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Agrobiotecnología. Curso 2013
Resistencia a virus de plantas mediante ingeniería genética
Clasificación y principales características de los virus
Transparencias 4-15
Estrategias de protección antiviral en plantas
Transparencias 16-19
En la década de 1930 se observó que la inoculación previa de una planta con un virus
la protegía contra la inoculación posterior con un virus relacionado. Este fenómeno se
denominó “protección cruzada”. Utilizando este procedimiento se ha logrado
protección de numerosos cultivos como tomate, tabaco, citrus, papaya, vid,
cucurbitáceas etc. Los casos más conocidos se describen en la transparencia 17. Sin
embargo, el uso de la protección cruzada tiene varias desventajas. Algunas de ellas se
mencionan en la transparencia 18.
La transparencia 19 resume las estrategias de resistencia a virus que pueden
implementarse utilizando ingeniería genética. Para una revisión general de las
estrategias disponibles pueden consultarse las referencias que se enumeran al final de
la clase. Las estrategias señaladas en color amarillo se desarrollarán en más detalle
en esta clase.
Resistencia derivada del patógeno mediada por la expresión de proteínas virales
Transparencias 20-42
En 1985 Sanford y Johnston enunciaron por primera vez el concepto de resistencia
derivada del patógeno y propusieron una estrategia general para obtener resistencia a
un patógeno expresando funciones clave del mismo en proporción inadecuada o en
forma disfuncional en la célula huésped. Debido a que se conocía bien su genoma y
ciclo de vida, los autores utilizaron al bacteriófago Q como modelo para ilustrar esta
teoría. Este virus codifica tres proteínas: una proteína de cápside viral, una proteína
que constituye una subunidad de la replicasa viral (el huésped provee las otras tres
subunidades) y una proteína de maduración (involucrada en la unión a los pili y a la
lisis posterior de la bacteria huésped). La proteína de la cápside tiene un rol regulatorio
además de un rol estructural. En una etapa tardía del ciclo de multiplicación viral, ésta
proteína se une al cistrón que codifica la replicasa viral, arrestando así la transcripción
de éste gen y la multiplicación viral y permitiendo el ensamblaje de las partículas
virales. Estos autores propusieron colocar el gen de la cápside viral bajo el control de
un promotor constitutivo de Escherichia coli de manera que, al ingresar el bacteriófago
a la célula, la abundancia de cápside viral provocara la represión de la replicasa y, con
ello, la resistencia al virus. Por otro lado, la replicasa viral tiene afinidad por el ARN
genómico viral y por las tres subunidades de la replicasa codificadas por el huésped.
Como alternativa, los autores propusieron expresar en bacterias versiones mutadas de
la polimerasa viral que posean una afinidad normal por el genoma viral, pero que sean
incapaces de unirse a las subunidades del huésped, lo que inhibiría así la replicación
viral.
La transparencia 22 muestra el ciclo replicativo generalizado de un virus a ARN. En
esta y otras transparencias posteriores, se señalan en un color distinto las etapas que
pueden ser alteradas por ingeniería genética con el propósito de desarrollar
resistencia. Todos los pasos señalados resultan críticos para el normal desarrollo del
ciclo viral y un bloqueo en cualquiera de estos niveles promovería la pérdida de
virulencia total o parcialmente. Uno de estos pasos críticos es la decapsidación del
virión, proceso que ocurre inmediatamente después que este ingresa en el citoplasma
de la célula vegetal.
El primer antecedente de resistencia a virus de plantas introducida por ingeniería
genética se debe a los experimentos realizados por el laboratorio de Roger Beachy en
1986. Tratando de confirmar los postulados de Sanford y Johnston, este grupo
expresó en forma constitutiva el gen de la proteína de la cápside del Tobacco mosaic
virus (TMV) en plantas de tabaco. La transparencia 23 muestra ensayos tomados del
trabajo que describió por primera vez la resistencia mediada por esta estrategia
(“resistencia mediada por la proteína de la cápside”; CPMR). En el panel A, se muestra
el porcentaje de plantas de tabaco (cultivar Xanthi) que mostraban síntomas a distintos
días luego de la inoculación con TMV en tres líneas transgénicas (llamadas 3646,
3773 y 3404; representadas en los tres paneles inferiores) que expresan (barras
verdes) o no expresan (barras violetas) el gen de cápside del mismo virus. El número
entre paréntesis indica el número de plantas de cada tipo que fueron evaluadas. Como
control (panel superior) se analizó la evolución de los síntomas en plantas de tabaco
no transgénicas de dos cultivares, Xanthi (barra verde) y Samsun (barra celeste).
Mediante estos ensayos, se concluyó que las plantas que expresan el gen de la
proteína de cápside del TMV muestran un retraso en la aparición de los síntomas
debidos al virus. En el panel B, se midió el porcentaje de plantas de tabaco que
mostraban síntomas, a distintos días de la inoculación con concentraciones variables
de inóculo viral (2 μg/ml, 0,8 μg/ml y 0,4 μg/ml), en plantas que expresan (barras
verdes) o no expresan (barras violetas) el gen de cápside del mismo virus. El número
entre paréntesis indica el número de plantas de cada tipo. Mediante este ensayo se
concluyó que la eficacia del mecanismo de resistencia es inversamente proporcional al
nivel de inóculo viral. En general, las plantas protegidas mediante estos abordajes,
muestran un retardo temporal del desarrollo de síntomas, una atenuación en la
sintomatología característica de cada virus, una menor cantidad de sitios de infección
y un menor título viral. Se demostró asimismo que hay una correlación entre la
resistencia y el nivel de expresión de la proteína de la cápside, que la protección actúa
a nivel celular y es superada por altas dosis de inóculo (viriones).
La transparencia 24 muestra resultados de un trabajo realizado para intentar
determinar el mecanismo que origina la CPMR a nivel molecular. Los paneles A y C
muestran la acumulación de proteína de cápside de TMV en pg por célula en
protoplastos infectados con TMV (panel A) o con ARN de TMV (panel C). Los
protoplastos obtenidos a partir de plantas que expresan el gen de cápside del TMV
(CP+) se muestran en anaranjado y los protoplastos que no la expresan (CP-) se
muestran en azul. Los paneles B y D muestran la acumulación de ARN de TMV en pg
por cada 5.000 protoplastos de tabaco infectados con TMV (B) o con ARN de TMV (D)
en protoplastos obtenidos a partir de plantas que expresan (en naranja) o no expresan
(en azul) el gen de cápside del mismo virus. La comparación de los paneles A con C y
B con D muestra que si el inóculo es ARN viral, no se desarrolla resistencia. En C y D
las plantas CP+ se comportan igual que las plantas CP-, es decir no resisten a la
infección, con la consecuente acumulación de CP (C) y ARN viral (D). Es importante
destacar que este fenómeno no ocurre en otros casos de CPMR, como por ejemplo,
en el caso de resistencia al Potato virus X (PVX) y al Alfalfa mosaic virus (AIMV). Este
hecho depende probablemente de la localización de la secuencia genómica
responsable de la encapsidación, la cual determina también las características del
mecanismo de decapsidación.
