SUPERFICIALMENTE EN UNA SOLUCIóN DE ETANOL POR 1 MIN, PARA
POSTERIORMENTE SER TRATADO EN UNA SOLUCIóN DE HIPOCLORITO DE
SODIO AL 5 %, ENJUAGADO 3 VECES EN AGUA ESTéRIL PARA SECAR
POSTERIORMENTE EN FLUJO DE AIRE LAMINAR ESTéRIL. UNA VEZ
DESINFECTADOS, PEQUEñOS TROZOS DE TEJIDO RADICULAR (CON O SIN
CORTEX) Y SEGMENTOS DE TEJIDO CONDUCTOR OBTENIDO A NIVEL DE
CUELLO Y TALLO, SERAN SEMBRADOS SOBRE MEDIO DE CULTIVO AGAR
PAPA DEXTROSA (APD) E INCUBADOS A 25°C DURANTE 7 DíAS.
DESDE CADA UNA DE LAS COLONIAS OBTENIDAS SE REALIZARON
CULTIVOS MONOSPóRICOS. PARA ESTO, SE UTILIZó MEDIO DE CULTIVO
AGAR AGUA AL 1,5%, ADICIONADOCON SULFATO DE ESTREPTOMICINA
(0,5 G L-1), SOBRE EL CUAL SE COLOCARON 6 GOTAS DE AGUA ESTéRIL EN
LAS QUE SE HA DISGREGADO Y HOMOGENEIZADO MICELIO DEL
PATóGENO. DESPUéS DE UN PERíODO DE INCUBACIóN DE 24 H A 25°C, SE
DETERMINó PRESENCIA DE CONIDIOS GERMINADOS BAJO LUPA
ESTEREOSCóPICA (40X). MEDIANTE EL USO DE AGUJA HISTOLóGICA, UN
CONIDIO FUE TRANSFERIDO A UN TUBO DE ENSAYO CONTENIENDO
MEDIO DE CULTIVO AGAR CLAVEL Y GUARDADO EN REFRIGERADOR A
5°C HASTA SU UTILIZACIóN EN PRUEBAS DE PATOGENICIDAD E
IDENTIFICACIóN. PARA ALMACENAMIENTOS PROLONGADOS, LOS
AISLAMIENTOS SERAN GUARDADOS COMO SUSPENSIóN DE ESPORAS EN
20% DE GLICEROL A -20°C.
IDENTIFICACIóN TAXONóMICA DE LOS AISLAMIENTOS DE FUSARIUM
PARA LA IDENTIFICACIóN TAXONóMICA DE LOS AISLAMIENTOS SE
EMPLEARA COMO BASE METODOLOGíAS Y CLAVES DE IDENTIFICACIóN
ELABORADAS POR NELSON ET AL. (1983), LAS CUALES CONSIDERAN LA
OBSERVACIóN DE CARACTERíSTICAS MICROSCóPICAS, MEDIANTE LA
TéCNICA DE MICROCULTIVO EN CáMARA HúMEDA. EN CADA PLACA
PETRI SE COLOCA UN DISCO DE PAPEL FILTRO, UNA VARILLA DE VIDRIO
EN FORMA DE U Y UN PORTAOBJETO. UN TROZO DE AGAR CLAVEL
SóLIDO DE 1 CM2 X 2 MM DE ESPESOR, LOS CUALES SE COLOCARAN EN EL
CENTRO DEL PORTAOBJETO APOYADO EN LA VARILLA DE VIDRIO. SE
INOCULARON LOS 4 LADOS DEL BLOQUE DE AGAR CLAVEL CON
MATERIAL PROVENIENTE DE CULTIVO MONOSPóRICO DE CADA UNO DE
LOS AISLAMIENTOS A IDENTIFICAR Y SE CUBRIó CON UN CUBRE OBJETO
DE MAYOR TAMAñO QUE EL TROZO DE AGAR. SOBRE EL PAPEL FILTRO SE
AGREGAAN 2 ML DE AGUA DESTILADA Y SE INCUBARON A 25°C.
DIARIAMENTE SE REALIZARON OBSERVACIONES BAJO MICROSCOPIO
CON EL OBJETO DE DETERMINAR PRESENCIA DE CADENAS DE
MICROCONIDIOS, TIPO DE FIáLIDES Y PRESENCIA O AUSENCIA DE
CLAMIDOSPORAS. PARA OBSERVAR CARACTERíSTICAS MORFOLóGICAS
DE CADA COLONIA, DESDE CULTIVO MONOSPóRICO SE INOCULARON
PLACAS CONTENIENDO PDA Y SE INCUBAN A 25°C.
IDENTIFICACIóN DE F. OXYSPORUM F. SP. MELONIS.
PARA DETERMINAR LA FORMA ESPECIAL DEL PATóGENO SE
UTILIZó LA METODOLOGíA PROPUESTA POR JACOBSON Y GORDON (1988).
PARA ESTO, SE INOCULóA UNA SUSPENSION DE CONIDIAS 1X10 6 EN LOS
SIGUIENTES HOSPEDEROS: (CUCURBITA. MOSCHATA) (C. PEPO), SANDíA
(C. LANNATUS), PEPINO (C. SATIVUS ) MELóN (C. MELO ). EL MATERIAL SE
MANTIENE BAJO INVERNADERO EN CONDICIONES CONTROLADAS DE
TEMPERATURA Y HUMEDAD RELATIVA (25°C Y 85% DE HR) Y SE
OBSERVA LA PRESENCIA DE MARCHITES EN CADA CASO. EN LAS
PLANTAS CON SINTOMAS SE REAISLARA EL PATOGENO PARA
COMPROBAR LOS POSTULADOS DE KOCH.
OBTENCIóN DEL DNA FUNGICO.
