memoria met bio cel

INTRODUCCIÓN
Las células con las que vamos a trabajar son MCF7 y CHO.
Las MCF7 son células tumorales de mama de una línea estable, obtenidas de efusión pleural de una
paciente con carcinoma mamario metastásico [SOU84]. Se caracterizan por poseer interacciones
célula- célula, en cultivo, formando agregados muy compactos:
Las CHO son células de ovario de hámster chino:
Antes de comenzar con cada uno de los experimentos, vamos a realizar una breve explicación
del uso de algunos materiales del laboratorio, que usaremos en las prácticas cuando sean
necesarios, así como algunos de los productos que usaremos habitualmente.
Materiales de laboratorio:
- Estufa ; existen varios tipos de estufas:
Incubador de CO2 se encuentra a 37℃ y 5% de CO2 , lo usamos para incubar los
cultivos en su ambiente óptimo de Tª y concentración de gases, así como el
grado de humedad. Para el uso de esta estufa, hay que tener en cuenta siempre el
el estado en el que se encuentra la bombona de gas y la bandeja de agua.
Estufa común, el cual no tiene asociado ningún tipo de mecanismo para
1
introducción de gases, solo regula la Tª y el grado de humedad.
- Centrífuga; se utiliza para decantar el contenido sólido, en este caso las células, que se
encuentran solubles en una disolución. Nosotros en la mayoría de los casos vamos utilizarla a
1000 rpm durante 5 min.
- Baño térmico; lo utilizamos para adecuar la Tª de los productos que vamos a utilizar durante
la realización de los distintos experimentos. Normalmente debe de mantenerse a 37℃.
- Campana de flujo laminar; Su función es la de mantener un área libre de partículas,
especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo.
Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un
filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared
frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del 99.999 % retiene las partículas por debajo
de un cierto calibre que es en general de 0.2 mm. En la Figura 2.1 se representa una sección de
filtro HEPA. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas
partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro
HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de
calor (mecheros Bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de
convección.
- Autoclave; Un autoclave es un dispositivo que sirve para esterilizar material médico o de
laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura para ello. El fundamento del
autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y
temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos microorganismos, así como
los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave.
2
- Microscopios; hemos usado tanto el microscopio óptico común como el invertido y de
contraste de fase .
Medio de cultivo :
MEM con .292g/L L Glutamina, 1g /L Glucosa, 2.2g/L NaHCO3
- 450ml Minimum Essential Medium w/ Earle’s salt (Life Technology 11095-080)
- 50ml Fetal bovine serum (Life Technology 16000044 and Hyclone Characterized)
-5ml Penicillin/Streptomycin (100x) (Life Technology 15140-122 or Sigma P4333) 10,000
mcg/ml Streptomycin; 10,000 units/ml penicillin “G”
- 5ml Sodium Pyruvate
PBS:
El PBS es el tampón fosfato que te permite llevar el pH a 7 esto se hace gracias a que el fosfato
( PO4 3-) es capaz de captar o dar 3 protones con sus equilibrios, además el tampón lleva
solución salina y agua, a veces se le agrega un acido fuerte para estabilizarlo. Normalmente en
nuestro laboratorio se encuentra de forma no estéril y a una concentración 5x, para pasarlo a
concentración 1x, usamos 400 ml de agua destilada y 100 ml de PBS 5x.
Nosotros usamos este tampón para lavar las células, como disolvente para otras sustancias como
tripsina etc.
Siempre debemos de recordar que ha de estar estéril, para ello lo autoclavamos durante 20 min.
a 120℃.
Tripsina:
La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis
para formar péptidos o aminoácidos de menor tamaño. En nuestro caso, utilizamos una dilución
de tripsina, para degradar las proteínas de la superficie celular que, entre otras cosas, tendrá
como consecuencia que las células que se encuentran adheridas a un soporte sólido, se
despeguen y así poder disponer de ellas. Para diluir la tripsina usamos PBS (45 ml) + tripsina
(una alícuota de 5 ml)
3
Precauciones en el uso del laboratorio:
-
-
Para el buen funcionamiento del incubador de CO2 , es conveniente que se mantengan
las condiciones de esterilidad, así como las de Tª y nivel de CO2, por ello es
recomendable no mantener la puerta abierta durante mucho tiempo.
Es conveniente antes de introducir las manos en la campana pulverizarlas con etanol, así
como todos los objetos.
Cuando vallamos a desechar un cultivo, no tirar por el desagüe, echar antes lejía.
Conectar la luz ultravioleta, antes y después de usar la campana, es otro paso mas de
esterilización
NO INTRODUCIR LAS MANOS CON LA LUZ UV CONECTADA!!! y por supuesto,
tampoco nuestro cultivo de células.
Echar los productos químicos de desecho, a su correspondiente bote de residuos.
Saber anticiparse a las situaciones y preparar los materiales de cada práctica.
Lavado y cambio de medio:
Las células consumen el medio de cultivo en 2-3 días, originándose metabolitos
tóxicos, cambios en el pH y acumulo de detritus celulares, por lo cual procedemos a su
limpieza y renovación de medio de cultivo tres veces por semana.
Se aspira la totalidad del medio. A continuación, cubrimos las células con una
solución salina tamponada. Nosotros usamos PBS:
NaCl............................ 4 gr.
KCl ............................. 0,1 gr.
Na2HPO4 · 12 H2O ..... 1,2 gr.
KH2 PO4 ...................... 0,1 gr.
H2O hasta ................... 500 ml.
Es recomendable esta solución porque no contiene glucosa y puede ser esterilizada
por autoclave. Seguidamente, aspiramos la solución e incorporamos medio nuevo a temperatura
adecuada cubriendo toda la superficie celular.
Subcultivos celulares:
El subcultivo implica desprender las células desde su sustrato y transferirlas a un
nuevo recipiente de cultivo. Esto se hace cuando las células han utilizado la superficie de
crecimiento disponible para ellas o se ha alcanzado una densidad de población que suprime su
crecimiento. Debido a que la capacidad replicativa de una población celular cultivada declina
cuando se alcanza la confluencia (inhibición por contacto), las células deben ser transferidas en
"semiconfluencia," cuando todavía están en la fase de crecimiento.
Para despegar las células de la superficie de cultivo empleamos el método de
digestión parcial de la membrana celular por una enzima proteolítica. Nosotros usamos la
tripsina y la preparamos en una solución salina tamponada (PBS), sin Ca++ ni Mg++, en
combinación con EDTA (agente quelante de cationes divalentes responsables de la adhesión)
del siguiente modo: 5 ml. de tripsina-EDTA 10X (Gibco) en 45 ml. de PBS. Luego se ajusta el
pH entre 7,2 y 7,8. Así, conseguimos una concentración final de 0,5% de tripsina y 0,2% de
EDTA.
Para subcultivar procedemos del siguiente modo:
- Retiramos por aspiración el medio de cultivo.
- Lavamos las células completamente con PBS y lo retiramos por aspiración.
- Añadimos la solución de tripsina a 37º C (2,5 ml. en placas; 5 ml. en botellas
4
grandes; 1 ml. en botellas pequeñas) y la introducimos en el incubador durante 3 a 4
minutos.
- Observamos frecuentemente las células en el microscopio invertido para controlar
su despegamiento. Cuando la mayoría de las células están redondeadas y flotando,
damos golpes secos al frasco para que se desprendan el resto de células. Añadimos
medio de cultivo (el doble que de tripsina) para frenar la reacción proteolítica.
- Aspiramos el contenido con una pipeta y lo transferimos a un tubo de ensayo.
- Centrifugamos a 800 r.p.m. durante 5 minutos.
- Retiramos el sobrenadante por aspiración y resuspendemos el precipitado (pellet)
con medio pipeteando varias veces para que se disgreguen bien las células.
- Dividimos el contenido para pasarlo a otras placas, ya preparadas con medio.
- Introducimos los recipientes subcultivados en la incubadora donde, en unas 2 horas,
se habrán adherido las células.
Congelación de Células.
