Clase 9 Biocontrol de insectos 2013.doc

Agrobiotecnología. Curso 2013
Clase 9: Biocontrol de insectos
Impacto de los insectos en la agricultura
Transparencias 3-13
Las pérdidas provocadas por los insectos en los cultivos agrícolas pueden deberse
tanto al daño producido por los adultos como por las larvas. En la transparencia 4 se
muestran ejemplos de algunas especies pertenecientes a distintos órdenes de
insectos de importancia agronómica: Lepidópteros, Coleópteros y Dípteros. Estos
últimos pueden ser transmisores de distintos virus. Además de estos órdenes, algunas
especies de homópteros (pulgones, cochinillas) y ortópteros (saltamontes, grillos)
tienen también importancia para la agricultura.
La lucha contra los insectos insume enormes recursos económicos. La transparencia 6
muestra los gastos realizados en insecticidas para intentar controlar los daños
producidos por insectos en distintos grupos de cultivos. En 1994, estos gastos
totalizaron U$S 8.110 millones a nivel mundial. A pesar de ello, los insectos produjeron
en el mismo año pérdidas por un total de U$S 98.000 millones en los cultivos más
importantes. Las pérdidas son aún mayores en los sistemas agrícolas menos
desarrollados, en los que los insecticidas resultan inaccesibles para los productores
debido a su costo (transparencia 7). Por otra parte, la utilización masiva de insecticidas
es deletéreo para el medio ambiente y afecta en forma indiscriminada a los insectos
blanco y a las especies benéficas. Estos factores contribuyeron al desarrollo de
bioinsecticidas incorporados a las plantas mediante ingeniería genética.
La transparencia 9 ilustra los principales hitos en el proceso de adopción de los
insecticidas agrícolas. Los bioinsecticidas fueron utilizados desde relativamente
temprano en la agricultura. Las entomotoxinas de Bacillus turigiensis vienen siendo
utilizadas desde la década del 30 del siglo pasado. La introducción del DDT en los
años 40 inició la época de la utilización de insecticidas de síntesis química, los que, si
bien presentaron menos problemas de toxicidad que el primero, despertaron inquietud
por su eventuales efectos sobre el medio ambiente. La era de los bioinsecticidas
comienza a mediados de los años 80 con el desarrollo de las primeras plantas
transgénicas que producen su propio insecticida. Las mismas entraron en la cadena
de comercialización a mediados de los años 90 y ocupan actualmente muchos
millones de hectáreas de superficie sembrada. En todos los casos, el problema de la
generación de resistencia en las poblaciones de insectos blanco persiste, ya que el
surgimiento de la misma responde a los mismos mecanismos básicos de selección.
Como se verá más adelante, este problema debe encararse mediante métodos
adecuados de manejo agronómico.
La posibilidad de expresar genes insecticidas en plantas transgénicas permitió contar
con herramientas muy importantes para el control de plagas que afectan a cultivos de
gran importancia agronómica. En la transparencia 10 se muestran algunas de las
ventajas y los problemas a tener en cuenta al usar esta tecnología. Las principales
ventajas se relacionan con la disponibilidad de insecticidas de rangos más específicos,
más estables en el tejido y más biodegradables y con los menores costos de
producción. Las limitaciones presentan aspectos comunes con los problemas de uso
de todos los insecticidas (posibilidad de generar resistencia, afectar insectos útiles,
etc.) y con los problemas que implica la expresión constitutiva de la proteína para el
rendimiento metabólico del cultivo.
Existen en la naturaleza varias proteínas de distintos orígenes que poseen actividad
insecticida. Sin duda las más utilizadas son las que derivan de B. thuringiensis. Sin
embargo, se están estudiando proteínas de diversos orígenes que pueden ser
candidatas para su utilización como bioinsecticidas en el futuro. La transparencia 13
enumera las principales proteínas de origen microbiano, vegetal o animal que se están
utilizando con este fin. Entre las proteínas que se están ensayando se encuentran
inhibidores de proteasas, de -amilasas, lectinas, etc. El grado de eficacia de estas
proteínas es diverso y muchas de ellas se encuentran todavía en la etapa de
exploración preliminar. Las proteínas que han sido destacadas en color serán motivo
de un tratamiento más detallado en esta clase.
Entomotoxinas de Bacillus thuringiensis
Transparencias 14-31
B. thuringiensis es una bacteria de enorme importancia agronómica ya que es capaz
de colonizar y matar a una gran variedad de insectos. Una característica importante de
las toxinas producidas por esta bacteria es que tienen acción específica para distintos
órdenes de insectos, lo que introduce la posibilidad de utilizarlas selectivamente contra
determinadas plagas. Además, existen algunas cepas productoras de toxinas que
afectan a nematodos. Estas características hicieron de esta bacteria la fuente del
primer bioinsecticida eficaz para uso agronómico y una alternativa importante a los
insecticidas químicos. La transparencia 15 presenta una lista de las principales
subespecies de la bacteria.