En otros trabajos realizados para explorar el mecanismo efector en la protección
mediada por la cápside viral (transparencia 26), se midió la replicación de virus en
protoplastos derivados de plantas CP+ o CP- infectados con partículas de TMV pretratadas a pH 7,5 ó a pH 8. Si las partículas se pre-trataban a pH 7,5, se observaba
que los protoplastos de las plantas CP- eran susceptibles (el virus se replica en los
protoplastos), mientras que los protoplastos de las plantas CP+ son resistentes (el
virus no se replica). Por lo tanto, la resistencia observada se manifiesta a nivel celular.
El pretratamiento de las partículas virales a pH 8 causa una decapsidación (o
desnudamiento) parcial de las mismas. Cuando las partículas se pre-tratan de esta
manera, no se observan diferencias entre la replicación del virus en protoplastos de
plantas CP+ y CP-. Por lo tanto, cuando se desestabilizan las partículas de esta
manera, la resistencia mediada por cápside viral es sobrepasada. Esto indicaría que
en este caso la resistencia mediada por cápside actuaría inhibiendo una etapa
temprana del ciclo infectivo.
Una característica importante de la protección mediada por la cápside viral es que se
trata de una resistencia de amplio rango, lo cual es muy deseable desde el punto de
vista agronómico porque sirve para proteger a las plantas frente a muchas cepas de
mismo virus o de virus relacionados. En la transparencia 25 se observa un ensayo que
comprueba este efecto. Las plantas transgénicas que expresan el gen de cápside del
Soybean mosaic virus (SMV, un miembro de la familia Potyviridae) resultan protegidas
frente al mismo virus y frente a virus de la misma familia, tales como el Potato virus Y
(PVY) y Tobacco etch virus (TEV). Sin embargo, a la luz de la evidencia posterior,
debería establecerse si lo que se muestra en esta transparencia es CPMR fidedigna y
no un caso de protección mediada por el ARN viral.
La transparencia 27 muestra el resultado de otros experimentos realizados con el fin
de dilucidar el mecanismo actuante en la CPMR. Los experimentos fueron realizados
utilizando distintas variantes de TMV que fueron obtenidas introduciendo mutaciones
en el gen de la proteína de la cápside viral. Panel superior: Se muestran distintas
fracciones de una sedimentación en gradiente de sacarosa donde se sembró proteína
de cápside nativa o mutada. La cápside mutada T28W (TMV-T28W) penetra
pobremente en el gradiente porque la mutación impide el normal auto-ensamblaje de
la misma. La cápside mutante T42W (TMV-T42W) penetra en el gradiente más
eficientemente que la del virus wild type (TMV-U1) debido a que la mutación causa
una mayor eficiencia de auto-ensamblaje. Panel inferior: Se muestra un ensayo de
protección de plantas de tabaco transgénicas que expresan proteínas de cápside
nativa o mutadas frente a la infección con TMV. Las plantas Xanthi-nn (no
transformadas) y nn-T28W (transformadas con un gen de cápside portador de una
mutación que impide el ensamblaje normal) no resultaron protegidas y desarrollaron
síntomas. Las plantas 3646 (transformadas con el gen de la proteína de cápside
nativa), y las dos líneas de plantas nn-T42W (transformadas con el gen de cápside
portador de una mutación que induce un ensamblaje más eficiente que el wild type)
resultaron protegidas. Es decir se estableció una relación directa entre el nivel de
agregación de la proteína de cápside y el nivel de protección frente a TMV.
La transparencia 28 esquematiza el mecanismo más comúnmente aceptado para
explicar la CPMR. Este modelo es producto de una importante serie de evidencias
indirectas. Los principales pasos del mecanismo propuesto son: 1) entrada del virus a
la célula; 2) decapsidación viral mediada por receptores celulares R con afinidad por la
proteína de cápside viral (círculos celestes) (a) o mediada por otros factores
(concentración de Ca2+, pH, factores desconocidos) (b); 3) iniciación de la traducción
(el genoma se representa como una línea serpenteante verde y los ribosomas como
dos círculos rosados); 4) replicación del genoma viral. En las plantas CP+ no ocurriría
una efectiva decapsidación y expresión del genoma viral debido al bloqueo de los
sitios receptores R por la CP viral (2a) o, alternativamente, a una competencia en el
sentido contrario a la decapsidación entre la CP que forma parte del virión y la
codificada por el transgén (2b).
Existen numerosos reportes de CPMR en distintos patosistemas virus-planta. Como
puede observarse en la transparencia 29, estos ejemplos comprenden la mayoría de
los grupos virales conocidos, por lo que se pensó que este mecanismo era
potencialmente universal. Sin embargo, como se detallará más adelante, la mayoría de
los casos que se reportan en esta tabla, no pueden ser explicados por el modelo de la
transparencia anterior y responden a lo que comúnmente se conoce como “resistencia
mediada por el ARN viral” (la presencia de la proteína de cápside no es necesaria para
generar resistencia, pero sí el ARN correspondiente). La CPMR, en sentido estricto, se
aplica a los grupos de Potexvirus, Tobamovirus y Alfamovirus.
La transparencia 30 resume las principales características del mecanismo de la
CPMR. Estas características han sido deducidas de experimentos como los mostrados
en las transparencias anteriores. Es importante aclarar que, mientras en algunos
casos es necesaria la expresión de la proteína de cápside viral para que exista
protección, en otros casos esta protección se obtiene mediante la expresión del ARN
que codifica la cápside viral y no se requiere la presencia de la proteína. En este caso,
la resistencia está mediada por el ARN y su mecanismo de acción se detalla en las
diapositivas 45 a 58.
En la transparencia 31 se vuelve a presentar el ciclo generalizado de replicación de un
virus a ARN señalado posibles niveles de interferencia a nivel del proceso de
transcripción, el que es efectuado por una ARN-polimerasa viral ARN dependiente.
Como puede observarse, la polimerasa no sólo transcribe copias negativas del ARN
genómico viral, sino también de los ARNs subgenómicos que codifican las distintas
funciones virales. La polimerasa es traducida directamente a partir del ARN genómico.
En 1990 y 1992 se publicaron dos trabajos pioneros que demostraron la obtención de
plantas de tabaco resistentes a los virus TMV (Golemboski et al.) y Cucumber mosaic
virus (CMV) (Anderson et al.) mediante la expresión del gen de la replicasa viral. En el
primer caso se expresó la replicasa completa y en el segundo caso se utilizó una
replicasa que contenía una mutación que provocaba un corrimiento en el marco de
lectura y producía una replicasa trucada conteniendo el 75% de la secuencia wild type.