Cuando no necesitamos las células durante un largo periodo de tiempo, pasamos a congelarlas
del siguiente modo:
- Lavamos con PBS, levantamos las células con tripsina y las dejamos varios minutos
a 37_C (igual que para subcultivar).
- Paramos la reacción con medio de cultivo y pasamos el contenido al tubo.
- Centrifugamos a 800 r.p.m. durante 5 minutos.
- Retiramos el sobrenadante y resuspendemos con 1 ml. de medio de congelación:
Cell Culture Freezing Medium-DMSO (Gibco).
- Pasamos el contenido a un vial y lo sellamos.
- La congelación debe ser progresiva (dos días hasta -80_C) para pasar luego al
nitrógeno líquido.
Descongelación de Células.
Cuando volvamos a necesitar células, las descongelamos siguiendo los siguientes
pasos:
- Sacamos el vial del nitrógeno líquido y lo calentamos al “baño maría” a 37_C.
- Mezclamos, en un tubo de ensayo, el contenido del vial descongelado con 9 ml. de
medio.
- Centrifugamos a 800 r.p.m. durante 5 minutos.
- Retiramos el sobrenadante y resuspendemos el pellet con medio de cultivo.
- Añadimos a una o varias placas ya preparadas con medio.
Medio de congelación:
- 25ml Fetal bovine serum (50%) (Life Technology 16000044)
- 20ml MEM complete (40%) (Life Technology 11095-080)
- 5ml DMSO (10%) (Sigma D2650)
5
Experimento 1:
Curva de crecimiento.
- Introducción:
Una curva de crecimiento es una herramienta gráfica para observar la evolución del crecimiento
de células en cultivo.
La curva de crecimiento de un cultivo celular, consta de 4 fases:
 Fase de adaptación o de latencia(A): Durante la que las células adaptan su metabolismo a
las nuevas condiciones ambientales (de abundancia de nutrientes) para poder iniciar el
crecimiento exponencial.
 Fase exponencial(B): en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de
generación es mínimo. Durante esta fase las células consumen los nutrientes del medio a
velocidad máxima.
 Fase estacionaria(C): en ella no se incrementa el número de células. Las células entran en
fase estacionaria bien porque se agota algún nutriente esencial del medio, porque los productos
de desecho que han liberado durante la fase de crecimiento exponencial hacen que el medio sea
inhóspito para el crecimiento u otras células que limiten su crecimiento por inhibición por
contacto. En nuestro caso, el único factor que influye es la inhibición por contacto, puesto que el
medio es cambiado cada 48 horas aproximadamente
 Fase de muerte(D): se produce una reducción del número de células viables del cultivo.
C
B
A
6
- Objetivos:
* Obtención de las curvas de crecimiento correspondientes a las líneas celulares CHO y MCF7.
* Obtención del tiempo del ciclo celular a partir de estas curvas de crecimiento.
- Materiales:
* Campana de flujo laminar.
* Centrífuga.
* Tubos de centrífuga de fondo cónico no estériles.
* Cámara de conteo.
* Pipetas automáticas y puntas.
* Pipeto.
* Pipetas de vidrio (5ml, 10ml y 25 ml).
* Bomba de succión con pipeta Pasteur.
* Medio de cultivo completo.
* Tripsina.
* PBS 1X.
* Microscopio óptico.
* Microscopio óptico invertido de contraste de fases
* Contador.
- Procedimiento:
* Coger una placa petri de cada línea celular, retirar el medio de cultivo, lavar con PBS 1X y
tripsinizar con 3 ml de tripsina durante 5 minutos a 37ºC.
* Comprobar que la tripsinización se ha efectuado visualizando las células al microscopio
óptico invertido, debiéndose de observar células redondeadas y despegadas de la superficie.
Despegar células mediante golpeo.
* Pasar las muestras de cultivo tripsinizados a tubos de fondo cónicos de centrifugación y
neutralizar la tripsina con medio de cultivo completo, uno por cada línea celular. Centrifugar
durante 5 minutos a 1000 rpm.
* Aspirar el sobrenadante con la bomba de succión para quedarnos únicamente con el pellet.
Resuspender pellet en un volumen conocido.
* Calcular el número de células por mililitro mediante conteo de células con una cámara de
conteo en un microcopio óptico. La cámara de conteo se compone de 9 celdas que presentan
cada una el siguiente aspecto:
7
De cada celda se contará la celdilla central, y entre los 9 datos obtenidos se hará una media para
calcular el número de células por ml.
* Una vez conocido esto, calcula el volumen necesario para sembrar en cada placa 200000
células.
* Dejar crecer 2 ó 3 días y el 4º día comenzar a contar 3 placas por línea celular durante 6 días.
- Datos obtenidos y discusión de resultados:
* Cálculo para la obtención de 200000 células para la siembra inicial y elaboración de las curvas
de crecimiento.
En CHO, el volumen de resuspensión de medio de los pellet fueron 900 μl. El número de
células obtenido en cada celdilla fue el siguiente: 68-71-70-83-78-79-80-89-98-92.
Con estos datos hacemos una media de los 9 valores cuyo valor es de 80.89 células,
considerando los datos que expondré a continuación, multiplicamos este valor por 90000 para
obtener el número de células por ml, que fue de 7280000. Entonces mediante la siguiente regla
de tres calculamos cuantos ml coger para sembrar 200000 células.
200000----------------------x ml
7280000---------------------1ml
x= 27.47 μl
Para redondear vamos a echar 28 μl, que serían 203.840 células en el cultivo inicial.
Para MCF7, realizamos el mismo procedimiento, pero resuspendemos el pellet en 900 μl,
saliéndonos en el conteo los siguientes datos: 41-47-52-31-61-52-60-50-69, con un media de
51.54. Con ello calculamos el número de células por ml que fue 4630000.
Entonces mediante la siguiente regla de tres calculamos cuantos ml coger para sembrar 200000
células.
200000----------------------x ml
4360000---------------------1 ml
x= 43.2 μl
Para redondear echamos 44 microlitos que serían unas 203720 células en el cultivo inicial.
Esta siembra la realizamos un jueves y comenzamos a contar el lunes siguiente. A continuación
vamos a exponer los datos obtenidos tras los seis días de conteo.
8
Día Línea
celular
Tiempo Dilución
(horas) (ml)
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
0
0
20
20
52.5
52.5
76.5
76.5
97.25
97.25
123,5
123,5
CHO
MCF7
CHO
MCF7
CHO
MCF7
CHO
MCF7
MCF7
CHO
CHO
MCF7
0,6
0,5
0.8
0.8
1.2
1.2
1
1
2
1.5
2
1.5
Cámara 1
(células
totales)
2340000
434700
2384000
3640000
4524000
2664000
6870000
4840000
7300000
8850000
8712000
6120000
Cámara 2
(células
totales)
2030000
450000
3016000
3056000
7428000
1404000
8510000
5390000
9200000
5595000
7356000
4470000
Cámara 3
(células
totales)
1999800
544000
800000
3087000
3828000
2052000
9372000
3400000
9400000
7905000
7800000
4785000
Media(número
total)
2123267
476550
2700000
3261000
4176000
2040000
8250000
4543333
8633333
8377500
7956000
4627500
Para obtener el número total de células en cada cámara utilizada para el conteo, se aplica la
fórmula:
Teniendo en cuenta que el Nº células cuadrado pequeño, equivale a la media de 9
valores obtenidos en cada cámara.
Nota: los números en rojo indican que hemos descartado ese dato, por que considerábamos que
esos valores se alejaban mucho del resto de datos de la misma línea celular y del mismo día.
10000000
9000000
C
8000000
Nº células
7000000
B
6000000
CHO
5000000
MCF7
4000000
3000000
A
2000000
1000000
0
0
20
52,5
76,5
Horas
9
97.25
123,5
Como podemos observar en la gráfica superior la curva de CHO nos ha salido bien por que
podemos distinguir las tres fases del crecimiento celular mencionadas en la introducción. Por lo
que con los datos de la gráfica vamos a obtener su tiempo de ciclo.