La transparencia 16 ilustra las distintas etapas del ciclo de vida de B. thuringiensis,
incluyendo la esporulación y la formación del cristal conteniendo -endotoxinas. La
célula vegetativa inicia la formación de la espora cuando el ADN comienza a
localizarse a lo largo del eje mayor del bacilo (filamento axial). Luego de la replicación,
una de las copias de ADN es rodeada por una membrana para formar un protoplasto
que se recubre por la membrana de la célula madre. Se sintetizan luego las
estructuras de la pared y la cubierta de la espora. A medida que disminuye el
contenido de agua de la espora, ésta se vuelve más refringente al microscopio y más
resistente al calor. Finalmente, la espora puede ser liberada por lisis de la célula
madre. Todo el proceso tarda unas 6 a 7 h y en el mismo intervienen más de 50
genes diferentes.
Desde el año 1961, cuando se aprobó por primera vez un bioinsecticida derivado de B.
thuringiensis, se han utilizado distintas preparaciones que contienen una o más
entomotoxinas (en algunos casos hasta cinco). Por lo general, las preparaciones
contienen las esporas y cristales liberados luego de la lisis bacteriana y un excipiente
inerte. La producción y la aplicación de estos preparados tienen costos relativamente
altos. Además, en las condiciones de campo, generalmente es necesario realizar
varias aplicaciones del insecticida, ya que los cristales son inestables y sensibles a la
luz UV y pueden ser lavados por acción de las lluvias. Por estas razones, su uso está
restringido a pequeñas superficies, como las utilizadas típicamente por la agricultura
orgánica. Las transparencias 17 y 18 muestran algunas de las morfologías típicas de
los cristales producidos por B. thuringiensis.
Las proteínas contenidas en los cristales son tóxicas para distintos insectos, lo que ha
llevado a utilizar extractos de esta bacteria como bioinsecticida. Además de las
proteínas Cry, que se describirán en más detalle en otras transparencias, los cristales
contienen también otras toxinas llamadas cytolisinas (toxinas Cyt). Asimismo, B.
thuringiensis produce otras toxinas que actúan en forma sinérgica con las toxinas
presentes en los cristales. Entre éstas podemos citar toxinas que son secretadas,
hemolisinas, enterotoxinas, quitinasas y fosfolipasas. En condiciones naturales todos
estos factores actuarían facilitando la muerte de la larva del insecto y el desarrollo de
las bacterias en la misma (transparencia 19).
Algunas cepas de B. thuringiensis producen en la fase vegetativa del crecimiento
toxinas que se conocen con el nombre de Vegetative Insecticidal Proteins (VIPs;
transparencia 20). Estas toxinas actúan en conjunto con las toxinas Cry y Cyt. Las
VIPs no forman cristales y son secretadas. El gen de la toxina vip3A codifica una
proteína de 88 kDa que se produce durante el crecimiento vegetativo y no es
procesada. La toxina posee actividad contra varios lepidópteros, entre los que se
cuentan Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua y Helicoverpa zea.
Cuando el insecto susceptible consume cantidades letales de la toxina Vip3A se
observan síntomas de parálisis y lisis de las células del epitelio intestinal, de manera
similar a la observada en las intoxicaciones producidas por proteínas Cry.
La transparencia 21 muestra la estructura primaria completa (pre-proteína) de tres
toxinas Cry. Las regiones grises corresponden a las secuencias que serán removidas
por acción de las proteasas intestinales del insecto para dar lugar a la toxina activa. A
la derecha, se observa la representación tridimensional de una toxina activa donde se
destacan los tres dominios principales. El dominio I (celeste) es la región involucrada
en la inserción en la membrana y en la formación de poros en las mismas. Los
dominios II y III (verde y rojo) están involucrados en el reconocimiento y la unión a un
receptor específico de la célula del epitelio del intestino del insecto. La transparencia
21 muestra las estructuras moleculares de distintas toxinas Cry
La transparencia 22 muestra un esquema donde se compara la longitud de las
secuencias aminoácidicas de distintas proteínas Cry y se señalan las regiones
correspondientes a los tres dominios estructurales de la toxina. Asimismo, se muestran
en diferentes colores los 5 bloques de aminoácidos conservados presentes en la
mayor parte de las proteínas Cry. En la pre-proteína, antes y después de los dominios
I y III existen, respectivamente, sendas regiones amino y carboxilo terminales que son
procesadas por proteasas presentes en el intestino del insecto para producir la toxina
activa. La región procesada amino terminal consta de unos 20-40 aminoácidos,
mientras que la región carboxilo terminal es más larga y de tamaño variable.