Las plantas resultaron resistentes a la multiplicación viral en el sitio de inoculación y al
movimiento del virus a larga distancia y sólo resultaron protegidas contra cepas
estrechamente relacionadas con la que dio origen al transgén. Luego de estos
trabajos, se reportaron casos de resistencia mediada por replicasas o versiones
mutadas de las mismas para Alfalfa mosaic virus (AMV), Cymbidium ringspot virus
(CyRSV), Pea early browning virus (PEBV), Potato virus Y (PVY), Potato virus X
(PVX), etc. Si la resistencia se debía a la replicasa en sí, se esperaba observar una
correlación entre el nivel de la proteína detectada en las plantas y la resistencia
obtenida. Asimismo, se esperaba que las plantas transformadas con versiones no
traducibles o mutadas en el sitio activo de la enzima no fuesen resistentes o tuvieran
una resistencia disminuida. Sin embargo, esto se observó solamente en los casos del
virus AMV (Brederode et al.) y CMV (Wintermantel and Zaitlin). En el resto de los
casos reportados, se demostró posteriormente que la resistencia dependía de la
expresión del ARNm de la replicasa y no de la proteína; es decir se trataba de
resistencia mediada por ARN (transparencias 45 a 58). La transparencia 32 muestra
los resultados obtenidos en uno de estos trabajos. La transparencia 33 presenta un
listado de algunos de los trabajos reportados sobre resistencia mediada por
polimerasas virales.
La transparencia 36 resume las características observadas en este tipo de resistencia.
La transparencia 37 muestra nuevamente el ciclo de replicación generalizado de un
virus a ARN viral, enfatizando otro posible punto para inhibir el proceso de infección.
En este caso, se trata del proceso de movilización viral de célula a célula, el cual
ocurre a través de estructuras especializadas denominadas plasmodesmos. La
transparencia 38 muestra una representación esquemática de un plasmodesmo. Los
plasmodesmos son canales estrechos que pasan a través de las paredes primarias de
dos células adyacentes y que alcanzan un número de unos 20.000 por célula en
algunos tejidos. A través de ellos se establece una continuidad espacial con los
citoplasmas de las células vecinas. Si se observa una sección transversal de un
plasmodesmo mediante microscopía electrónica, se observa una doble membrana: la
externa es la membrana plasmática, rodeada por una delgada capa de calosa y la
interna corresponde al desmotúbulo, que es una prolongación del retículo
endoplasmático compartido por las dos células vecinas; entre ambas membranas hay
una manga citoplasmática. Los componentes de la cara interna de la membrana que
forma el desmotúbulo se fusionan entre sí, de manera que el desmotúbulo no tiene
lumen. El transporte entre célula y célula está limitado a la manga citoplasmática que
rodea al desmotúbulo. Estudios de microscopía electrónica de alta resolución han
demostrado que en la membrana plasmática que rodea al plasmodesmo y en la cara
externa del desmotúbulo se localizan proteínas globulares de enlace (linking proteins).
Estas proteínas dividen la manga citoplasmática en microcanales que determinan el
tamaño máximo de las moléculas que pueden desplazarse por difusión y establecen
así un tráfico selectivo de macromoléculas, el podría ocurrir por un proceso similar al
trasporte entre el núcleo y el citoplasma. Se ha demostrado que durante el movimiento
de célula a célula de los virus ocurre una modificación de los plasmodesmos. Los
genomas virales codifican proteínas implicadas en esta modificación llamadas
proteínas de movimiento (MP). Los dominios funcionales compartidos por MPs de
diferentes virus, podrían en este caso competir por factores celulares comunes
requeridos para el movimiento. Es decir que, la resistencia adquirida resulta más
amplia comparada con la resistencia mediada por CP o REP, de acuerdo a los casos
reportados.
Las fotografías que se muestran en la transparencia 39 corresponden a un trabajo en
el que se demostró que la proteína de movimiento del PVX causa un aumento en el
límite de exclusión de los plasmodesmos. En estos experimentos, se utilizó una
versión recombinante de PVX que portaba el gen reportero uidA (GUS) para
microinyectar células de tricomas de Nicotiana clevelandii. Por lo tanto, la coloración
azul constituye un marcador de la replicación viral. Se observa que el virus que lleva
una versión mutada de la MP (paneles A y B) permanece confinado a la célula
microinyectada (panel A). Si se inyecta una célula con éste virus junto con dextrano F
de 10 kDa de peso molecular conjugado con un colorante fluorescente, se ve que la
fluorescencia también permanece confinada a la célula inyectada (panel B), ya que el
dextrano no es capaz de difundirse a través de los plasmodesmos a causa de su
tamaño. Si se realiza el mismo experimento utilizando el virus PVX-GUS, el que posee
un gen de MP no modificado, se ve que la fluorescencia asociada al dextrano se
difunde a las células 2, 3 y 4 del tricoma (panel C) lo que demuestra que la MP nativa
modifica el límite de exclusión de los plasmodesmos y habilita así el pasaje del
dextrano fluorescente hacia las células adyacentes. En el panel D, se detecta actividad
GUS en las células vecinas al sitio de inyección observándose coloración azul sólo en
la célula 2. En este caso, se interpreta que el dextrano conjugado con el colorante
fluorescente ha podido difundir más allá de las células en que ocurre la replicación
viral.
La transparencia 40 muestra una serie de ensayos realizados con plantas
transgénicas que expresan un versión mutada de la proteína de movimiento (p30) del
TMV. Se grafica la cinética del desarrollo de síntomas sistémicos en plantas
inoculadas con TMV o Tomato mild green mosaic virus (TMGMV). Al igual que el TMV,
el TMGMV es miembro de la familia Tobamoviridae. Se observa que las plantas 3A511 (+), que expresan una versión de la proteína p30 de TMV con una deleción entre
los aminoácidos 3 a 5, resistieron a la inoculación con distintas dosis de viriones del
mismo virus o del virus relacionado. Las plantas 3A5-11 (-), que no expresan la
proteína mutada, no resultan protegidas, como así tampoco las plantas no
transgénicas. Se considera que una planta está sistémicamente infectada cuando
exhibe síntomas de mosaico en más de una hoja.
La transparencia 41 muestra el comportamiento de plantas transgénicas de tabaco
que expresan una versión mutada de la proteína movimiento p13 del White clover
mosaic virus (WClMV; en color) o no transgénicas (en negro) frente a la infección con
distintas cepas (O y M) del mismo virus (paneles A y B) o con distintas dosis de un
Potexvirus relacionado (PVX, paneles C y D). Las plantas transgénicas resultaron
protegidas en todos los casos ensayados, aunque la protección disminuye ligeramente
cuando se usan inóculos mayores (panel D). Esto demuestra entonces que la
protección conferida por la MP del WClMV es de amplio espectro.
