INDICE DISEÑO DEL MEDIO 5

INDICE
1. ANTECEDENTES
1
2. PROBLEMÁTICA
1
3. JUSTIFICACIÓN
2
4. ALCANCE
2
5. OBJETIVOS
2
5.1 OBJETIVO GENERAL
2
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2
6. HIPÓTESIS
2
6.1 HIPÓTESIS NULA
2
6.2 HIPÓTESIS ALTERNA
2
7. MARCO TEÓRICO
3
7.1 CARACTERÍSTICAS DEL TOMATE RIÑÓN
3
7.2 CARACTERISTICAS DEL MICROORGANISMO ANTAGONISTA
3
8. MARCO METODOLÓGICO
4
8.1 METODOS DE AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y
PRESERVACION DE LAS CEPAS DE TRICHODERMA
4
8.2 DISEÑO DEL MEDIO
5
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
6
10. ANEXOS
7
1
TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DEL TRICHODERMA
COMO AGENTE DE BIOCONTROL DE MICROORGANISMOS QUE ATACAN A
CULTIVOS DE TOMATE RIÑON.
1. ANTECEDENTES
La mayoría de las enfermedades de plantas generalmente se controlan con fungicidas
químicos, los cuales se aplican al suelo, semillas, follaje y fruto. El control biológico
utiliza organismos vivos, involucra también microorganismos cuya actividad biológica
disminuye el daño causado por los patógenos de las plantas.
El tomate riñón se cultiva en casi todo el mundo, convirtiéndose en una de las
hortalizas de mayor importancia comercial tanto por su nivel de consumo, que es
alrededor del 48.43%, y sus características nutricionales como fuente valiosa de
vitaminas y sales minerales.
La producción en el Ecuador de tomate riñón en el 2005 fue de 58778 has, las plagas
destruyen anualmente cerca del 35% de las cosechas.
Los cultivos de tomate son atacadas por microorganismos fúngicos: Phytophthora
Infestans, Alternaria solani, Ascochyta lycopersici, Oidium sp., Fusarium oxysporum
f.sp., Verticillium alboatrum, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Colletotrichum,
Macrophomina phaseolina, y bacterias: Corynebacterium michiganense, Erwinia
carotovora, Pseudomonas solanacearum, que se controlan con una amplia variedad
de fertilizantes.
El género Trichoderma es un hongo anaeróbico facultativo, habitante natural del suelo
de pH 6-7, que contiene materia orgánica mayor al 2%; tiene la capacidad de
sobrevivir en el habitad donde es cultivado el tomate, en climas cálidos, templados a
24ºC - 25ºC y 50% - 60% de humedad.
Algunas de sus especies tienen la habilidad de producir metabolitos secundarios, que
se originan a partir de intermediarios del metabolismo primario y son clasificados
según su precursor. El acetil es el compuesto intermediario del metabolismo
secundario de los hongos filamentosos productores de terpenos (carotenoides,
ergosterol, acido giberélico), derivados de ácidos grasos (poliacetileno), de derivados
de aminoácidos (alcaloides, penicilina, cefalosporina) y por último de policétido.
La combinación de pequeñas cantidades de antibióticos y enzimas líticas de
Trichoderma inhiben la germinación de esporas y elongación del tubo germinal del
hongo huésped. Cuando Trichoderma se pone en contacto con hifas de otro
organismo susceptible, tiende a segregar sustancias supresoras de crecimiento, que
hacen que el otro organismo detenga su crecimiento, como enzimas que atacan o
inhiben a los hongos fitopatógenos y que lo hacen un excelente agente de biocontrol.
2. PROBLEMÁTICA
La necesidad de reducir el uso de fungicidas en el control fitosanitario hace necesario
desarrollar tecnologías que permitan de forma fácil, económica y efectiva obtener
productos a partir de microorganismos, con la calidad y cantidad suficiente para su
aplicación masiva en áreas de cultivo.
En el Ecuador el rendimiento del país es apenas de 88.933 kilogramos/ hectárea
frente 252.688 kilogramos/ hectárea que constituye la media del Continente
2
Americano, lo que hace necesario innovar nuevas tecnologías para mejorar la
producción.
En Cuba a partir de 1990 se iniciaron estudios para el biocontrol de hongos en los
suelos de hortalizas, obteniendo así aislamientos del Trichoderma que fueron
seleccionados por su capacidad hiperparásita.