La transparencia 23 muestra la estructura de la proteína Cry tóxica para distintas
familias de insectos.
Las transparencia 24-26 muestra un filograma que describe la homología de
secuencias a nivel de aminoácidos entre distintas proteínas Cry y Cyt. Como puede
observarse, la nomenclatura empleada para nombrar las distintas proteínas tiene en
cuenta el grado de homología entre las secuencias de aminoácidos. En el
dendograma, las secuencias más relacionadas están conectadas por las
ramificaciones más cercanas al extremo derecho del mismo. El rango primario, que
establece una clasificación numérica de 1 a 58 está definido por una homología menor
o igual a 45%. El rango secundario, que define la clasificación con letras mayúsculas
desde la A la L está definido por homologías de hasta 78%. El rango terciario, que
define la clasificación con letras minúsculas desde la a la i, está definido por
homologías de hasta 95%. La transparencia 27 muestra la clasificación propuesta para
las proteínas VIP, la que se basa en criterios similares a los utilizados para las
proteínas Cry. Una lista actualizada de las proteínas Cry, Cyt y VIP reportadas hasta
2008 puede consultarse en la página de internet referida en estas transparencias.
La transparencia 28 y 29 ilustran los principales pasos del mecanismo de acción de la
-endotoxinas. El proceso implica: la solubilización de la toxina en el tracto gastrointestinal del insecto (a), el procesamiento de las secuencia N- y C-terminales por
proteasas específicas presentes en el insecto (b), la unión a receptores específicos del
epitelio intestinal (c) y distintos cambios conformacionales (d y e) que llevan a la
formación de poros en la membrana plasmática. Estos poros son finalmente los
responsables de la lisis de las células del intestino del insecto y la posterior muerte del
mismo. Cada paso en este mecanismo contribuye a la actividad específica de la
toxina.
La transparencias 30 muestra modelos de unión a distintos receptores del tracto
gastrointestinal que han sido propuestos para explicar el mecanismo de formación de
los poros. La naturaleza del o los receptores de las toxinas Cry se halla en discusión,
pero se ha caracterizado una proteína tipo cadherina que, al expresase en células de
insecto, transforma a las mismas en susceptibles a la acción de la toxina. Asimismo,
se ha involucrado a la aminopeptidasa N (APN) como posible receptor de la toxina
Las toxinas Cry se unen en forma específica a las células epiteliales de los insectos
blanco. El panel (A) de la transparencia 31 muestra un ensayo inmunohistoquímico
realizado con anticuerpos anti-Cry sobre un corte de intestino de insecto. Como puede
observarse, el anticuerpo sólo revela la región correspondiente a las microvellosidades
de las células epiteliales. Los paneles (C) y (B) de la transparencia 26 muestran una
microscopía de una sección transversal de intestino de un insecto alimentado con una
planta transgénica que expresa la toxina y con otra que no ha sido transformada
(planta control). Los efectos citotóxicos pueden observarse claramente a nivel del
endotelio intestinal.
El rango de insectos blanco de una determinada toxina Cry es muy estrecho. La
especificidad de acción está dada por la interacción de las proteínas Cry con las
proteasas y con los receptores presentes en el intestino de los insectos. Existe un
considerable número de toxinas Cry con especificidad para distintos órdenes de
insectos (transparencia 32), lo cual permite discriminar su uso para distintos insectos
blanco. Además, esta especificidad hace que estas proteínas no tengan toxicidad
sobre otros organismos. En particular, las proteínas Cry resultan inocuas para los
mamíferos, incluso en su forma procesada. En principio, esta especificidad de rango
representa una gran ventaja para el uso de estos bioinsecticidas. En teoría, podrían
obtenerse rangos más amplios por el uso combinado de más de una proteína o
mediante permutación de dominios funcionales entre distintas proteínas Cry
(transparencias 33).
La transparencia 34 incluye datos de una página web con información de toxicidad
específica de distintos gens candidatos que se actualiza constantemente, útil para el
diseño de estrategias de control.
La transparencia 35 ilustra el grado de toxicidad de la toxina BtH-14 en animales de
experimentación (ratones), comparada con otros insecticidas y otros compuestos
químicos. La DL50 se refiere a la cantidad necesaria del químico a ser ingerida para
lograr la muerte del 50% de los animales tratados. Como puede observarse la DL50 de
la endotoxina de Bacillus thuringiensis es un orden de magnitud más baja que la de
una aspirina, por lo cual se la considera no tóxica para mamíferos.
Plantas Bt
Transparencias 36-51
Las primeras construcciones genéticas conteniendo una toxina Cry se introdujeron en
plantas de tabaco en 1986. La parte A de la transparencia 37 esquematiza la
estructura del gen bt2, en la que se destaca la región que contiene a la toxina activa.