Es importante remarcar que en los casos reportados de protección mediada por la
expresión de proteínas de movimiento virales, se demostró que la protección era
mediada por la proteína y no por ARN. Toda la evidencia disponible apunta a que el
mecanismo de acción actuante en estos casos afecta el normal movimiento célula a
célula. La transparencia 42 enumera una serie de características de este tipo de
resistencia.
Resistencia derivada del patógeno mediada por ARN viral
Transparencias 45-58
En una serie de trabajos que involucraban la transformación de plantas con los genes
de proteínas de cápside o de nucleocápside de distintos Potyvirus y Tospovirus, se
observó que el grado de resistencia obtenido no dependía de la concentración de
proteína expresada y que, en varios casos, ni siquiera se requería la expresión de la
misma. Como estas observaciones contradecían claramente al modelo de CPMR, ya
que se obtenía protección en ausencia de la proteína de cápside, y se podía
desarrollar resistencia a partir de transcriptos no traducibles, se comenzó a acuñar el
término “protección derivada del ARN”, la que se constituyó así en una nueva
estrategia basada en la protección derivada del patógeno. La transparencia 46
muestra un experimento del primer trabajo donde se observó resistencia mediada por
ARN viral. En el mismo, las plantas RC#5 expresan una versión no traducible del gen
de la proteína de cápside de un Potyvirus, el TEV, y las plantas AS#3 expresan una
versión antisentido del mismo gen. Ambos tipos de plantas transgénicas son
resistentes a la infección por TEV. Como las plantas producen abundante cantidad de
transcriptos de ARNm en ambos casos, se consideró que la resistencia estaba
mediada por el ARN y no por la proteína.
La transparencia 47 muestra experimentos realizados en 1993 en el laboratorio de
Dougherty con plantas de tabaco que expresaban la proteína de cápside del TEV. En
el panel izquierdo se observan los síntomas inducidos por TEV en plantas de tabaco
transgénicas (foto superior) y sin transformar (foto inferior). Las hojas 1, 2, 3
corresponden a la parte inferior, media y superior de la planta, respectivamente. Las
plantas CP+ muestran el fenotipo de recuperación; las hojas más jóvenes tienen cada
vez menos síntomas. El panel derecho muestra un análisis de los niveles de la
proteína de cápside de TEV (A) y del ARN correspondiente (B), en extractos foliares
de plantas transgénicas que presentaban el fenotipo de recuperación (asintomáticas) o
de no transgénicas no infectadas con el virus. Se observa que las hojas de las plantas
CP+ recuperadas (calles 4, 6, 8) no acumulan ARN derivado del transgén.
A pesar de que algunas plantas transgénicas resultaban resistentes, la resistencia
mediada por ARN no era un fenómeno consistente, ya que no todas las plantas que
expresaban una determinada secuencia viral respondían al mismo fenotipo. De hecho,
la mayoría de las plantas transformadas con una secuencia viral eran susceptibles al
virus en cuestión, algunas mostraban el fenotipo de recuperación y sólo unas pocas
eran resistentes desde el inicio (inmunidad). Los trabajos pioneros demostraron que el
nivel de resistencia guardaba una estrecha relación con los niveles de transcriptos del
transgén y que, normalmente, esta relación dependía del número de copias del mismo
integrado al genoma de la planta. A partir de los resultados obtenidos en aquel
entonces, se sabía que el mecanismo responsable conducía a la degradación
citoplasmática del ARN viral infectivo y, para que el mismo ocurriera, se postulaba la
necesidad de la presencia de ARNdc. Sin embargo, los mecanismos que
determinaban gatillaban este proceso y al a formación de ARNdc resultaban todavía
oscuros.
Uno de los primeros modelos que intentó explicar estas observaciones fue el modelo
del umbral. Este modelo postulaba que se requiere un nivel umbral de ARN homólogo
al del virus para iniciar la respuesta de silenciamiento postranscripcional. En la
transparencia 47 se muestra una representación esquemática de las asunciones de
este modelo. Se representan los niveles de ARN a ser silenciado en tres situaciones
distintas. Las plantas que contienen entre 3 y 8 transgenes (A) superan el umbral de
transcripción requerido para desencadenar el silenciamiento y muestran resistencia.
Algunas plantas con 1 ó 2 transgenes sólo exceden este nivel en presencia del ARN
viral (B) y la resistencia se desarrolla tiempo después de la infección. Este caso
permitiría explicar el fenotipo de recuperación. Otras plantas con 1 ó 2 transgenes no
expresan suficiente ARN para superar el umbral aún en presencia del virus (C) y son
por lo tanto susceptibles. La transparencia 48 ilustra un modelo temprano desarrollado
para tratar de explicar el fenómeno de resistencia mediada por ARN. Como se verá
luego, existen explicaciones alternativas para explicar estos resultados. La
transparencia 48 resume las principales conclusiones derivadas de los experimentos
de Dougherty.
Según se desencadene antes o después de la transcripción, el silenciamiento génico
puede ser transcripcional (TGS; transcriptional gene silencing) o postranscripcional
(PTGS; post-transcriptional gene silencing). La transparencia 51 presenta las
definiciones actuales de TGS y de PTGS. En las restantes transparencias de este
bloque se profundizará solamente en la descripción del fenómeno de PTGS. La
transparencia 52 presenta un esquema actualizado en que se enfatizan las distintas
vías de entradas al PTGS. Durante la replicación de virus a ADN o durante la
transcripción de transgenes en copia única se producen intermediarios de ARNsc
“aberrantes” (por ejemplo truncados) que son convertidos en ARNdc por un sistema de
vigilancia y amplificación mediado por una ARN polimerasa. Los transgenes que
contienen secuencias repetidas invertidas producen ARNdc independientemente de
éste sistema por apareamiento intramolecular. Los virus con genoma de ARN
producen ARNdc como parte de su ciclo de replicación. En todas ellas, la presencia de
ARNdc juega un papel central y constituye el factor desencadenante del proceso de
degradación del ARN.
La transparencia 53 muestra un modelo de los mecanismos operantes en el PTGS en
plantas y animales. Independientemente de cómo se activa el sistema, se produce una
acumulación de ARNdc, que a su vez es procesado por una enzima de tipo Dicer
(originalmente descripta en Drosophila) dando lugar a fragmentos de ARN pequeños
de 21 a 23 nt (siARNs) que se incorporan a un complejo llamado RISC (por RNA
Induced Silencing Complex) que degrada el ARN en forma dependiente de secuencia.