MCF7 sin embargo, nos ha salido muy irregular y no se distinguen bien las fases, no podemos
fiarnos de esta gráfica para calcular el tiempo de ciclo. Por lo cual procedimos a repetir el
experimento con MCF7.
Datos de la repetición de la curva de crecimiento de MCF7:
En este caso repetimos el experimento en placas petri pequeñas y sembramos alrededor de
80000. Cogimos una placa de MCF7 y calculamos el número total de células que contenía
mediante cámaras de conteo obteniendo un valor medio de células por celdilla de 40.55 células.
40.55 x 90000 =3650000 células/ml.
Conociendo que en un 1 ml tenemos 3650000 células:
3650000 células-------------1ml
80000 células---------------- x
x=22 μl
Esta siembra la realizamos un jueves y comenzamos a contar el lunes siguiente. A continuación
vamos a exponer los datos obtenidos tras los seis días de conteo.
Línea
celular
Día Tiempo
(horas)
Dilución
(ml)
MCF7
MCF7
MCF7
1
2
3
0
29
53
0.2
0.4
0,65
MCF7
MCF7
MCF7
4
5
6
77
97
123.5
0.8
0.9
1.5
Cámara 1
Cámara 2
(células totales) (células
totales)
350000
322000
580000
604000
Destrucción del 1189500
pellet
2190000
1970000
2421000
2997000
3585000
6210000
Cámara 3
(células
totales)
362000
596000
1566500
Media
(número
total)
344667
593333
1378000
1960000
3744000
5385000
2040000
3054000
5797500
Con estos datos obtuvimos la siguiente gráfica:
MCF7
7000000
Nº células
6000000
5000000
4000000
Nº células
3000000
2000000
1000000
0
0
29
51
75
Tiempo(h)
10
95
121,5
Como observamos hemos obtenido una fase de latencia y una exponencial, como se debería
esperar. La fase estacionaria no se da en células MCF7 puesto que carecen de inhibición por
contacto, por lo cual tardarán más tiempo en llegar a la fase estacionaria.
Una vez obtenidas las correspondientes curvas de crecimiento de ambas líneas celulares, se
procede al cálculo del tiempo de ciclo. Para ello utilizamos las siguientes expresiones:
Tiempo de ciclo de CHO:
Ni*2n = Nf
2700000*2n=8250000
n=1.611
Tiempo de ciclo=56.5 horas/1.611=35.3 h.
Tiempo de ciclo de MCF7:
Ni*2n = Nf
2040000*2n=5797500
n =1.5
Tiempo de ciclo: 46.5 horas/1.5 = 31 h.
11
Experimento 2:
SUPERVIVENCIA
- Introducción:
Esta técnica se trata de comprobar la supervivencia de una extirpe celular, cuando se realiza la
siembra.
- Materiales:
-
18 Cajas petri
Medio de cultivo
- Procedimiento:
1) Sembramos en 3 cajas 100 células, en otras 3 cajas 500 y en otras 3, 1000 células (esto
se realiza para cada extirpe), con abundante medio
2) Se introducen en el incubador de CO2 durante 8 días
3) Se tiñen siguiendo el siguiente protocolo:
TINCIÓN DE COLONIAS CELULARES
1.- Fijar en metanol puro, 10 minutos a
temperatura de laboratorio.
2.- Lavar en PBS, 5 minutos.
3.- Teñir con solución de Giemmsa al 10%-20%,
10 minutos.
4.- Lavar en PBS.
5.- Secar.
4) Contar las colonias.
- Resultados y cálculos:
CHO
12 12
14 13
19 20
10
21
18
media = 15,4
- si en 1 ml hay 15,4*90000= 1386000cel /ml
en 7 ml existen 9702000 células totales:
7 ml ------- 9702000 células
X = 0,0007 ml = 0,7µl
X -------- 1000 células
7 ml ------- 9702000 células
X = 0,0004 ml = 0,4 µl
X -------- 500 células
12
7 ml ------- 9702000 células
X = 0,00007 ml = 0.07 µl
X -------- 100 células
Nos salen volúmenes muy pequeños, así que tenemos que hacer diluciones, vamos a realizar una
dilución de 1/10 usando 6,3ml de medio y 700µl del cultivo, así pues:
7 ml ------- 970200 células
X = 0,007 ml = 7 µl
X -------- 1000 células
7 ml ------- 970200 células
X = 0,004 ml = 4 µl
X -------- 500 células
De la anterior dilución, volvemos a diluir a 1/5 añadiendo 600 µl de la dilución anterior y 2,4 ml
de medio:
7 ml ------- 194040 células
X = 0,004 ml = 4µl
X -------- 100 células
MCF 7
6 13
28 8
16 9
2
2
23
media = 11,8
- si las células por ml son 11,8 *90000= 1070000cel/ml
las células totales son 1070000*6= 6420000 células.
6 ml ------- 6420000 células
X = 0,0009 ml = 0,9 µl
X -------- 1000 células
6 ml -------6420000 células
X = 0,0005 ml = 0,5µl
X -------- 500 células
6 ml ------- 6420000 células
X = 0,00009 ml = 0,09 µl
X -------- 100 células
13
Vamos a hacer una dilución 1/10 con 600 µl de cultivo y 5,4 ml de medio
6 ml ------- 642000 células
X = 0,009 ml = 9 µl
X -------- 1000 células
6 ml ------- 642000 células
X = 0,005 ml = 5 µl
X -------- 500 células
De la dilución anterior volvemos a realizar otra dilución 1/5, añadiendo 833 µl mas 5,17ml:
6 ml ------- 128400 células
X = 0,005 ml = 5 µl
X -------- 100 células
MCF7
100
58
57
59
media = 58 %
267
268
297
500
1000
media = 55%
305
426
355
media = 36 %
CHO
100
26
30
35
media = 30%
500
168
177
187
1000
media= 36%
262
301
293
media = 29 %
Comentarios:
La supervivencia media de MCF7 ha sido de 50% y CHO del 32%.
Teniendo en cuenta que la supervivencia suele ser del 30 – 60% , el experimento ha salido como era de
esperar.
Este experimento lo hemos repetido 4 veces, las 3 primeras veces siempre son salía una supervivencia
mayor del 80%, incluso a veces mayor del 100%, eso pudo haberse debido a:
14
-
Fallo de cálculos o en el conteo de células.
Fallo de pipeteo; ya que si hay que coger un volumen muy pequeño (menor de 5µl) es
aconsejable hacer diluciones, para que no existan este tipo de problemas.
Puede que las placas se movieran y una de las células de una colonia formara una colonia nueva,
cercana a la anterior.
Lo único extraño de nuestros resultados, es que el crecimiento disminuye con respecto al numero de
células sembradas es decir, que en las placas de 1000 ha existido menos porcentaje de supervivientes que
en las de 100 y menos que en las de 500. Lo que debería haber sucedido es que al sembrar mas células,
se favorece la supervivencia mediante señales paracrinas.
15
Experimento 3:
OBTENCIÓN DE METAFASES DE CHO Y MCF7
- Introducción:
Vamos a obtener metafases de MCF7 y CHO para observar el número de cromosomas.
Las metafases se obtienen utilizando colcemida, que actúa sobre el citoesqueleto, impidiendo
que polimericen, por lo que no se forma el uso mitótico, y este es el motivo por el cual las
células permanecen en metafase, pero hay que ser cautos con la concentración de colcemida
adecuada ya que es una droga que al actuar sobre el citoesqueleto, puede crear otro tipo de
daños.
- Materiales y reactivos:
* Colcemida
* KCl
* Metanol
* Acético
- Método:
PREPARACIÓN DE LOS CROMOSOMAS
1.- Tratar las células con 0.4 μg/ml. colcemida a 37 ºC durante 4 horas.
2.- Suspender las células en mitosis por golpeo, y formar un pellet por centrifugación a
800 r.p.m., 4-5 min.
3.- Tirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μl KCl 75 mM (0.558g/100ml
agua destilada) a 37°C. Llevar el volumen a 10 ml. con ClK 75 mM para resuspender
bien el pellet. Dejar a 37º C, 10 min.