En la parte B se muestran las distintas construcciones utilizadas en los primeros
trabajos. Se utilizó el gen completo (pGS1161) y distintas versiones que contienen la
región 5’ del gen. En algunas versiones (construcciones bt:neo860 y bt:neo23), el gen
cry se fusionó al gen selector npt II (resistencia a kanamicina). De esta forma, las
plantas que presentaran alta resistencia al antibiótico kanamicina presentarían también
altos niveles de expresión de la proteína Cry. Los niveles de expresión de las plantas
conteniendo las formas truncadas fueron 10 veces más altos que los de la versión
completa.
PTR: promotor de manopina sintetasa del plásmido pTiAc de Agrobacterium, este promotor es
bifuncional (1’ y 2’)
3’ t7: señal de poliadenilación del gen 7 del plásmido pTiAc de Agrobacterium
neo: gen de la neomicina fosfotransferasa II que confiere resistencia a kanamicina
3’OCS: señal de terminación de la octopina sintetasa
Los primeros ensayos con toxina Cry mostraron que las plantas transgénicas
conteniendo las versiones truncadas podían controlar un lepidóptero (Manduca sexta)
mientras que las plantas utilizadas como control y las transformadas con el gen cry2
completo eran susceptibles al mismo. Sin embargo, los niveles de expresión
alcanzados por las versiones truncas no fueron suficientes para controlar a otros
insectos menos susceptibles a esta toxina. Para lograr este objetivo, fue necesario
mejorar los niveles de expresión. En los experimentos que se muestran en la
transparencia 38, las plantas se ensayaron entre 4 y 6 semanas luego de transferirlas
al invernadero. La viabilidad y el estado de la muda de las larvas se analizaron a lo
largo de 6 días. A: Porcentaje de larvas viables. B: Porcentajes de larvas viables que
efectuaron la transición desde L1 al estadio larval posterior. Las plantas fueron
transformadas con la fusión bt:neo860.
Cuando se utilizaron genes cry no modificados, los niveles de expresión fueron muy
bajos. Se utilizó entonces la secuencia del gen correspondiente a la toxina activa y los
niveles de expresión aumentaron, pero no lo suficiente como para controlar a la
mayoría de los insectos blanco. Los bajos niveles de expresión se debían a que el
gen, al tener origen procariota, poseía un alto contenido de AT. Esto se traduce en la
existencia de potenciales señales de splicing, terminación de la transcripción, señales
de poliadenilación e inestabilidad del mensajero. Además, las diferencias en el uso de
codones entre procariotas y plantas pueden hacer que algunos ARNts sean limitantes
durante la traducción del ARNm. Cuando se modifica al gen teniendo en cuenta estos
factores (“vegetalización” del gen), los niveles de expresión aumentan drásticamente.
Alternativamente, se ha demostrado que los niveles de expresión pueden ser muy
altos cuando el gen nativo, sin ninguna modificación, se utiliza para transformar
cloroplastos. Debido al origen procariota del genoma de los plástidos, el gen cry
encuentra en este caso un entorno más adecuado para su transcripción y traducción
(tranparencia 39).
A modo de ejemplo, la transparencia 40 resume las modificaciones realizadas en el
gen Cry9Aa2 con el objeto de proceder a su “vegetalización”. En la secuencia original
del gen se identificaron 13 regiones potenciales de poliadenilación (AATAAA), 2
regiones de splicing, 1 región de terminación de ARN polimerasa II, etc. Para
“vegetalizar” el gen es necesario re-sintetizar distintos fragmentos del mismo y luego
empalmarlos para reconstituir una secuencia traducible. Los cambios de codones
afectan la secuencia del ARNm, pero no la secuencia aminoacídica de la proteína. Los
cambios introducidos dieron origen a tres versiones con distinto grado de sustitución
(G7, G10 y G14). El número de codones modificados en la versión más “vegetalizada”
(G14) fue de 79 y el porcentaje de AT en la misma disminuyó de 63,4% a 60,2%
La transparencia 41 muestra datos de ensayos realizados con plantas transgénicas
obtenidas con las distintas versiones del gen cry9Aa2. La foto A muestra hojas
aisladas de plantas representativas transformadas con la construcción control no
transformada (278), el gen cry9Aa2 no modificado (9Aa2) y las tres versiones
modificadas del gen cry9Aa2 (G7, G10 y G14, mostrando el grado de daño provocado
por las larvas luego de 9 días de alimentarse con ellas). La foto B muestra una
comparación entre los daños causados por la alimentación de larvas de Phthorimaea
opercullela en plantas enteras transformadas con el gen no modificado (izquierda) y
con la versión G14 (derecha). La foto C muestra las diferencias en el tamaño y el
desarrollo de larvas de Phthorimaea opercullela recuperadas de plantas transgénicas
que contienen el gen cry9Aa2 no modificado (izquierda) y la versión G14 del mismo
(derecha) luego de 9 días de ingesta.