RISC utiliza la hebra antisentido de los siRNAs para silenciar el ARNm blanco. En
ausencia de siARNs, RISC no posee capacidad de unir ARNm en forma secuenciaespecífica. En presencia de siARN, RISC participa de la degradación del ARNm
homólogo en forma cíclica. En plantas y gusanos la hebra antisentido de siARN puede
participar primeramente de un proceso de amplificación. La hebra antisentido se une a
una ARN polimerasas ARN-dependiente que puede unirse al ARNm complementario y
actuar como punto de partida para la síntesis de nuevo ARNdc. Las enzimas de tipo
Dicer intervienen luego para generar siARNs y el proceso continúa con la degradación
del ARNm blanco. La transparencia 54 muestra un modelo alternativo para explicar los
mecanismos que conducen a la iniciación del PTGS. La esencia de este modelo es
que las ARN-polimerasas ARN-dependientes presentes en el citoplasma pueden
reconocer ARN “aberrantes” (por ejemplo, desprovistos de poli (A) o de “CAP” y
utilizarlos como molde para producir ARNdc. Este ARNdc sería entonces procesado
por las enzimas de tipo Dicer dando lugar a la producción de siARNs y gatillando el
proceso de degradación. La aparición de ARNs aberrantes puede ser una
consecuencia de las tasas transcripcionales excepcionalmente altas que ocurren al
sobreexpresarse un transgén, por lo que este modelo no sería esencialmente
incompatible con el modelo del umbral.
Al avanzar la investigación sobre el silenciamiento, se observó que, si se injerta un
tallo de una planta no silenciada sobre una base silenciada, el tallo injertado se
silencia progresivamente (transparencia 56). Esto demostró la existencia de una señal
de silenciamiento que se propaga por la planta de célula a célula vía plasmodesmos y
a larga distancia por el floema. La señal es también específica de secuencia, ya que el
tallo injertado sólo se silenciaba si expresaba un transgén homólogo al transgén
presente en la base silenciada. La transparencia 57 muestra otro ejemplo de
transmisión sistémica del silenciamiento. En el panel de la izquierda, se esquematiza
una planta transgénica para el gen reportero gfp (que codifica la Proteína de
Fluorescencia Verde, Green Fluorescent Protein), la que se visualiza de color verde
amarillento cuando se la ilumina con luz ultravioleta. Cuando esta planta es
bombardeada con un plásmido de ADN que sobreexpresa el mismo gen bajo un
promotor fuerte, se desencadena el fenómeno de PTGS y se silencia el transgén GFP.
Las zonas silenciadas se ven rojas a la luz ultravioleta. La foto muestra las hojas
inferiores silenciadas y el establecimiento paulatino del silenciamiento en las
nervaduras de las hojas superiores. Eventualmente, el silenciamiento del gen gfp se
establece en todos los tejidos de la planta.
Las evidencias descriptas, junto con la descripción de proteínas virales supresoras
(ver transparencias siguientes), llevaron a postular que una de las principales
funciones del PTGS en las plantas es la defensa contra la invasión de secuencias
foráneas, entre ellas, las virales. En consecuencia, resulta consistente con esta
hipótesis que cualquier virus que produzca intermediarios de ARNdc, tenga el
potencial de desencadenar dicho fenómeno. De hecho, esto ha sido comprobado en
numerosos casos utilizando vectores virales para silenciar genes específicos. El
fenómeno se denomina silenciamiento génico inducido por virus (VIGS). En la
transparencia 68 se muestran tres ejemplos de VIGS diseñados para silenciar distintos
transgenes y genes endógenos de Nicotiana. El panel A muestra las variantes virales y
los procedimientos utilizados para inducir VIGS. La figura superior esquematiza el
genoma del virus PVX donde los rectángulos verdes corresponden a los marcos
abiertos de lectura de cada una de las proteínas virales. La figura inferior muestra un
virus recombinante al que se añadió la secuencia que se desea silenciar (rectángulo
azul). Si se inocula una planta con éste virus recombinante, se desencadena el
fenómeno de VIGS y las plantas muestran el fenotipo silenciado (color azul). Los
paneles B a G muestran ejemplos de silenciamiento mediado por VIGS de los genes
de celulosa sintetasa (B, C), de la fitoeno desaturasa (D, E) (genes endógenos) y de
GFP (F, G) (transgén gfp). En este último ejemplo, la planta emite fluorescencia de
color verde claro cuando es iluminada con luz UV. Cuando el transgén se silencia por
inoculación con un virus que porta el gen gfp, las zonas inicialmente infectadas emiten
fluorescencia roja debido al silenciamiento de la secuencia homóloga (la fluorescencia
roja proviene de la clorofila y se hallaba previamente enmascarada por la expresión de
GFP). Posteriormente, la fluorescencia roja se extiende a toda la planta, en forma
concomitante con el avance del proceso de silenciamiento.
La transparencia 58 resume las principales características del fenómeno de PTGS que
han sido descriptas en las transparencias anteriores. Un punto interesante para
destacar en vistas a obtener la aprobación de un producto biotecnológico, es que
debido a que el mecanismo de silenciamiento implica una muy baja acumulación del
ARN derivado del transgén y una nula acumulación de proteínas, este tipo de
estrategia resulta atractiva desde el punto de vista de la evaluación de riesgos.
Además, la baja acumulación de ARN transgénico minimiza las posibilidades de una
potencial recombinación homóloga con ARN de origen viral infectante.
Supresión del silenciamiento génico post-transcripcional
Transparencias 59-71
La transparencia 60 muestra un procedimiento que ha sido muy utilizado para la
caracterización de actividades supresoras del PTGS. La técnica empleada para
visualizar el PTGS consiste en agroinocular una planta transgénica que expresa en
forma constitutiva un gen reportero (en este caso el gen gfp, cuya expresión es visible
por luz UV) con una construcción que expresa la misma secuencia del gen reportero
bajo un promotor fuerte. La alta tasa de transcripción que se obtiene mediante este
procedimiento es capaz de inducir el PTGS y silenciar la expresión del gen reportero.
En consecuencia, las plantas transgénicas, cuya fluorescencia inicial era de color
verde claro, pasan a emitir la fluorescencia roja propia de la clorofila.
En una serie de experimentos realizados en el laboratorio de Baulcombe en 1998, se
observó que en plantas silenciadas como se describe más arriba, el fenómeno de
PTGS se revertía al infectar las mismas con el virus PVY (transparencia 61).
Considerando que una de las funciones postuladas del PTGS era la defensa antiviral,
este resultado sugirió que los virus de plantas disponen de funciones capaces de
interferir con este mecanismo. En el trabajo descrito, los autores pudieron además
atribuir la función de supresión del silenciamiento a la proteína HC-Pro de PVY
(transparencia 62). Para ello, integraron individualmente todos los marcos de lectura
presentes en el genoma de PVY en una copia del virus PVX que usaron como vector
(este virus no suprime normalmente la iniciación del silenciamiento). La agroinfiltración
con las distintas versiones quiméricas de PVX permitió determinar que la función
supresora residía en HC-Pro.