CADA AISLAMIENTO SERA CULTIVADO POR 3 DíAS EN MEDIO
LíQUIDO EN AGITACION A 200 RPM Y 23ºC. LOS CULTIVOS SE REALIZARON
EN MATRACES ERLENMEYER DE 100 ML CONTENIENDO 40 ML DEL
SIGUIENTE MEDIO DE CULTIVO: GLUCOSA 3%, KH2PO4 0,3%, MGSO4 0,03%,
CASOAMINOáCIDOS 0,5%, EXTRACTO DE LEVADURA 0,1% Y EXTRACTO
DE MALTA 0,1%. CADA MATRAZ SERA INOCULADO CON MICELIO Y
ESPORAS DEL HONGO PREVIAMENTE CULTIVADO EN AGAR CLAVEL Y
COLECTADOS CON UN ASA BACTERIOLóGICA. EL MICELIO OBTENIDO SE
COLECTA POR FILTRACIóN, LSE LAVA CON AGUA EN NITROGENO
LIQUIDO Y EL DNA GENóMICO SE EXTRAíDO UTILIZANDO EL MéTODO
DESCRITO POR LEE Y TAYLOR (1990). LA CALIDAD DEL ADN OBTENIDO
SERá ANALIZA ELECTROFORéTICAMENTE EN GELES DE AGAROSA AL 0,8%
EN SB Y CUANTIFICADO ESPECTROFOTOMéTRICAMENTE A 260 NM
(SAMBROOK ET AL., 1989).
SE AMPLIFICARA LA REGION ITS DE CADA AISLAMIENTO, EL
PRODUCTO DE AMPLIFICACION SERá LIGADO AL VECTOR PGEM-T Y
CLONADO EN E. COLI. EL PLASMIDO PURIFICADO SERA SECUENCIADO Y
CADA SECUENCIA SERá DEPOSITDA EN EL GENEBANK.
CONDICIONES DE LAS REACCIONES DE RAPD.
LOS INICIADORES SERáN ADQUIRIDOS EN LA EMPRESA OPERON
TECHNOLOGIES INC. (ALAMEDA, CALIFORNIA, USA),SE PROBARAN LAS
SERIE OPA Y OPB. LAS REACCIONES DE AMPLIFICACIóN (EN UN VOLUMEN
DE 25 M L),CONSTARA DE 20 NG DE DNA Y 2 U DE TAQ DNAPOL. SE
EMPLEARA UN TERMOCICLADOR TECHNE PROGRAMADO A 35 CICLOS DE
1 MIN A 94 OC, 1 MIN A 36 OC Y 2 MIN A 72 OC
ANáLISIS DE LAS BANDAS POLIMóRFICAS.
EL PERFIL DE BANDAS QUE GENERE CADA INICIADOR FUE
ANALIZADO PARA CADA AISLAMIENTO MEDIANTE EL REGISTRO PARA
PRESENCIA ("1") O AUSENCIA ("0") DE BANDAS DE DNA DE TAMAñO
SIMILAR. EL CRITERIO UTILIZADO PARA IDENTIFICAR UNA BANDA COMO
POLIMóRFICA FUE SU PRESENCIA O AUSENCIA EN FORMA CONSISTENTE
EN DOS AMPLIFICACIONES INDEPENDIENTES. ESTOS RESULTADOS
PERMITIRAN CONSTRUIR UNA MATRIZ BINARIA QUE COMBINE TODOS
LOS POLIMORFISMOS DETECTADOS EN LOS AISLAMIENTOS EN ESTUDIO.
ESTA MATRIZ SERá
ANALIZADA UTILIZANDO EL SOFTWARE
COMPUTACIONAL NTSYS 2.0 (ROHLF, 1996).
PARA CADA PAR DE AISLAMIENTOS SE DETERMINó EL GRADO DE
SIMILITUD UTILIZANDO EL COEFICIENTE DE SIMILITUD DE JACCARD,
DICE O PARA LUEGO CONSTRUIR UN DENDROGRAMA MEDIANTE EL
ALGORITMO UPGMA.
IMPACTO AMBIENTAL
MEDIANTE EL USO DE INJERTOS O CONTROL BIOLÓGICO SE ELIMINARÁ
EL USO DE BROMURO DE METILO EN LOS CULTIVOS, EL CUAL ES
ALTAMENTE TÓXICO PARA EL SER HUMANO, ADEMÁS DE FLORA Y
FAUNA.
TAMBIÉN SE DISMINUIRÁ EL USO DE PESTICIDAS O FUNGICIDAS QUE
DAÑAN LA FLORA MICROBIANA DEL SUELO.
IMPACTO ECONÓMICO
LOS COSTOS POR EL USO DE BROMURO DE METILO SE ELIMINARÁN, Y
SE DISMINUIRÁ EL COSTO DEL USO DE PESTICIDAS, AMBOS SE UTILIZAN
EN LA ACTUALIDAD PARA COMBATIR LA PRESENCIA DE HONGOS
FITOPATÓGENOS.
IMPACTO SOCIAL
MAYOR CONFIANZA Y SEGURIDAD DE LOS TRABAJADORES DE CAMPO
POR LA AUSENCIA DE BROMURO DE METILO Y PESTICIDAS.
VENTA DE MELÓN SIN RESIDUOS DE BROMURO O PESTICIDAS.
IMPACTO TECNOLÓGICO
DESARROLLAR METODOLOGÍA PARA AISLAR E IDENTIFICAR HONGOS
FITOPATÓGENOS DEL MELÓN DE FORMA MOLECULAR
TRANSFERIR TECNOLOGÍA EN EL USO DE INJERTOS Y CONTROL
BIOLÓGICO EN EL CULTIVO DE MELÓN.
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