Se obtuvieron líneas transgénicas de la variedad de papa Russet Burbank,
conteniendo una versión “vegetalizada” del gen cry3A de Bacillus thuringiensis subsp.
Tenebrionis (transparencia 42). En esta construcción, el gen está dirigido por el
promotor 35S del Cauliflower mosaic virus y el gen selector es nptII. Las
modificaciones realizadas en el gen permitieron aumentar los niveles de expresión
unas 300 veces respecto de la versión no modificada. Estas plantas transgénicas
fueron sometidas a un ensayo de resistencia a insectos. El ensayo se realizó
exponiendo las plantas transgénicas y control a 50-100 neonatos de Colorado potato
beetle (Leptinotarsa decemlineata). La defoliación de las plantas control fue completa
en 7-10 d; los neonatos en las plantas que expresan Cry3A murieron todos dentro de
las 48 h.
Se realizaron ensayos de campo con 25 líneas independientes, 23 de ellas
expresaban más de 0,1% de proteína Cry1A respecto de las proteínas totales. Las
plantas fueron expuestas en condiciones de infestación natural y mostraron ser
resistentes al insecto. La protección brindada por el gen cry fue más completa que la
obtenida mediante la utilización de insecticidas convencionales. Si bien los ensayos
fueron exitosos y la comercialización de la variedad transgénica se inició tanto en USA
como en Canadá, los niveles de comercialización no superaron el 2% de la producción
de papa. En el año 2001, la empresa Monsanto discontinuó su comercialización
(tranparencias 43 y 44).
Otro cultivo de gran importancia en el que se ha expresado los genes cry es el maíz.
La transparencia 46 y las siguientes muestran parte de los datos reportados en el
trabajo original por la empresa Novartis. En la transparencia 46 se muestran los
niveles de expresión en tejido vegetal de las distintas construcciones genéticas
probadas para optimizar la expresión del gen cry1Ab. Estas construcciones fueron
utilizadas para transformar una variedad elite de maíz. Se obtuvieron dos eventos,
llamados 171 y 176. En ambos casos, las construcciones contenían el gen selector bar
que confiere resistencia al herbicida glufosinato de amonio. El evento de
transformación 176 contenía dos copias del gen cry “vegetalizado” (sintético), una
dirigida por el promotor de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC), que permite la
expresión en el tallo y la otra dirigida por un promotor específico de polen. De esta
forma, la entomotoxina se produce en los dos tejidos (tallo y polen) utilizados por el
barrenador de maíz como fuente de alimento a lo largo de su ciclo de vida.
En los ensayos de campo, las plantas transgénicas de maíz fueron infestadas con un
total de 2.400 larvas del barrenador por planta, a razón de 300 larvas por semana
durante 8 semanas. Se midió el daño en las hojas y se utilizó una escala arbitraria de
1 a 9, donde 1 significa planta no dañada y la severidad de los daños se corresponde
con valores crecientes. También se cuantificó el daño en los tallos midiendo el largo de
los túneles producidos por la larva (transparencia 47). En paralelo a este desarrollo,
otras compañías desarrollaron plantas de maíz con el mismo gen cry1Ab. Estos
eventos son conocidos como MON810 (Monsanto) y BT11 (Novartis). El maíz Star
Link (Aventis) se obtuvo con el objetivo de controlar al barrenador europeo y se utilizó
para ello una versión modificada el gen cry9C. La proteína correspondiente es más
estable y se degrada más lentamente en las condiciones de digestibilidad simulada.
Estas características podrían asociarse con las de algunos alérgenos, por lo que las
autoridades regulatorias de los EEUU aprobaron su liberación sólo para la
alimentación animal. Sin embargo, granos provenientes de estas plantas entraron a la
cadena de consumo humano sin que se hubiera determinado antes su inocuidad para
los seres humanos. Por esta razón, la variedad Star Link fue retirada del mercado a
partir del año 2000. Los estudios realizados hasta el presente no constataron que la
proteína poseyera propiedades de alergeno.
La transparencia 48 muestra un ensayo de campo realizado con maíz Bt en Estados
Unidos. El daño producido por el barrenador (túneles) hace que los tallos de las
plantas infestadas sean más frágiles. En la foto se pueden apreciar las cañas
quebradas de las plantas control (no transgénicas), mientras que las plantas Bt se
mantienen erectas.
La transparencia 49 muestra los resultados de un ensayo de infestación realizado con
larvas de la oruga del capullo de algodón (Helicoverpa zea). La planta de la izquierda
es una planta control de algodón no transgénica. La planta de la derecha es una planta
que expresa una versión del gen Btk de Bacillus thuringiensis, en la que no se observa
daño alguno.