Luego de estos primeros experimentos, los reportes sobre la presencia de proteínas
supresoras en virus de plantas se multiplicaron rápidamente. En general las proteínas
a las que se atribuyó actividad supresora habían sido previamente caracterizadas
como proteínas determinantes de síntomas y/o responsables del movimiento viral. La
transparencia 63 enumera algunas de las proteínas virales supresoras que han sido
mejor caracterizadas. Más recientemente, se ha descrito la presencia de una proteína
con actividad supresora de silenciamiento en un virus animal, incluso conservando su
funcionalidad en un sistema vegetal.
Una conclusión interesante de estos estudios con proteínas supresoras es que la
acción de las mismas se ejerce a distintos niveles de la respuesta de silenciamiento
(transparencias 64 y 65). Así, algunas proteínas supresoras tienen actividad a nivel
celular (en la etapa de establecimiento del silenciamiento) y otras a nivel de la señal
sistémica (propagación del silenciamiento). Los supresores virales son una poderosa
herramienta para: a) disecar los pasos de inicio, propagación y establecimiento del
silenciamiento; b) sobreexpresar genes de interés en plantas transgénicas o en
sistemas de expresión transitoria; c) estudios de genómica funcional.
El sinergismo entre distintas especies de virus de plantas es un fenómeno común que
ha sido descrito en numerosos casos por los fitopatólogos. El fenómeno es específico
para determinadas especies de virus y la base molecular del mismo era desconocida
hasta hace no mucho tiempo. Los estudios sobre los genes virales involucrados en la
supresión del PTGS han permitido echar nueva luz sobre estas interacciones. La
expresión de proteínas virales en plantas transgénicas permitió establecer las bases
moleculares del fenómeno de sinergismo. Las fotos que se muestran en la
transparencia 67 ilustran el incremento de patogenicidad de los virus CMV y TMV
sobre plantas de tabaco que expresan la región P1/HC-Pro del genoma del PVY. Era
bien conocido que tanto CMV como TMV (virus no relacionados entre sí) eran capaces
de producir en tabaco infecciones sinérgicas con PVY. Por otra parte, como se
comentó más arriba, se había demostrado que la región P1/HC-Pro de PVY codifica
una proteína supresora del PTGS. Dado que el PTGS es normalmente
desencadenado por las infecciones virales, la presencia de un supresor del
silenciamiento (en este caso codificado por el transgén) provoca un aumento en la
severidad de los síntomas provocados por CMV (panel B) y TMV (panel D). En estas
plantas, CMV y TMV se acumulan más allá de los niveles normales en las plantas no
transgénicas. La presencia de proteínas virales supresoras del PTGS correlacionadas
con un aumento de los síntomas es un argumento adicional sobre el significado
biológico del PTGS. Parece razonable que, si éste representa un mecanismo de
defensa antiviral, los virus hayan desarrollado mecanismos para desbordarlo durante
su co-evolución con las plantas hospedantes.
La idea de que el PTGS evolucionó como un sistema de defensa antiviral en plantas
surgió inicialmente de la observación de que los virus con genoma a ARN que replican
en el citoplasma son tanto inductores como blanco del silenciamiento. A medida que
se profundizó en el estudio del mecanismo responsable del PTGS, se encontraron
más evidencias que apoyan esta hipótesis que se enumeran la transparencia 70.
Debido a que su especificidad está determinada por el reconocimiento de una
secuencia homóloga a la del virus invasor, esta respuesta defensiva puede adaptarse
a prácticamente cualquier virus que presente una forma de ARNdc.
Ejemplos de resistencia a virus de plantas por ingeniería genética
Transparencias 72-89
El virus Papaya ringspot virus (PRSV) causa una enfermedad en las plantas de
papaya que constituye el principal factor limitante en la producción de esta fruta. El
virus pertenece al género Potyvirus y es transmitido por áfidos. Fue descubierto en
Hawaii en la década del 40 y llegó a casi eliminar la producción de papaya de esta
región. Hacia fines de los 80 un grupo de la Universidad de Cornell dirigido por
Gonsalves comenzó a trabajar en el desarrollo de una estrategia de protección
mediada por secuencias derivadas del patógeno. El grupo estableció un protocolo de
transformación de papaya por bombardeo de embriones de los cultivares de papaya
comerciales. En 1991, se identificaron las primeras líneas transgénicas que
expresaban secuencias del gen de cápside del PRSV y al año siguiente se realizó una
primera evaluación a campo cuyos resultados se muestran en la transparencia 74. Las
fotos muestran el comienzo (panel superior) y el fin de un ensayo, varios meses
después (panel inferior). Las plantas transgénicas y control están entremezcladas en
la misma parcela. Las plantas que sobreviven son las correspondientes a las líneas
transgénicas. En 1994, se realizó una evaluación a gran escala que demostró que las
plantas transgénicas no se infectaban con PRSV y producían frutas de la misma
calidad que las plantas no infectadas. Finalmente, en 1998 se autorizó la
comercialización de éstas plantas transgénicas en EEUU. El inserto muestra síntomas
típicos de la infección viral en una planta no transgénica (derecha) y ausencia de los
mismos en una planta transgénica (izquierda). La transparencia 74 muestra algunos
datos obtenidos en estos ensayos de campo.
La transparencias 75-77 muestran las construcciones genéticas y los ensayo de
evaluación de resistencia en plantas transgénicas de papa que expresan los genes de
las cápsides de los virus PVX y PVY. Estas líneas de trabajo se desarrollaron en
INGEBI-CONICET y fueron motivo de un proyecto de colaboración con la industria. El
ensayo con PVX se hizo en cámara de cría bajo condiciones controladas. Las plantas
fueron mecánicamente inoculadas con PVX y la acumulación del virus se midió a
distintos días post-infección mediante ensayos de ELISA. Se observó que, mientras la
cinética de infección era normal en las plantas control, en las transgénicas se
evidenciaban distintos niveles de resistencia. En algunos casos, las plantas se
comportaron como inmunes al virus. La resistencia descripta responde al modelo de
CPMR. Los ensayos con PVY se realizaron en condiciones de invernadero y de campo
en distintas localidades de la Argentina. En este caso, la resistencia responde al
modelo mediado por ARN. Como resultado de los mismos se han seleccionado líneas
de papa altamente resistentes a PVY que hoy se encuentran en los estadios finales
del proceso de evaluación.
El avance de los conocimientos sobre los mecanismos que regulan PTGS permitió
utilizar este fenómeno con fines biotecnológicos. Debido a que la formación del ARNdc
juega un papel principal en su desencadenamiento, varios autores procuraron
sintetizar moléculas de este tipo in planta para hacer más eficiente este proceso.