4.- Centrifugar a 800 r.p.m. durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante, resuspender el pellet y fijar en 5 ml. de metanol:acético
(3:1) recién preparado a 4ºC.
- Centrifugar de nuevo y repetir 2-3 veces, durante 10 min. a 4ºC.
(en este punto se puede parar la técnica. Halkka et al., 1987 lo dejan hasta varios
meses a -20ºC)
5.- Centrifugar y resuspender de nuevo en metanol-acético en un volumen suficiente
para tener una buena densidad de células.
6.- Con una pipeta Pasteur coger un poco de células con fijador y sobre un porta frío
humedecido con vaho dejar caer 3 ó 4 gotas que se esparcirán solas.
7.- Una vez secas las preparaciones, estarán listas para que se les aplique cualquier
técnica de tinción; ya sea la FPG, el Giemmsa, inmuno, etc.
16
1
COLCEMIDA
- Solución stock: ...... 0.1μg/1μl. (Eppendorf en congelador).
- Solución trabajo .....0.4μg/ml. Incubar los cultivos celulares durante 4-6 horas a
37ºC.
Ejemplo:
C * V = C’ * V’
100 μg/ml * V = 0.4μg/ml. * 5ml
V = 0,02 ml = 20 μl
- Resultados:
Este experimento hemos tenido que repetirlo dos veces para CHO y tres para MCF7. La primera
vez el problema estuvo en un choque osmótico muy débil, ya que las células no se reventaron,
además de un fallo en los cálculos a la hora de añadir la colcemida, ya que tomamos la
concentración del stock como 0,01μg/μl.
La segunda vez que repetimos MCF7 todo el proceso se dio correctamente pero el fallo se dio al
montar sin xilol, así que nos resultó imposible tomar fotos de esas preparaciones.
Los resultados de las CHO son los siguientes:
17
Experimento 4:
CARIOTIPO DE LINFOCITOS
- Introducción:
Vamos a ver el cariotipo de linfocitos humanos, utilizando nuestra sangre. El procedimiento es
parecido al del experimento anterior solo que hay que tener en cuenta que los linfocitos deben
de ser tratados de forma algo distinta.
- Materiales y reactivos :
* Colcemida
* KCl
* Metanol
* Acético
- Método:
1.- Extracción de la sangre en esterilidad (0.5 ml / 4.5 ml medio RPMI).
2.- Añadir de 2-10μg/ml de PHA e incubar en estufa de cultivo.
(La PHA estará siempre presente después de cada lavado hasta llegar a la fijación de
las células).
3.- Lavado de linfocitos (Opcional):
a) Decantar el medio con la sangre en tubos de cetrífuga, estériles de 10 ml.,
flameando el cuello antes del vertido.
18
b) Centrifugar a 1000 r.p.m. durante 6 minutos y quitar el sobrenadante con
"pipeta estéril" dejando un poco en el tubo para evitar perdida de las células.
c) Resuspender suavemente a mano.
d) Añadir nuevo medio RPMI hasta 10ml para hacer una segunda centrifugación.
e) Finalmente añadir 5ml de medio RPMI con PHA a cada tubo, resuspender y
pasar a frascos de cultivo rotulados, estériles.
4.- Recogida de metafases (Chromosome arrest): Añadir 0.4 μg/ml de colcemida en
cada frasco de cultivo de 5ml., mantener a 37 º C y fijar a las dos horas.
5.- Fijación:
a) Pasar la sangre a tubos de centrifuga de 10 ml.
b) Centrifugar a 1000 r.p.m., durante 6 minutos y extraer el sobrenadante
dejando un poco sobre el pellet. Resuspender.
c) Choque hipotónico con KCl 0.075 M: Añadir 3 gotas al resuspendido y agitar
suavemente; ir añadiendo, poco a poco, gotas de KCl hasta los 5 ml
aproximadamente y mantener en el baño a 37ºC durante 10 minutos.
d) Centrifugar a 1000 r.p.m., durante 6 min., y extraer el sobrenadante.
e) Fijar con Acido acético-metanol (1:3) añadiendo gota a gota igual que con el
choque hipotónico.
f) Centrifugar a 1000 r.p.m., durante 6 min., y extraer el sobrenadante. Repetir
los dos últimos pasos dos veces más (en total son 3 fijaciones).
6.- Preparaciones: Hacer los extendidos dejando caer una gota del resuspendido final,
desde la máxima altura posible, sobre un porta frío y mojado. Dejar secar una noche y
teñir con Giemmsa (3 % en tampón fosfato, pH=6.8. 5 min.).
Resultados:
Los resultados en general fueron buenos, pero en las preparaciones de algunos de los
compañeros también hubo problemas con el choque osmótico y los cromosomas no estaban bien
extendidos, a continuación aparecen además de algunas fotografías, el cariotipo humano:
19
20
Experimento 6:
Daño al ADN.
- Introducción:
El agente que hemos utilizado para dañar el ADN ha sido la bleomicina, que es un antibiótico
que se usa para combatir el cáncer; desacelera o detiene el crecimiento de las células
cancerígenas en el cuerpo. Se piensa que ésta inhibe el síntesis del ADN, y en un nivel menor la
síntesis del ARN y las proteínas.
ESTRUCTURA DE LA BLEOMICINA
Las bleomicinas comparten la misma estructura central, pero pueden diferir en el tipo de
carbohidratos y cadenas cargadas positivamente que contienen. Presentan diferentes dominios
funcionales:
a) Dominio de unión a metales: este dominio contiene átomos de nitrógeno que coordinan al
metal, formando un complejo octaédrico con éste. La unión de la bleomicina con metales de
21
transición como Fe (II) y Cu (I) y en presencia de oxígeno puede catalizar el corte del DNA de
cadena sencilla y de cadena doble, además de generar especies de oxígeno reactivas.
b) Dominio de unión al DNA: la pirimidina de la bleomicina, en colaboración con el grupo
bitiazol, son responsables de la unión con el DNA. Las cargas positivas del grupo bitiazol
favorecen la unión electrostática de la bleomicina con el DNA; esta unión puede ocurrir por
intercalación o a través de interacciones con el surco menor.
c) Carbohidratos: la bleomicina puede estar glicosilada con α–D–manosa y α–L–glucosa. No se
conoce con precisión el papel de los carbohidratos, pero existen evidencias de que pueden
modular la afinidad de la bleomicina por el DNA.
MECANISMOS DE ACCIÓN DE LA BLEOMICINA
Para activarse la bleomicina requiere de la unión con un metal de transición reducido [Fe (II) o
Cu (I)], la presencia de una molécula de oxígeno y un agente reductor. La bleomicina activa
ejerce su efecto citotóxico a través de la generación de especies de oxígeno reactivas y por daño
directo al DNA y RNA.
Daño al DNA: estudios in vitro han mostrado que la bleomicina puede cortar directamente el
DNA de cadena sencilla y cadena doble, causando cambios globales en la morfología de los
cromosomas. El daño de la bleomicina sobre el DNA es dosis–dependiente. Además, se ha
determinado que el efecto de la bleomicina es dependiente del ciclo celular (el cual es mayor en
las células que se encuentran en la fase G1 y G2/M del ciclo celular) y del estado de activación
transcripcional, siendo más susceptible la eucromatina que la heterocromatina. La bleomicina
no interfiere directamente con la replicación del DNA, ni con la síntesis del RNA y de las
proteínas.
Daño al RNA: recientemente se ha propuesto que el RNA es un blanco potencial de la
bleomicina. Se ha demostrado in vitro que el RNA puede ser degradado por hidrólisis directa o
en forma indirecta por la generación de radicales libres.
Generación de especies de oxígeno reactivas: la bleomicina activa puede generar radicales
hidroxilo, superóxido y peróxido de hidrógeno, que reaccionan rápidamente con cualquier
molécula en forma inespecífica, oxidando lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.
- Objetivos.
* Obtención de las curvas de crecimiento correspondientes a las líneas celulares CHO y MCF7,
tanto con agente mutante como sin él, para poder observar el daño producido
- Materiales.
* Campana de flujo laminar.