El evento de transformación 531, introducido comercialmente por la empresa
Monsanto, contiene al gen Cry1Ac dirigido por un promotor 35S del Cauliflower mosaic
virus. Dicho evento se utilizó como parental para generar otras variedades Bt de
algodonero transfiriendo el gen de la planta madre original a otros cultivares
avanzados mediante retrocruzas. Ello ha facilitado la introducción de resistencia en
variedades de algodonero que tienen una buena base agronómica y propiedades de
fibra deseables, pero que son difíciles de transformar porque no responden a la
regeneración in vitro. Las variedades Bt de algodonero comercializadas por la
empresa Monsanto se conocen como Bollgard. Existe un nuevo evento, Bollgard II,
que posee además del gen cry1Ac al gen cry2Ab. Estas plantas presentan una
capacidad de control de lepidópteros más amplia (transparencia 50).
La transparencia 51 muestra los resultados de un ensayo de infestación realizado con
larvas de la oruga militar (Helicoverpa armígera) en plantas de crisantemo. La planta
de la izquierda es transgénica y expresa una versión modificada del gen cry1C de
Bacillus thuringiensis. La planta de la derecha es una planta control no transformada.
Existe una gran cantidad de especies vegetales que han sido transformadas con
genes cry para protegerlas del daño provocado por diversos insectos. La transparencia
52 muestra sólo algunos ejemplos seleccionados por su importancia económica o
científica.
Técnicas de manejo agronómico para impedir el desarrollo de resistencia en los
insectos blanco
Transparencias 53-61
Uno de los problemas que puede presentar el uso de plantas Bt es la aparición de
insectos resistentes a la acción de las toxinas Cry. Los mecanismos por los que se
podría generar dicha resistencia son muy variados. Entre los más probables, pueden
surgir mutaciones en el receptor de la toxina que lo hagan no reconocible por la
misma. Este tipo de mecanismos ha surgido ya para otros insecticidas y no guarda
relación con el carácter transgénico de la planta, sino con la intensidad de la presión
selectiva que se introduzca. Mecanismos similares operan al introducir genes de
resistencia a patógenos fúngicos, bacterianos o virales. Se han propuesto distintas
estrategias para retrasar la aparición de resistencia a Bt (se parte de la idea de que el
surgimiento de la misma es inevitable a largo plazo). Una alternativa sería co-expresar
en una misma planta dos o más genes con actividad insecticida que actúen en
distintos niveles. Por ejemplo, sería interesante contar con un inhibidor de proteasas
eficaz que pudiera combinarse con un gen cry. Alternativamente, la utilización de
promotores inducibles, en lugar de promotores constitutivos, disminuiría la presión de
selección. Finalmente, el uso de refugios espaciales o temporales, que se explica en
las próximas transparencias, parece ser el enfoque más sencillo y efectivo, por lo cual
se lo ha introducido en forma paralela a la comercialización de las plantas Bt en todos
los países en que su uso ha cobrado envergadura.
El esquema de la transparencia 56 muestra la evolución de la resistencia a un
insecticida. Como puede observarse, los genes de resistencia están presentes en la
población y el uso reiterado de un mismo insecticida selecciona aquellos individuos
resistentes, aumentando su proporción en la misma. Se indican también algunos de
los posibles mecanismos moleculares involucrados en el surgimiento de la resistencia.
La combinación de cultivos que expresan altas dosis de la proteína insecticida con la
adopción de refugios espaciales, es la estrategia que se está utilizando con éxito, en
varios países donde se siembran cultivos Bt (transparencia 57). Esta se fundamenta
en el hecho de que los cultivos Bt son capaces de controlar tanto a los insectos
susceptibles (rr) como a los heterocigotos resistentes (Rr). Si surgieran insectos
homocigotas resistentes (RR), los mismos podrían cruzarse con los sensibles (rr) en la
zona del refugio (plantas susceptibles no transgénicas), dando origen a más insectos
Rr, los que serían eliminados en el cultivo Bt. Alternativamente, si se contara con otra
variedad resistente al insecto, se podrían sembrar alternadamente la variedad
resistente A y en la campaña siguiente, la variedad resistente B (estrategia de
alternancia de dos toxinas). Asimismo, se podrían combinar en una misma campaña
ambas variedades de plantas Bt (siembra simultánea de A y B), o expresar los genes
de ambas toxinas en la misma variedad (“apilamiento” de los genes A y B). Otra
estrategia de utilización de refugios apela a los refugios temporales, lo que implica
sembrar en una campaña cultivos Bt y en la siguiente cultivos no Bt. En teoría, esta
rotación mantendría la presión selectiva lo suficientemente baja como para impedir el
surgimiento de resistencia.