Existen varias formas de lograr este objetivo. En la transparencia 78 se comparan las
eficiencias de distintas construcciones genéticas para desencadenar el PTGS en una
planta transgénica. En general, cualquier construcción que origine transcriptos
conteniendo estructuras de doble cadena es una inductora eficiente de PTGS
(comparar las dos primeras construcciones con las demás). Las construcciones más
eficientes fueron las que contienen la secuencia a silenciar en orientación sentido y
antisentido con un intrón intercalado o una secuencia cualquiera entre ambas. Esta
disposición de secuencias da lugar a transcriptos que se pliegan sobre sí mismos en
forma de horquilla (ARNhp). En el caso de intercalarse un intrón, éste se procesa
dentro del núcleo de la célula transformada dando lugar a ARNdc de extremos
protruyentes cortos. Se ha reportado la construcción de vectores que permiten clonar
cualquier secuencia en orientación sentido/antisentido para obtener transcriptos de
este tipo. En el esquema inferior se muestra una construcción basada en el vector
HANNIBAL diseñada para silenciar una secuencia del virus PVY, y obtener así
resistencia a este virus. Una ventaja particular de esta clase de construcciones es que
las regiones de ARNdc pueden contener secuencias de más de un virus, por lo que se
pueden generar resistencias múltiples sin necesidad de retransformar las plantas con
distintas construcciones. La extensión de las secuencias virales que pueden inducir el
silenciamiento puede ser tan corta como 30 nt, pero generalmente se utilizan
secuencias de 200-300 nt. La transparencia 79 muestra una construcción de tipo
“horquilla” que contienen secuencias de ARNdc provenientes de genomas de los virus
PVY y Potato leaf roll virus (PLRV). La transparencia 80 muestra ensayos de infección
realizadas en condiciones de invernadero de las plantas transformadas con esta
construcción. Este trabajo fue desarrollado en INGEBI-CONICET.
La transparencia 81 presenta otra variante para la obtención de resistencia mediada
por ARN, se trata del uso de micro ARNs (miARNs). Los miARNs, a diferencia de los
siRNAs, son ARNs endógenos pequeños que regulan la expresión de genes tanto en
plantas como animales, mediando de igual manera la degradación específica de ARNs
mensajeros complementarios. Estos miARNs de 21 nucléotidos se procesan a partir
de regiones de “stem loops” de transcriptos primarios largos, que pueden ser
rediseñados contra genes blanco involucrados en la replicación del virus, hablamos
entonces de miARNs artificiales o amiARNs. Este sistema presenta algunas ventajas
con respecto a usar las construcciones de dcARN. Por un lado, el mecanismo de
resistencia mediado por miRNA en general no es sensible a la temperatura. Por otra
parte, en el caso de los amiARNs las secuencias virales que se expresan en las
plantas transgénicas son de menor tamaño que en las estrategias clásicas de
silenciamiento, disminuyendo la probabilidad de afectar blancos endógenos
potenciales, aunque también resulta en un sistema más susceptible a verse superado
debido a mutaciones sobre la secuencia blanco viral.
El virus PLRV es el agente causal de una importante enfermedad en papa. La
transparencia 83 muestra un ensayo realizado para demostrar la presencia de PTGS
en tejidos de plantas transformadas con la replicasa de PLRV. La construcción A
contiene al gen uidA y da lugar a un transcripto que codifica la enzima glucuronidasa (GUS). Cuando se transforman transitoriamente hojas de plantas no
transgénicas (NT), transgénicas resistentes (R) o susceptibles (S) a PLRV con la
construcción A por biobalística, se ve igual cantidad de puntos azules debido a la
expresión de GUS (la enzima produce un producto azul cuando se incuba con el
sustrato cromogénico). La construcción B da lugar a un transcripto que codifica una
proteína de fusión compuesta por las secuencias de GUS y de la replicasa de PLRV
(codificada en el ORF 2b). Cuando se utiliza ésta construcción para bombardear hojas
de plantas transgénicas que han desarrollado el fenómeno de silenciamiento (CE1) no
se ven puntos azules. Esto se debe a la degradación del transcripto de fusión por el
mecanismo de PTGS, ya que éste contiene secuencias blanco de la degradación
específica (el ORF 2b presente en las plantas transgénicas). Se asume que las plantas
en que el silenciamiento es más fuerte mostrarán mayores niveles de resistencia a
dicho virus. Las plantas no transgénicas o transgénicas susceptibles muestran gran
cantidad de puntos azules. Este trabajo fue desarrollado en el Instituto de
Biotecnología del INTA.
El Rice hoja blanca virus (RHBV) causa la enfermedad viral de mayor importancia de
arroz en América del Sur, Central y el Caribe. La transparencia 84 ilustra un trabajo
desarrollado para obtener plantas de arroz resistentes contra este virus. Las plantas
transgénicas para el gen de la nucleocápside viral presentaron una reducción
significativa del desarrollo de los síntomas característicos de la enfermedad. Las
plantas transgénicas presentaron lesiones típicas de la Reacción Hipersensible (con
necrosis alrededor de el sitio de inoculación) y/o el fenotipo de recuperación
(emergencia de hojas nuevas libres de síntomas). Las plantas transgénicas
expresaban el transcripto en muy bajos niveles, y no se detectó la proteína de la
nucleocápside viral. En conjunto los resultados sugieren que se trata de una
resistencia mediada por el ARN viral. Este trabajo fue desarrollado en el Centro
Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) de Colombia.
El virus Andean potato mottle virus (APMoV) es un virus a ARN de simple cadena que
pertenece al grupo de los Comovirus e infecta solanáceas como papa, tomate,
berenjena y pimiento. La transparencia 87 muestra resultados de un trabajo realizado
para obtener plantas de tabaco resistentes a este virus mediante la expresión del gen
de la proteína de la cápside bajo la dirección del promotor doble del transcripto 35S del
CaMV. Los paneles A y B muestran que no se detecta ARN viral en plantas no
transgénicas sin inocular (SR1; control negativo) y en plantas transgénicas resistentes
(R) pero sí en plantas no transgénicas inoculadas (SR1 inoc; control positivo) y en
plantas susceptibles (S).. Esto se debe a que la inducción de PTGS provocó la
degradación específica del ARN viral en las plantas resistentes. El panel C muestra un
control de carga de ARN total Este trabajo fue desarrollado en la Universidad Federal
de Río de Janeiro.
Existen numerosos reportes de plantas resistentes a virus en la literatura. En la tabla
de las transparencias 88-90 se muestran ejemplos del uso de técnicas de ingeniería
genética para obtener resistencia contra distintos grupos virales que afectan una gran
variedad de cultivos. Se han seleccionado ejemplos de trabajos realizados en países
en vías de desarrollo. Para una revisión más global sobre la evolución de la
investigación en este campo, se recomienda consultar a la base de datos Bio.DeC
(Biotechnologies in Developing Countries) de la FAO.