* Centrífuga.
* Tubos de centrífuga de fondo cónico no estériles.
* Cámara de conteo.
* Pipetas automáticas y puntas.
* Pipeto.
* Pipetas de vidrio (5ml, 10ml y 25 ml).
* Bomba de succión con pipeta Pasteur.
22
* Medio de cultivo completo.
* Tripsina.
* PBS 1X.
* Microscopio óptico.
* Microscopio óptico invertido de contraste de fases
* Contador.
* Sulfato de Bleomicina en suero (1.5 U/ml).
- Procedimiento.
* Coger 1 placa petri de cada línea celular, retirar el medio de cultivo, lavar con PBS 1X y
tripsinizar con 3 ml de tripsina durante 5 minutos a 37ºC.
* Comprobar que la tripsinización se ha efectuado visualizando las células al microscopio
óptico invertido, debiéndose de observar células redondeadas y despegadas de la superficie.
Despegar células mediante golpeo.
* Pasar las muestras de cultivo tripsinizados a tubos de fondo cónicos de centrifugación y
neutralizar la tripsina con medio de cultivo completo, uno por cada línea celular. Centrifugar
durante 5 minutos a 1000 rpm.
* Aspirar el sobrenadante con la bomba de succión para quedarnos únicamente con el pellet.
Resuspender pellet en un volumen conocido.
* Calcular el número de células por mililitro mediante conteo de células con una cámara de
conteo en un microcopio óptico.
* Una vez conocido esto, calcula el volumen necesario para sembrar en cada placa 150000
células, como hicimos en el primer experimento
* Dejar crecer 2 ó 3 días y el 4º día comenzar a contar 3 placas por línea celular durante 6 días
mediante las cámaras de conteo. Los agentes se introducirán en el medio de cultivo a las 48
horas del primer día de cultivo, para tenerlos en fase exponencial y ver así los efectos de dicho
agente en cada una de las líneas. En nuestro caso el agente utilizado es bleomicina.
* Elaboración de las curvas de crecimiento.
- Datos obtenidos y discusión de resultados.
* Cálculo para la obtención de 150000 células para la siembra inicial y elaboración de las curvas
de crecimiento.
En MCF7, el volumen de resuspensión de medio de los pellet fueron 4000 μl. El número de
células obtenido en cada celdilla fue el siguiente: 26-24-26-16-14-36-26-37-33.
Con estos datos hacemos una media de los 9 valores cuyo valor es de 26,44 células,
considerando los datos que expondré a continuación, multiplicamos este valor por 90000 para
obtener el número de células por ml, que fue de 2380000. Entonces mediante la siguiente regla
de tres calculamos cuantos ml coger para sembrar 150000 células.
150000----------------------x ml
23
x= 57,7 μl
2380000---------------------1ml
Para CHO, realizamos el mismo procedimiento, pero resuspendemos el pellet en 6000 μl,
saliéndonos en el conteo los siguientes datos:27-26-21-27-29-31-28-43-27 con un media de
28,89. Con ello calculamos el número de células por ml que fue 2592000.
Entonces mediante la siguiente regla de tres calculamos cuantos ml coger para sembrar 150000
células.
150000----------------------x ml
2592000---------------------1 ml
x= 84,03 μl
* Cálculos para la determinación de cantidad de bleomicina a usar en el volumen de medio que
vamos a utilizar.
Para ello utilizamos la relación:
C*V=C´*V´
Siendo:
C: Concentración final de bleomicina.
V: Volumen final.
V´: Volumen de bleomicina 1.5 U/ml a coger para obtener la concentración final de
bleomicina que queremos.
C´: Concentración inicial de bleomicina.
Aplicamos la relación:
4 ml de volumen final * 1.5 mU/ml de bleomicina= x ml de bleomicina 1500mU/ml *
1500 mU/ml de bleomicina
x= 0.004 ml es decir 4 microlitros de bleomicina. Y de medio tendremos que añadir 3996
microlitros de agua.
* Resultados obtenidos y discusión de resultados.
A continuación se exponen los resultados obtenidos tras el conteo.
Día Línea celular
Tiempo
(horas)
Media(número total)
1
CHO (agente)
24
535000
1
MCF7 (agente)
24
304800
1
CHO (Control)
24
345000
1
MCF7 (Control)
24
296550
2
CHO (agente)
48
563400
24
2
MCF7 (agente)
48
354420
2
CHO (Control)
48
599400
2
MCF7 (Control)
48
412596
3
CHO (agente)
72
1159200
3
MCF7 (agente)
72
1344000
3
CHO (Control)
72
1128600
3
MCF7 (Control)
72
1420200
4
CHO (agente)
96
3020000
4
MCF7 (agente)
96
2032000
4
CHO (Control)
96
4690000
4
MCF7 (Control)
96
2206000
5
CHO (agente)
120
4649666
5
MCF7 (agente)
120
2790666
5
CHO (Control)
120
5746000
5
MCF7 (Control)
120
2617333
6
CHO (agente)
144
4575000
6
MCF7 (agente)
144
2962500
6
CHO (Control)
144
5550000
6
MCF (Control)
144
3170000
Con estos resultados procedimos a realizar las gráficas que representaran el crecimiento
celular obteniendo los siguientes resultados:
25
CHO
7000000
6000000
5000000
4000000
CHO control
CHO agente
Bleomicina
3000000
2000000
1000000
0
24
48
72
96
120
144
MCF7
3500000
3000000
2500000
Bleomicina
2000000
MCF7 control
MCF7 agente
1500000
1000000
500000
0
24
48
72
96
120
144
Como observamos en CHO al añadir el agente, se produce un declive en el crecimiento celular,
creciendo más lento en las horas posteriores al añadir el agente, ello nos indica que la
bleomicina habría producido daño, y que por tanto antes de la división celular el sistema de
reparación de CHO habría actuado, por lo cual se tardaría más tiempo en completar el ciclo y
por lo tanto el crecimiento celular es menor, de ahí que haya crecido menos que en el caso de
control.
También pude plantearse la hipótesis de que las células afectadas muriesen, de ahí que al
dividirse las supervivientes diesen un número menor a la curva control, aunque esta hipótesis es
menos probable, ya que deberían haber muerto un mayor número de células.
26
En el caso de las MCF7 esto no ocurre, ya que posiblemente al ser células cancerosas, el daño
que provoque la bleomicina ya los tenga estas células de la línea MCF7 por lo que no
deberíamos esperar una diferencia entre la curva control y la agente, de echo, solapan una con la
otra tal y como debería esperarse.
Experimento7:
Binucleadas
27
- Introducción:
En este experimento vamos a utilizar una droga, llamada citocalasina B, que inhibe la
polimerización de los filamentos de actina, por lo que no se formaría el anillo de contracción de
citocinesis, obteniéndose células binucleadas.
El objetivo es calcular, con otro método, el tiempo de ciclo y observar micronúcleos.
- Materiales:
* Campana de flujo laminar.
* Centrífuga.
* Tubos de centrífuga de fondo cónico no estériles.
* Pipetas automáticas y puntas.
* Pipeto.
* Pipetas de vidrio (5ml, 10ml y 25 ml).
* Bomba de succión con pipeta Pasteur.
* Medio de cultivo completo.
* Microscopio óptico.
* Microscopio óptico invertido de contraste de fases.
* Cámara de fotos.
* Colcemida.
* Citocalasina.
* KCl.
* Metanol acético.
* Giemsa 20% (en tampón fosfato pH = 6.8.
* PBS 1X no estéril.
* Agua destilada.
* Xilol.
* DPX.
* Portaobjetos.
* Cubreobjetos.
- Procedimiento:
* Hay que tratar con colcemida durante 2 o 3 horas y posteriormente obtener, por golpeo,
células en mitosis que, tras centrifugar y resuspender, sembraremos, en placas petri pequeñas,
para partir de un cultivo sincrónico. A partir de este paso empezamos a contar el tiempo de
ciclo.