3. JUSTIFICACIÓN
En el Ecuador se cultiva tomate bajo condiciones ambientales adversas, con
incidencias de plagas, organismos patógenos y poblaciones de malas hierbas, siendo
el costo de producción USD 900 por tonelada métrica, con una pérdida económica de
USD 315, además, un alto porcentaje de los costos de producción está relacionado
con la compra y aplicación de insumos, entre ellos los agroquímicos, productos que los
tomateros usan de una manera excesiva y que, además de encarecer los costos de
producción, causan serios disturbios al medio ambiente y a la salud de los
consumidores y de los mismos productores, lo que se puede contrarrestar con
sistemas de agricultura orgánica, como el uso de biofertilizantes, minimizando el uso
de agroquímicos a corto y mediano plazo.
Con el biocontrol se busca la regulación de la abundancia de organismos indeseables
a través de la autodefensa y la competencia de la planta con organismos patógenos y
su tasa de producción sana.
4. ALCANCE
Aislamiento, selección y preservación del Trichoderma
comportamiento con microorganismos antagonistas.
para
evaluar
su
5. OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar el antagonismo entre el Trichoderma y los microorganismos causantes
de enfermedades en el tomate riñón.
5.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS




Aislar los microorganismos fúngicos a partir del suelo donde se cultiva el
tomate.
Identificar y seleccionar la mejor cepa del género Trichoderma.
Determinar el antagonismo mediante enfrentamiento dual de Trichoderma vs.
Microorganismos patógenos.
Preservar las cepas de mejor efecto antagónico aplicando la técnica de
crioconservación.
6. HIPOTESIS
6.1 HIPOTESIS ALTERNATIVA
Los metabolitos producidos por las cepas obtenidas del Trichoderma, inhiben el
crecimiento de microorganismos que atacan al tomate riñón.
3
6.2 HIPOTESIS NULA
Los metabolitos producidos por las cepas obtenidas del Trichoderma, no inhiben el
crecimiento de microorganismos que atacan al tomate riñón.
7. MARCO TEORICO
7.1 CARACTERÍSTICAS DEL TOMATE RIÑÓN
Las enfermedades del tomate se producen por varios microorganismos, para este
problema se utilizan organismos biocontroladores de enfermedades como
Trichoderma.
El tomate tiene nutrientes que ayudan a que estos hongos crezcan; su composición
química promedio es la siguiente:
Tabla 1. Composición Química del Tomate por cada 100g de Tomate Fresco
ELEMENTO
CANTIDAD
Agua
93.5 %
Proteína
0.9 g
Grasa
0.1 g
Carbohidratos
3.3 g
Fibra
0.8 g
Fósforo
19 mg
Calcio
7 mg
Hierro
0.7 mg
Vitaminas A, B1, B2
1.2 mg
Vitamina C
20 mg
Niacina
0.6mg
Fuente: California Tomato Board, U.S.
Departament of Agriculture, 2000
7.2 CARACTERISTICAS DEL MICROORGANISMO ANTAGONISTA
Tabla 2. Metabolitos y Necesidades Mínimas del Trichoderma para Producción de
Biomasa
Grupo Trófico
Fuente de Carbono
Fuente de Energía
Donador de electrones
Aceptor de electrones
Fuente de Nitrógeno
Quimioheterótrofa
Peptona
Dextrosa
Dextrosa
Oxígeno
Peptona
Estos hongos antagonistas actúan mediante la ruptura de paredes hifales del hongo
fitoparásito, penetrando sus hifas y aprovechando sus nutrientes. Produce toxinas
como tricodermin y harzianopeiridona causando antagonismo por fungistasis y también
produciendo enzimas líticas que destruyen las paredes celulares de los esclerocios o
estructuras de resistencia del hongo. El Trichoderma ha desarrollado mecanismos
para atacar y parasitar a otros hongos y así, aprovechar una fuente nutricional
adicional. Las formas de acción de trichoderma como biocontrolador son:
1. Micoparasitismo y Antibiosis
2. Competición por nutrientes y espacio
4
3. Desactivación de las enzimas de los patógenos
4. Tolerancia al estrés por parte de la planta, al ayudar al desarrollo del sistema
radicular.
5. Solubilización y absorción de nutrientes inorgánicos
6. Resistencia inducida
8 DISEÑO DEL MEDIO
FUENTE
COMPUESTO
CANTIDAD
Fuente de C
500 ml
Fuente de N
Extracto de cáscaras
de tomate (Peptonas)
Fuente de Energía
Dextrosa
10 g
Agar-Agar
Agente solidificante
17.0
Agua
Agua destilada
1000 ml
pH ≈ 7.2
Tabla 3. Características del medio diseñado
AGAR DEXTROSA
Todos los medios de cultivo utilizados han de contener los nutrientes suficientes para
asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrógeno, vitaminas,
oligoelementos, etc).