Se han desarrollado varios modelos teóricos sobre la evolución de resistencia a las
toxinas Cry en presencia y ausencia de refugios (transparencia 58). Estos modelos
asumen que las plantas transgénicas expresan un alto nivel de toxina que es capaz de
matar al 99,9% de los insectos susceptibles y al 99,9% de los insectos heterocigotos.
Nótese que, a bajas frecuencias de alelos resistentes, la frecuencia de adaptación es
mucho más baja cuando existe un refugio (en el caso descrito, la frecuencia de alelos
de resistencia en la generación 0 es de 0,001). Se han desarrollado modelos
predictivos similares para el caso de “apilamiento” de más de una entomotoxina Cry.
Obsérvese que, luego de la aparición inicial de resistencia, la adaptación a la toxina
sigue un curso exponencial.
En un trabajo publicado en 1999 se reportó que las larvas de la mariposa Monarca
mostraban retardos en el desarrollo y morían cuando se alimentaban de hojas de
algodoncillo (Asclepias) espolvoreadas con polen de plantas de maíz transgénico del
evento 176. Este trabajo produjo una considerable conmoción en los medios de
información y fue utilizado en la campaña anti-OGM por distintas organizaciones, ya
que esta mariposa es un emblema nacional de los Estados Unidos. Con posterioridad,
se publicaron los resultados de los trabajos de otros seis grupos de investigación
donde se demostró que los niveles de expresión de proteína Cry en el polen de
distintas variedades comerciales de maíz Bt es muy variable (ver tabla de la
transparencia 59). De acuerdo con estos trabajos, sólo el evento Bt 176 produce
polen que sería tóxico para la mariposa. En la tabla también se indica la cantidad
necesaria de granos de polen para producir la muerte de la mitad de las larvas (DL50).
También se tomaron muestras de granos de polen dentro de un campo cultivado con
maíz, en el borde del mismo, y a distintas distancias hacia afuera del sembrado,
observándose un bajo número de granos de polen a distancias mayores de 4 m del
cultivo. Debido a que el evento 176 no se comercializa en la actualidad, la conclusión
de estos trabajos es que las plantas Bt no representan un riesgo para la mariposa
Monarca.
La transparencia 60 muestra una lista de los cultivos comerciales más importantes que
se encuentran hoy en comercialización y de aquellos países en que son utilizados.
Entre los cultivos Bt que se encuentran en la etapa de comercialización, se hallan
papa, algodonero y maíz. La comercialización de la variedad de papa New Leaf fue
recientemente discontinuada por la empresa Monsanto.
Luego de la soja tolerante a herbicida, el maíz resistente a insectos es el segundo
cultivo transgénico más importante. Como puede verse en la transparencia 61,
también se comercializan variedades de algodón Bt, y de maíz y algodón
transformadas simultáneamente con genes Bt genes y de tolerancia a herbicidas. Los
datos de superficie sembrada que se muestran en esta transparencia corresponden al
período 1996-2002 y han continuado incrementándose en los años siguientes.
Otras proteínas con actividad insecticida: inhibidores de proteasas
Transparencias 62-71
Además de las proteínas Cry, existen en la naturaleza varias proteínas de origen
vegetal o animal que poseen actividad insecticida. Algunas de ellas están siendo
estudiadas como posibles candidatas para ser utilizadas en reemplazo de, o
conjuntamente con, las proteínas Cry. Entre los genes que se están ensayando se
encuentran, por ejemplo, inhibidores de proteasas, de -amilasas, lectinas, etc. La
transparencia 63 muestra una tabla con ejemplos de distintas plantas transgénicas que
se obtuvieron utilizando diversos inhibidores de proteasas. Los inhibidores de
proteasas se encuentran presentes en un variado número de plantas y están
asociadas a mecanismo de resistencia a insectos en las mismas. Según las hipótesis
más comúnmente aceptadas, la forma de acción de estas proteínas sería la inhibición
de proteasas presentes en el sistema digestivo de los insectos, lo que impediría la
normal asimilación de los alimentos. Se ha propuesto también que la presencia de los
inhibidores de proteasas podría provocar una sobrexpresión de proteasas en el tracto
digestivo del insecto, provocando así un descenso en la reserva de aminoácidos
esenciales.