* Tratamos con citocalasina cuando calculemos que estamos en G2, que es unas 6 horas antes
de que finalice el ciclo( el tiempo de ciclo de cada línea celular ya lo tenemos calculado). La
citocalasina no la echamos desde el principio para no estresar a las células demasiado.
* Observar las células cada cierto tiempo para ver cuando aparecen binucleadas. Cuando
aparezcan será el final de nuestro ciclo celular.
* Tomar fotos de binucleadas en el microscopio invertido de contraste de fase.
* Posteriormente seguir el mismo protocolo que el de preparación y tinción de cromosomas.
- Resultados y discusión:
28
Lo primero antes de empezar el experimento fue planificar las horas a las que íbamos a venir.
Echamos la colcemida un viernes a las 7:30 de la mañana y sembramos a las 9:30.
Como CHO nos salió un ciclo de 35 horas, echamos la citocalasina a las 29 horas (a las 14:30) y
durante las 6 horas restantes observamos las células para anotar cuando aparecen las
binucleadas.
MCF7 debería tener un ciclo, según lo que nosotros calculamos con la curva de crecimiento, de
31 horas, por lo que echamos la citocalasina a las 25 horas (a las 10:30 de la mañana), y
observar durante las siguientes seis horas hasta que aparezcan las binucleadas.
También tenemos que hacer dos tipos de cálculos:
-Cuanta colcemida echar:
Concentración inicial de colcemida = 10 μg/ml (C), en placa tenemos que dejar una
concentración de colcemida de 0,4 μg/ml (C’).
Para 4 ml de volumen total (V’):
C x V = C’ x V’
10 μg/ml x V = 0,4 μg/ml x 4 ml
V = 0,16 ml = 160 μl de colcemida
En cada placa (2 placas, 1 por cada línea celular).
4ml – 0,16ml = 3,84 ml de medio (aproximadamente 4ml)
-Cuanta citocalasina echar: En este paso cometimos un error, porque partimos de una
concentración inicial de citocalasina equivocada, 2 μg/ml (C), la verdadera
concentración inicial era de 2 μg/ μl (C), por lo que echábamos 1000 veces más de lo
necesario. La concentración a la que tenemos que dejar la citocalasina en placa es de 0,3
μg/ml (C’).
Para un volumen de 4 ml de volumen final en placa de petri (V’).
C x V = C’ x V’
2 μg/ml x V = 0,3 μg/ml x 4ml ; V = 0,6ml = 600 μl de citocalasina en
cada placa (2, una por cada línea celular). Esto esta mal.
2 μg/ μl (2.103 μg/ ml) x V = 0,3 μg/ml x 4ml ; V = 6.10-4ml = 0,6 μl
citocalasina.
Esto es lo que deberíamos haber hecho.
Este primer intento no nos salió bien, porque salieron algunas binucleadas, pero había
muchas más células que no estaban binucleadas, por lo que no teníamos un cultivo
sincrónico y el experimento no valía. Posiblemente por que al golpear nos se levantaron
células que no estaban en mitosis, por lo que al sembrarlas no partiremos de un cultivo
sincrónico.
-Segundo intento:
29
Esta vez echamos la colcemida a las 7:00 a.m y sembramos a las 9:00 a.m. A MCF7 le
echamos la citocalasina a las 10:00 a.m. del día siguiente, y a CHO a las 14:00 de la
tarde.
Aparecieron binucleadas de MCF7 a las 16:20, por lo que si contamos desde las 9:00
a.m., del día anterior, hasta las 16:20 de este día, el tiempo de ciclo que nos sale es de
30horas y 40 minutos. En la curva de crecimiento celular nos dio 31 horas, como son
muy parecidos podemos fiarnos algo más de nuestros tiempos de ciclo.
MCF7,
binucleadas
MCF7,
binucleadas
Las binucleadas de CHO aparecieron a las 21:00 horas del día siguiente a la siembra.
Como se sembró a las 9:00 a.m. del día anterior, nuestro tiempo de ciclo sería de 36
30
horas, Como en la curva de crecimiento celular de CHO nos salió un tiempo de ciclo de
35,3 horas, nos dan tiempos de ciclo parecidos, por lo que parece que nuestros datos son
algo fiables.
CHO, binucleadas.
CHO, binucleadas.
CHO, binucleadas.
-Fotos tinción de cromosomas:
31
CHO, tinción (binucleadas)
CHO nos salió mal al teñirlo porque le dimos dos choques osmóticos.
MCF7, tinción (binucleadas)
MCF7, tinción (binucleadas)con
la flecha aparece indicado un
micronúcleo
MCF7, tinción (binucleadas)
Experimento 8:
INMUNOLOCALIZACIÓN A MICROSCOPÍA ÓPTICA DE
32
FLUORESCENCIA
-Introducción:
La inmunocitoquímica usa anticuerpos para localizar una molécula específica, tras esto los
anticuerpos pueden visualizarse por algún tipo de técnica. Puede usarse solo un anticuerpo que
reconozca a la molécula y a la vez sea localizable, pero es raro, ya que lo común es usar dos
tipos de anticuerpos, uno que tenga como diana tu molécula problema y otro que tenga como
antígeno este primer anticuerpo, llevando este segundo algún tipo de señal de localización, por
ejemplo fluorescencia o radiactividad.
-Procedimiento:
1.- Fijar las células crecidas en cubres con una solución de formaldehído al
3% en PBS (4.1 ml de formaldehído 35-40% + 46 ml de PBS). A esta
solución fijadora se le añade Tritón X-100 al 1%. 20 min. a Tª ambiente.
2.- Lavar los cubres en PBS, 5 min.
3.- Bloquear en BSA al 3% en PBS, 15 min. (Mínimo).
4.- Incubar en el primer anticuerpo a la dilución adecuada en PBS de 1 a
24 horas, en ambiente húmedo y temperatura de 37 ºC. (Depositar una
gota de aproximadamente 60 μl de la dilución de anticuerpo sobre papel
Parafina).
5.- Lavar en PBS durante un mínimo de 15 min.
6.- Incubar en el segundo anticuerpo a la dilución adecuada en PBS, 45
min., en ambiente húmedo y temperatura de 37 ºC. (Depositar una gota de
aproximadamente 60 μl de la dilución de anticuerpo sobre papel parafina).
- GAH-FITC. Dilución 1: 30 en PBS.
- Anti Rabbit-FITC. Dilución 1 : 200 en PBS.
7.- Lavar en PBS durante un mínimo de 15 min.
8.- Montar en Hoechst 33342, 10 μg / ml, en PBS-glicerol (1 : 9). Poner una
gota de 3 - 5 μl por porta.
- Solución stock: 4 mg Hoechst.
1 ml PBS.
Filtrar y guardar a 4 ºC.
- Solución uso: 25 μl solución stock en 10 μl de PBS-glicerol (1:9)
-Resultados:
33
Los resultados que aparecen en las fotografías corresponden a cuatro de las 8 preparaciones
que realizamos, que estaban hechas con las siguientes diluciones del suero (anticuerpo 1):
- Dilución 1/50 ------- 490 µl PBS + 10 µl de suero
- Dilución 1/100 ------300 µl PBS + 200 µl de la dilución 1/50
- Dilución 1/500 ----- 400 µl PBS + 100 µl de la dilución 1/100
El segundo anticuerpo estaba a una concentración de:
- 1: 32 --- 248 µl PBS + 8 µl de suero
De este segundo anticuerpo no se hacen diluciones, en todos los cubres se echaba lo mismo,
incluso en el control.
CHO
Las fotografías superiores pertenecen a la preparación de la dilución 1/100.A la izquierda
tenemos las CHO de color azul gracias al Hoechst, y a la derecha aparecen las células en
verde intenso debido al tratamiento con el anticuerpo tipo A código 177836, ya que estas
células fueron tratadas con los dos anticuerpos. En el control (fotografía inferior) aparece
como una pequeña tonalidad verde que puede ser debida a uniones inespecíficas del segundo
anticuerpo, ya que esta preparación solo fue tratada con este.
La inmunolocalización se ha dado en una molécula del citosol, ya que como se observa en la
foto (marcado con flechas) en la imagen de la de la derecha, aparece muy poca intensidad del
verde, en la zona que en la foto de la izquierda se ve que pertenece al núcleo.