El Agar Dextrosa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras. Este
medio es utilizado para el cultivo de hongos patógenos, la alta concentración de
dextrosa y el pH ligeramente ácido facilita el crecimiento de los hongos e inhibir al
mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos.
Con la adición de antibióticos antibacterianos (cloranfenicol o gentamicina), se logra la
inhibición de bacterias saprofitas, se obtiene un excelente medio para el aislamiento.
Se prepara con cáscara de tomate como base; en este medio las peptonas proveen la
fuente de carbono y nitrógeno para el crecimiento de los microorganismos, la dextrosa
actúa como fuente de energía y el agar es agregado como agente solidificante.
PEPTONAS
Es un producto soluble en agua que se obtiene por hidrólisis particularmente de una
proteína o varias proteínas. Este material contiene una mezcla de aminoácidos libres,
péptidos y proteosas que se mantienen en la solución después de calentarlas
a 100º C. La presencia de metales alcalinos o fosfatos puede causar la precipitación
de la peptona a un pH neutral. Por ésta razón las peptonas producidas a un pH neutro
se deben de utilizar para las fórmulas de los medios.
En general las proteínas empleadas en la producción de peptonas son de dos tipos,
proteínas animales (caseína, gelatina, carne) y proteínas vegetales (cascaras de
tomate). Las peptonas se obtienen a través de varios tipos de procesos de digestión
como ácido, alcalino y enzimático.
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DEXTROSA
Los seres heterótrofos, como los animales, son incapaces de realizar este proceso y
toman la glucosa de otros seres vivos o la sintetizan a partir de otros compuestos
orgánicos. Otra posibilidad es la síntesis de glucosa a partir de moléculas no
glucídicas, proceso conocido como gluconeogénesis. Este azúcar simple es derivable
de la conversión de almidón.
METODOLOGIA
1. TOMA REPRESENTATIVA DEL SUELO
Las muestras se toman aleatoriamente del perfil del suelo aledaño a la base de las
plantas de tomate, de 0 a 40 cm de profundidad.
2. CONTROL BIOLÓGICO (CULTIVOS DUALES)
En un extremo de la placa de petri con Agar Dextrosa de pH 5,5, se coloca un disco de
agar de 4 mm de diámetro con micelio del patógeno y en el extremo opuesto otro disco
de 4 mm con micelio del antagonista a 5 cm aproximadamente entre ellos; el cultivo se
incuba a 25±1 ºC durante 5 días, haciéndose mediciones cada 24 h del crecimiento
radial del micelio de la colonia de los hongos.
El antagonismo se comprueba por la competencia de nutrientes y espacio, se valora
comparando las variables en la velocidad del crecimiento, por medio de:
Radio de Crecimiento Antagonista (RCA) y Radio de Crecimiento Patógeno
(RCP): midiendo los radios con un calibrador o pie de rey.
Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR): se medirá empleando la
fórmula
PICR = (R1 – R2)/R1 x 100 donde R1 es el radio del patógeno testigo y
R2 es el radio del patógeno en enfrentamiento.
Micoparasitismo (MICMO): se realizan observaciones macroscópicas de los cultivos
duales, tomándose como índice de micoparasitismo, la invasión del antagonista sobre
la superficie del micelio patógeno, teniéndose en cuenta la escala siguiente:
Esporulación de antagonista sobre patógeno1
Grado
0
1
2
3
4
Capacidad antagónica
Ninguna invasión de la superficie de la colonia del hongo patógeno
Invasión de ¼ de la superficie de la colonia del hongo patógeno
Invasión de ½ de la superficie de la colonia hongo patógeno
Invasión total de la superficie de la colonia del hongo patógeno.
Invasión total de la superficie de la colonia del hongo patógeno
esporulación sobre ella.
Se comprueba micoparasitismo, por medio un microscopio binocular, con aumento de
100x, donde se analizan las interacciones de las hifas antagonistas con las del
patógeno, ya sea por enrollamiento o por penetración.
1
Elías y Arcos (1984) citada en Ezziyyani et al. (2004)
6
3. MÉTODO ECOMÉTRICO
Este método utiliza un procedimiento normalizado de siembra en estrías para obtener
una dilución progresiva de una suspensión de prueba de un microorganismo en una
placa del medio que se está colocando a prueba.
Se evalúa la recuperabilidad, selectividad y reproducibilidad del medio.
También se puede utiliza para determinar la acción inhibitoria del medio selectivo
contra el organismo determinando la proporción del ICA en el medio selectivo y el ICA
en un medio no selectiva óptimo de crecimiento (a esto lo denominó Mossel como el
índice de crecimiento relativo, o ICR). Es importante en el caso de los medios
selectivos demostrar un ICA alto para un organismo deseado frente a un ICA bajo de
los organismos no deseados.