Los insectos producen pérdidas millonarias en el cultivo de arroz, cultivo del cual
depende una gran proporción de la población del planeta. La transparencia 64
muestra el tipo de daño producido por los barrenadores del tallo del arroz, el que se
caracteriza por la aparición de espigas blancas y erectas. La coloración se debe a que
el tejido de las mismas está muerto, mientras que la posición erecta de las espigas es
debida al menor peso de las mismas ya que no contiene granos. Uno de los
inhibidores más estudiados es el de tripsina de caupí. Un equipo de investigación
chino, introdujo el gen que codifica este inhibidor (CpTi) en plantas de arroz bajo el
promotor del gen de la actina de arroz (Act 1 5’) y la señal de poliadenilación del gen
de la nopalina sintetasa (nos 3’). La construcción se denominó pDM402. Las plantas
fueron co-transformadas con la construcción pDM307 que porta al gen bar flanqueado
por el promotor 35S de CaMV y el terminador nos; este gen confiere resistencia al
herbicida glufosinato de amonio y permite la selección de las plantas transformadas.
La segregación de los genes en la progenie de las plantas transgénicas permite la
eliminación posterior del gen selector.
Los niveles de expresión del inhibidor de tripsina se muestran como porcentaje de la
proteína sobre el total de proteínas solubles (TSP). Los resultados del ensayo de
campo permitieron establecer un comportamiento claramente diferente entre las
plantas transgénicas y las plantas control no transgénicas. En las distintas plantas
transgénicas analizadas se pudo observar entre un 20 a un 80% de resistencia al
barrenador (transparencia 65).
Existen muchos trabajos en que se ha reportado la utilización de otros genes, distintos
de los cry y de los de inhibidores de proteasas, con el fin de conseguir resistencia a
insectos. Entre ellos se encuentran genes de inhibidores de -amilasa, lectinas,
colesterol oxidasa, quitinasas, etc. (transparencia 66). Existe un marcado interés en el
desarrollo de estrategias de resistencia alternativas a las de las plantas Bt ya que, de
tener éxito alguna de ellas, podrían utilizarse para complementar el uso de estas
últimas, lo que contribuiría a evitar la aparición de insectos resistentes y a lograr un
manejo integrado más adecuado de control de plagas. Sin embargo, muy pocas de las
plantas transgénicas obtenidas con estos genes han pasado del laboratorio a los
ensayos de campo y ninguna se encuentra aún en la etapa de comercialización.
El gen del inhibidor de -amilasa A1, presente en Phaseolus vulgaris, fue utilizado
para obtener variedades transgénicas de arveja. Para lograr la expresión específica
del gen en las semillas se utilizó el promotor y la señal de poliadenilación del gen de la
fitohemaglutinina de Phaseolus. El inhibidor impide la acción de las -amilasas del
sistema digestivo del insecto impidiendo que la larva del mismo pueda utilizar
almidones de la semilla como fuente de energía para su desarrollo. La transparencia
66 muestra el daño ocasionado en la semilla de arveja por el desarrollo y posterior
eclosión de la larva del insecto. Más recientemente, la eficacia de esta estrategia se
demostró en ensayos de campo. Las plantas ensayadas resultaron ser inmunes al
insecto, mientras que un 80% de los controles no transgénicos fueron infestados.
Otros genes que se han utilizado para generar resistencia a insectos son los que
codifican para lectinas vegetales. En la transparencia 69 se muestra el efecto obtenido
sobre el desarrollo de larvas de Lacanobia olearacea alimentadas en plantas de
Solanum tuberosum que expresan el gen de la Concanavalina A. Las cajas muestran
los promedios y rangos de los tiempos requeridos para que las larvas alcancen los
distintos estadios de desarrollo. El retraso en el desarrollo de larvas alimentadas en
plantas transgénicas respecto de las alimentadas en plantas control es
estadísticamente significativo. En las mismas plantas, se observó un efecto sobre la
fecundidad del áfido Myzus persicae. Los puntos señalan la acumulación promedio de
ninfas por áfido. Las hembras maduras se expusieron al tratamiento al día 0. En las
plantas transgénicas se observa un descenso significativo en la acumulación de ninfas
por áfido que se atribuyó a un descenso en la fertilidad de los adultos. Este efecto
puede tener importancia agronómica porque los áfidos son los principales vectores de
una gran variedad de virus vegetales.
En la mayoría de las plantas transgénicas desarrolladas para introducir resistencia a
insectos se ha utilizado el promotor 35S del Cauliflower mosaic virus, el que provee
expresión constitutiva en casi todos los tejidos vegetales. Sin embargo, existe un
enorme interés en caracterizar promotores que permitan buenos niveles de expresión
en los tejidos directamente afectados por los insectos, como por ejemplo, promotores
específicos de floema para el control de insectos chupadores, o bien promotores
inducibles por daño mecánico. La tabla de la transparencia 71 muestra ejemplos de
varios de los promotores utilizados y se describen las características de los mismos.
Silenciamiento
Transparencias 72 y 73
Control microbiano
Transparencias 74 y 84
Control de insectos utilizando virus como Baculovirus (transparencias 75-80) y hongos
entomopatógenos (81- 84)