34
MCF 7
Las fotografía superior pertenece a la preparación con dilución 1/50. En esta extirpe usamos
otro anticuerpo primario (el segundo anticuerpo es común), fue el tipo B código 178180, y por
lo que se puede apreciar no ha sido tan efectivo como en CHO. Esto pudo deberse a un fallo
nuestro a la hora de realizar las preparaciones o a que este anticuerpo este mal, pero se aprecia
perfectamente como esta mucho menos intenso que en CHO.
Aun así, se aprecia como el antígeno se encuentra en el citosol, al igual que se explicó para
CHO.
El control, fotografía inferior, como era de esperar ha salido muy poco marcado, y ese marcaje
poco intenso puede deberse a uniones inespecíficas del anticuerpo 2º.
35
Experimento 9:
OBSERVACIÓN MORFOLÓGICA A MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA
INCLUSIÓN EN RESINA EPOXY
-Introducción:
Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar
imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de
aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los
1000 de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho
menor que la de los fotones.
Un microscopio electrónico funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico,
acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya
que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente
deshidratada) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una
imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que
transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscopios electrónicos sólo se pueden
ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como
se puede apreciar, su funcionamiento es semejante a un monitor monocromático.
-Materiales:
Células Animales Cultivadas en monocapa.
Frasco Rous pequeño.
Resina
Matraces Erlenmeyer
Pipetas
Coplins
Estufa de calefacción a 60ºC
Tampones (descritos en el protocolo)
-Procedimiento:
1- Fijar en glutaraldehído al 1.6% en tampón cacodilato 0.1 M pH 7.4. 2 horas.
Tampón cacodilato:
- Cacodilato sódico........ 2.14 g.
- Cloruro de calcio......... 0.05 g.
- Agua destilada hasta .. 100 ml.
Ajustar a pH 7.2-7.4 con HCl 1 N.
2- Lavar con tampón cacodilato sódico 0.1 M.
3- Tetróxido de Osmio (OsO4) al 1%, 1 h, 4ºC.
4- Lavar con tampón cacodilato + sacarosa 7.5%.
5- Deshidratación (a 4ºC):
- Etanol 30% ................... 15 min.
- " 50% ................... 15 min.
- " 70% ................... 15 min.
- " 80% ................... 15 min.
- " 90% ................... 15 min.
- " 100% ................... 15 min. (2 pasos).
36
6- Inclusión (a 4ºC):
- Etanol/resina (3:1) ........... 60 min.(Este paso es prescindible)
- " / " (1:1) ........... 60 min.
- " / " (1:3) ........... 60 min. (este paso es prescindible)
- Resina .......................... 12 horas (solamente la cantidad suficiente para
cubrir las células).
7- Polimerizar a 60ºC, 12 horas.
* Nota: 1.- Se puede sustituir el tampón cacodilato por el PBS.
2.- En ningún paso las células pueden quedar secas.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA OBSERVACIÓN EN EL MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO:
1) Romper el frasco Rous y extraer la lámina de resina
2) Preparación de los extremos para el ultramicrotomo, dejando la superficie totalmente
plana y los laterales formando una pirámide.
3) Recogemos las muestras del micrótomo y observamos una parte que nos interese
en el microscopio óptico
4) Retallamos para obtener la preparación de la zona deseada
5) Recogemos las muestras, que tienen que ser de un tamaño apropiado para que no
sobresalgan de la rejilla.
6) Observar al microscopio electrónico
Ultramicrotomo
Maquina cortadora de
vidrios, que son
utilizados como
cuchillas para el
ultramicrotomo
Microscopio electrónico
37
- Resultados:
Célula apoptótica
Nucleolos en los que se distinguen los centros fibrilares (menos densa) y la granular
(mas densa) y los componentes fibrilares densos, que son las zonas mas densas a los
electrones
38
Desmosomas: son uniones
célula-célula, mediadas por
cadherinas. Es raro en células en
cultivo, pero típico de las MCF7
Mitocondria
Membrana nuclear en la
que se observan los
complejos del poro
39
Mitocondria
Célula en la que se observan los
complejos de poro
Mitocondrias de muy distintas
morfologías.
Se observan gran cantidad de
componentes del citoesqueleto
40
Experimento 10:
ENSAYO COMETA:
- Introducción.
El Ensayo Cometa, es un método que permite extraer el ADN de la célula para evaluar
los daños presentes en él.
Ha dado luz sobre la relación existente entre las afectaciones que puede sufrir el material
genético y la aparición de enfermedades como el cáncer.
Igualmente ha permitido apreciar las posibilidades reales que existen para la reparación
de muchos de los perjuicios ocasionados al ADN.
El método lleva consigo la introducción de agarosa en un portaobjetos para
permitir el movimiento del ADN cuando se le expone a un campo eléctrico (electroforesis).
Antes de someter las células a un campo eléctrico se hace un tratamiento con moléculas que
rompan la membrana para que se pueda liberar el material genético.
Para visualizar el resultado al microscopio se utiliza DAPI para teñir el ADN procedente
del núcleo celular. Esta técnica nos permite hacer aproximaciones estadísticas y
cuantificar el daño en el ADN.
- Objetivos.
Provocar daño en el ADN mediante agentes mutagénicos, y observación del
resultado del ensayo cometa al microscopio óptico, para evaluar si se ha producido daño en el
ADN.
- Procedimiento
1.-Preparación de los portaobjetos.
Se utilizan portaobjetos con borde esmerilado que se cubren con agarosa de
punto de fusión normal preparada en agua destilada al 1% y disuelta en caliente. Los
portaobjetos se dejan secar verticalmente y luego se guardan en la nevera. Duran hasta un mes
desde su preparación.
2.-Inclusión de las células en agarosa.
El número correcto de células oscila entre las 50000 y las 80000 por porta. Una
vez contadas y depositadas en un tubo eppendorf se le añade 85 μl de agarosa de bajo punto de
fusión preparada al 0,7% en PBS y mantenida en el baño María a 37ºC. La mezcla se deposita
en el centro del porta, se coloca rápidamente un cubreobjetos largo (24 x 66 mm) y se deja
gelificar en el frigorífico durante 10 minutos. Posteriormente se quita el cubre cuidadosamente y
se añaden 75 μl de agarosa de bajo punto de fusión. De nuevo se coloca otro cubre y se deja
gelificar 10 minutos. Quitar el cubre con cuidado y someter las células a la fase de lisis.
41
3.-Lisis de las membranas celulares.
Se sumergen los portas en una solución de lisis de pH alcalino conteniendo 10mM Tris
pH= 10, 2.5 M NaCl, 100mM Na2EDTA y 0.25 M NaOH a la que se le añade 1% (v/v)
Tritón X-100 y 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) justo en el momento de usarla.
Los portas se pueden dejar en esta fase de lisis de 1 a 12 horas siempre a 4ºC.
4.-Pre-electroforesis y electroforesis.
La cubeta de electroforesis debe estar fría, dentro de una bandeja con hielo o en una
cámara de 4ºC, y se echa el tampón electroforético un poco antes de que termine la fase
de lisis para que la temperatura de la solución sea de aproximadamente 12ºC. El tampón
de electrforesis consiste en 1mM de Na2EDTA y 300 mM de NaOH (pH= 12.8). Se
sacan las preparaciones de la solución de lisis y se colocan horizontalmente sin dejar
espacios entre los portas en la cubeta de electroforesis previamente llenada. El tampón
debe cubrir las preparaciones aproximadamente unos 2 mm.
La fase de electroforesis es para permitir el desenrollamiento del ADN antes de que se
sometan las células a la corriente eléctrica. Las preparaciones deben dejarse 20 minutos
en la cubeta con el tampón frío. Transcurrido este tiempo se inicia la electroforesis en
frío. Las condiciones de electroforesis son de 1V/cm y máximo de 300mA durante 20
minutos. El amperaje se regula con el volumen de tampón que cubre los portas, a más
volumen mayor amperaje.