Procedimiento.
1. Se dividen las placas en cuatro cuadrantes marcados sobre la base de la caja de
petri.
2. Depositar el medio de cultivo a evaluar en una capa cuyo grosor deberá ser de
unos 4 mm.
3. A partir de cada uno de los cultivos en fase exponencial (mantenidos en
crecimiento toda la noche o 18 horas de incubación), tome con una asa calibrada
de 1 microlitro y trace sobre la superficie del medio 5 estrías paralelas a las líneas
dibujadas en cada cuadrante y una estría central, de forma progresiva y sin
recargar, retorcer, repisar o esterilizar el asa. Hacer lo mismo con el medio de
referencia.
4. Incubar las placas en posición invertida por el tiempo necesario y a la temperatura
apropiada.
5. Transcurrido el tiempo, efectuar la lectura de las cajas, teniendo en cuenta que
cada estría tiene un valor de 0.2 y la estría central de 1.0.
6. Multiplicar por el número de estrías en las cuales se observa crecimiento, y
determinar el Índice de crecimiento absoluto (ICA). Si hay crecimiento en las cinco
estrías de los cuatro cuadrantes y la estría central (1), el ICA es igual a 5. El ICA es
igual al número del cuadrante cuando todas las estrías de este y de los cuadrantes
anteriores muestren un crecimiento completo, mientras no se observe crecimiento
en ninguna estría del cuadrante siguiente.
7. Efectuar la misma operación con el medio de referencia. Una vez obtenida las
lecturas en cada medio (ICA), sacar el Índice de Crecimiento Relativo (ICR),
comparando el ICA del medio en evaluación y el medio de referencia.
ICR
ICA m edioevaluado
ICA m edioreferencia
4. ESTRIADO
El objetivo es esta técnica es extender lo más posible el inoculo con el fin de obtener
colonias aislada.
1° Paso: tomar y descargar el Inoculo 0.1 ml en el primer plano de nuestro estriado, a
continuación con una pipeta.
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2° Paso: Sin levantar luego estriar el segundo plano perpendicular a nuestro primer
estriado, y repetir lo mismo con el último estriado logrando completar todo el espacio
de la placa.
3º Paso: Incubar: 7 días a 27º C.
5. Metodología para el aislamiento de bacterias patógenas que atacan al tomate
riñón
Se debe tomar las partes afectadas del tallo, hojas y fruto; almacenar en las fundas
plásticas.
Tomar las muestras y cortar alrededor de treinta pedazos, poner en vasos de
precipitación y dejar reposar por treinta minutos con una solución de agua-cloro (2:1).
Lavar con agua destilada tres veces. Sembrar los pedazos en cajas petri con medio
PDA.
Incubar por 5 días a 37º C.
Observar el crecimiento en las cajas petri de todas las cajas y seleccionar los hongos
de importancia, observar su morfología en el microscopio.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Improvement of Trichoderma strains for biocontrol (Mejora de cepas de
trichoderma para su empleo como biofungicidas), M Rey, J Delgado-Jarana, AM
Rincón, MC Limón & T Benítez http://www.reviberoammicol.com/search/index.php
2. Study of the effect of volatile metabolites of Trichoderma hamatum on the growth of
phytopathogenic soilborne fungi (Efecto de los metabolitos volátiles de
Trichoderma sobre el crecimiento de hongos fitopatógenos procedentes del suelo),
GM
Dal
Bello
GM,
CI
Mónaco
&
AR
Cháves
http://www.reviberoammicol.com/search/index.ph
3. Trichoderma Controls Fusarium Wilt Disease in Tomato Plants in Soilless Culture
Through Competition (Trichoderma control de Fusarium en enfermedades de la
planta del tomate), Guillem Segarra, Eva Casanova, Manuel Avilés and
Isabel Trillas,
http://www.springerlink.com/content/d5581727x37h2202/?p=727eb9c105a341afa7f
a8adb210b30c8&pi=5
4. http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/ad/ad_457.pdf
5. http://www.agro.unalmed.edu.co/publicaciones/revista/docs/Art.AntagonismoInVitro
deTrichoderma.pdf
6. ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/a1374s/a1374s02.pdf
7. http://www.sica.gov.ec/agronegocios/Biblioteca/Convenio%20MAG%20IICA/produc
tos/tomate_mag.pdf
8. STANIER, R., y otros, Microbiología, Editorial Reverte, cuarta edición, España,
1985.
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