Resistencia derivada de la expresión de genes no virales
Transparencias 91-98
Cada molécula de anticuerpo está constituida por cuatro cadenas polipeptídicas: dos
pesadas (H) y dos livianas (L). En las cadenas livianas se distinguen dos regiones: la
región variable (VL), que incluye los primeros 107 aminoácidos, y la región constante
de la cadena liviana (CL), que incluye la segunda mitad de la cadena. Las cadenas
pesadas poseen también una región variable (VH), que involucra a los primeros 115
aminoácidos de la cadena. El resto de la cadena pesada (CH) se subdivide en 3
dominios de aproximadamente 110 aminoácidos cada uno (CH1, CH2 y CH3). Los
enlaces disulfuro que unen entre sí a las cadenas pesadas están localizados entre los
dominios CH1 y CH2; esta porción de la molécula recibe el nombre de región bisagra.
El sitio de unión del anticuerpo con el antígeno está determinado en forma conjunta
por la estructura de las regiones VL y VH. Por lo tanto, una molécula de anticuerpo
como la mostrada en la transparencia 92 posee dos sitios de unión, es decir, es
bivalente. La digestión enzimática de un anticuerpo genera dos fragmentos llamados
Fab (cada uno con un sitio de unión) y un fragmento llamado Fc, que incluye los
dominios CH2 y CH3. La porción Fc es la que define las propiedades efectoras de los
diferentes anticuerpos. Debido a que las regiones constantes no son requeridas para
el reconocimiento antigénico, es posible expresar en plantas moléculas más pequeñas
que retienen la especificidad de unión al antígeno. Estas moléculas incluyen a los Fab
y a los scFv (por single chain Fv). Estos últimos poseen las regiones variables de las
cadenas pesadas y livianas unidas por una cadena peptídica flexible y son los más
utilizados para su expresión en plantas debido a que penetran los tejidos blanco más
eficientemente y tienen un mayor recambio dentro de los tejidos. Una estrategia que
ha sido ensayada con éxito para desarrollar resistencia antiviral consiste en expresar
constitutivamente en las plantas anticuerpos de tipo scFv contra distintos componentes
virales.
La transparencia 93 muestra algunos de los resultados obtenidos en un trabajo en que
se expresó un anticuerpo scFv (single chain Fv) dirigido contra un sitio conservado de
la proteína de cápside del Artichoke mosaic virus (AMCV) en plantas de tabaco. La
expresión de scFvs en plantas es particularmente sencilla debido a su pequeño
tamaño y a que no se requiere de un ensamblaje posterior para que sean activos. Es
importante señalar que antes de realizar la construcción genética que permitirá
expresar el scFv en las plantas, es imprescindible hacer un relevamiento exhaustivo
de anticuerpos monoclonales contra la proteína de interés para seleccionar aquellos
capaces de reconocerla con una alta afinidad. A partir del hibridoma seleccionado, se
obtiene ADN y se amplifican la región codificante de las cadenas pesadas y livianas
por la técnica de PCR usando iniciadores adecuados. El panel izquierdo muestra el
porcentaje de plantas pertenecientes a dos líneas transgénicas (círculos vacíos) o no
transgénicas (círculos llenos) que resultan infectadas por el AMCV a distintos días
post-inoculación. Ambas líneas resultaron protegidas frente a la infección. En el panel
derecho se midió la acumulación de virus en μg por mg de proteínas de la hoja
inoculada y en la hoja inmediatamente superior. Si bien en las plantas transgénicas no
se observan diferencias en las hojas inoculadas, en las hojas superiores al sitio de
inoculación se acumula significativamente menos virus, lo que revela la existencia de
resistencia. Esta resistencia es específica para AMCV, ya que no se expresa al
inocular las plantas con virus no relacionados.
La transparencia 95 enumera algunas de las consideraciones a tener en cuenta para
la producción de anticuerpos en plantas. Para lograr una alta expresión, se utilizan
promotores fuertes y constitutivos para maximizar la transcripción. En general se utiliza
el promotor del transcripto de 35S del Cauliflower mosaic virus (CaMV) para expresión
en dicotiledóneas y el promotor del gen de la ubiquitina de maíz para expresión en
monocotiledóneas. Asimismo, los vectores utilizados incluyen frecuentemente un
intrón ya que su presencia puede incrementar los niveles de transcripción. Durante el
diseño de la construcción, es fundamental considerar el destino final de la proteína que
se desea expresar. En el caso de la expresión de anticuerpos recombinantes, se ha
demostrado que los mismos son más estables en algunos compartimientos
intracelulares, y que esto contribuye al rendimiento total. Así, los anticuerpos
recombinantes se acumulan hasta 10.000 veces más en el retículo endoplasmático
que aquellos expresados en citosol. El entorno del retículo endoplasmático favorece el
correcto plegamiento y ensamblaje de las cadenas.
Los genes R de resistencia en plantas codifican receptores que interactúan directa o
indirectamente con ligandos que están codificados por genes de avirulencia (o genes
avr) presentes en el patógeno. Este reconocimiento inicial desencadena respuestas
defensivas en el huésped. La ausencia de un determinado gen R en la planta o del
gen avr correspondiente del patógeno, determina una colonización exitosa por parte
del patógeno y el progreso de la infección. La respuesta defensiva mediada por genes
R y avr recibe el nombre de “resistencia gen a gen”. Se han clonado muchos genes de
resistencia a infecciones de plantas causadas por virus, bacterias, hongos, nematodos
e insectos. La familia más numerosa de genes de resistencia codifica proteínas que
contienen un dominio de unión a nucleótidos (denominado NBS, por nucleotide binding
site) y un dominio repetitivo rico en leucinas (denominado LRR, por leucine-rich
repeat). Los dominios NBS son sitios de unión a ATP y GTP. Los dominios LRR se
encuentran en proteínas muy diversas y funcionan como sitios de interacción proteínaproteína, carbohidrato-proteína y/o de unión péptido-ligando y están directamente
involucrados en la especificidad de la interacción gen a gen. Una estrategia de
relativamente poco explorada (debido sobre todo a la dificultad para aislar los genes
resistencia todavía en cuestión), es transformar plantas con genes R. Algunos genes R
ha demostrado una perdurabilidad notable a campo, lo cual es indicio de que el
mecanismo involucrado afecta funciones imprescindibles para el patógeno. Su
limitación principal es que, en general, la protección ofrecida por los genes R es de
rango estrecho y puede ser desbordada con el tiempo. Muchos de ellos son fácilmente
sobrepasados por los virus (en particular por aquellos de genoma a ARN) debido a la
alta tasa de variabilidad que éstos son capaces de desplegar en la naturaleza.
Posiblemente, la principal aplicación de esta estrategia sea transformar muchos
cultivares susceptibles de una misma especie, lo que introduce ventajas de tiempo
respecto al mejoramiento por métodos clásicos. Otra variante posible de este enfoque
es introducir varios genes R distintos en un mismo cultivo (apilamiento de genes) para
obtener resistencias más amplias.