5.-Lavado de los portaobjetos.
Al cabo de los 20 minutos se sacaron los portas y se colocaron horizontalmente
sobre dos puntos de apoyo para no perder la capa de agarosa. Posteriormente se lavaron tres
veces con tampón de neutralización 0.4 M Tris pH= 7.5. Cada lavado dura cinco minutos y es
para eliminar las sales y detergentes que podrían interferir en la posterior tinción.
6.-Tinción de las preparaciones.
Las preparaciones se pueden:
a) teñir nada más acabarse la técnica.
b) dejar secar las preparaciones y teñir después.
c) Dejar secar las preparaciones y fijarlas en metanol absoluto durante cinco
segundos; teñir después.
Las células se tiñen con 50 μl del colorante elegido, que puede ser Bromuro de etidio (2
μg/ml en H2O destilada) o DAPI (5 μg/ml en H2O destilada), y se le coloca un cubre a
cada preparación. Se ponen en cámara húmeda y se guardan a 4ºC.
-Soluciones.
1.-Solución de lisis.
Para un volumen total de 100 ml de tampón de lisis:
2.5 M NaCl ------------14.61 g
Na2 EDTA--------------3.72 g
0.01 M Tris-------------0.12 g
0,25 M NaOH----------1 g
42
Añadir H2O destilada, ajustar a pH= 10 con HCl puro y completar al final hasta un
volumen total de 1 litro con más H2O. Esta solución se esteriliza en el autoclave y se
guarda a 4ºC. La solución de lisis se completa con DMSO y Tritón en el momento de ser
usada y se coloca en el frigorífico para la lisis de las membranas. Para 100 ml:
89 ml tampón lisis
10 ml DMSO
1 ml Tritón X-100
2.-Tampón de electroforesis.
Para un volumen total de 1.5 litros:
1mM de Na2EDTA----------0.555g
300mM de NaOH------------18.0 g
Añadir H2O muy fría y ajustar a pH= 12.8 con HCl puro (hay que añadir como 20 ml).
Completar al final hasta 1.5 litros y guardar en la nevera hasta que se ponga en la cubeta.
3.-Tampón de neutralización.
Para un volumen de 50 ml:
0.4 M Tris---------------48.44 g
Ajustar a pH= 7.5 y completar hasta 50 ml con H2O destilada.
4.-Geles de agarosa.
A) Agarosa de bajo punto de fusión (LMA) al 0.7%:
0.035 g en 5 ml de PBS 1X; mantener a 37ºC
B) Agarosa de punto de fusión normal (NMA) al 1%:
0.5 g en 50 ml de H2O destilada; mantener a 45ºC
-Protocolo de trabajo con sangre completa:
1º.- Obtención de la muestra:
Sacarse sangre del dedo con una lanceta estéril, unas 3 ó 4 gotas que hacen aproximadamente
un volumen de 500 µl. Añadir 4,5 ml de tampón PBS 1X.
2º.- Tratamiento:
Repartir la sangre en tubos eppendorfs, 500 µl en cada tubo. Un tubo será control y otro tratado
con agente mutante. La dosis de m-Amsa es de 10 µM = 5 µM de m-Amsa 10-3 M en 500 µl de
sangre. Incubar durante 1 / 2 hora a 37ºC.
43
3º.- Lavado:
Coger de cada tubo 1 muestra de 50 µl y lavar con 300 µl de PBS. Centrifugar a 2000 rpm
durante 7 min. Eliminar el sobrenadante con cuidado quedándose con el pellet rojo de eritrocitos
y un poco de sobrenadante por encima, que es donde se depositan los leucocitos.
4º.-Inclusión:
Dejar los tubos eppendorf en el baño a 37ºC. Mezclar las células con 60 µl de agarosa de bajo
punto de fusión y mover un poco con la punta de la micropipeta pero sin hacer burbujas.
Depositar la muestra sobre el centro de un porta previamente preparado con otra capa de
agarosa y colocar un cubre y aplastar un poco. Dejar en el frigorífico durante 10 min. Al cabo de
ese tiempo quitar el cubre con cuidado y añadir 75 µl de agarosa de bajo punto de fusión y
volver a poner otro cubre. Dejar gelificar de nuevo 10 min. en el frigorífico; al cabo de ese
tiempo quitar el cubre y colocar las preparaciones en la solución de lisis.
Continuar la técnica como en el protocolo estandard.
-Protocolo cometas en linfocitos.
1º.-Coger 6 gotas de sangre (500 µl) y mezclarlas con 3,5 ml de PBS.
2º.-Repartir en eppendorfs cada uno con 500 µl o 1 ml y dar el tratamiento correspondiente.
3º.-Una vez finalizado dicho tratamiento, coger 50 µl de sangre para cada porta y echarlo en
otro eppendorf.
4º.-Añadir 250 µl de PBS para lavar el agente; centrifugar a 2000 rpm durante 7 minutos.
5º.-Eliminar el sobrenadante, hay que quedarse con el pellet y con un poco de sobrenadante
justo por encima ya que ahí es donde se quedan los linfocitos.
6º.-Repetir esta operación (pasos 4 y 5). Al finalizar el lavado último, resuspender el pellet y
colocar los eppendorf en el baño de 37ºC.
7º.-Añadir a cada eppendorfs aproximadamente 50 µl de agarosa de bajo punto de fusión,
mezclar bien y depositar la mezcla sobre el porta colocando un cubre rápidamente.
8º.-Dejar enfriar 10 minutos en el frigorífico (4ºC).
9º.-Retirar el cubre con cuidado y volver a echar 75 µl de agarosa de bajo punto de fusión y
poner otro cubre.
10º.-Dejar enfriar (4ºC) durante 10 minutos y volver a retirarlo con cuidado.
11º.-Poner las preparaciones en solución de lisis.
44
- Resultados obtenidos y discusión de resultados.
* Cálculos de bleomicina y peróxido utilizado para realizar el daño.
Bleomicina
1500 mU/ml * V = 15 mU/ml * 0,5 ml
V = 5 * 10^-3 ml
Peroxido de hidrógeno
PM = 34 g/ mol
M = Nº moles / l
60 µM = 34 / v
V= 0,57µl
30% H2O2
0,57---- 100%
X ---- 30%
X = 0,171 µl
0,171 µl ----- 1000 ml
X ------ 0,5 ml
X= 8,55 * 10^-5 µl
Diluimos 5 veces a 1/10 y al final cogimos 8,5 µl
* Imágenes del ensayo cometa obtenidas en el microscopio óptico.
Tras realizar la electroforesis de los portaobjetos con los linfocitos en agarosa se procedió a su
visualización al microscopio electrónico. Se obtuvieron varias fotos de los diferentes portas:
Control, Con bleomicina y con peróxido de hidrógeno. Las imágenes obtenidas las expongo a
continuación:
CONTROL
Como se observa no existe daño o existe un pequeño daño basal en los
linfocitos que no han sido tratados con agente mutágeno. El daño basal puede
deberse a malos hábitos de vida tales como la consumición de tabaco.
45
LINFOCITOS TRATADOS CON BLEOMICINA
Observamos una estela de ADN parecido a la cola de un cometa, ello nos indica
que se ha producido daño en el ADN de la célula al ser tratadas con bleomicina,
ello podemos deducirlo comparándolo con el control, en el cual no había una
estela de ADN porque no se había producido daño. Ello esclarece que la técnica
se ha realizado correctamente y que el resultado es positivo.
LINFOCITOS TRATADOS CON PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
Observamos una estela de ADN indicándonos que se ha producido daño en el
ADN de la célula al ser tratadas con peróxido de hidrógeno, ello podemos
deducirlo comparándolo con el control, en el cual no había una estela de ADN
porque no se había producido daño.
A su vez, si comparamos las “colas” con el caso de tratamiento con bleomicina,
las colas con tratamiento de peróxido de hidrógeno son más pequeñas, por lo
que podemos deducir que con las cantidades utilizadas den cada mutágeno, la
bleomicina causa mayor daño en el ADN que el peróxido de hidrógeno.
46