Preparación de la Solución de 2

INDICE
CONSIDERACIONES GENERALES
1
TEST DE COAGULACIÓN POR GLUTARALDEHIDO
5
TEST DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC MODIFICADO
6
PRUEBA DEL ANTÍGENO BRUCÉLICO ACIDIFICADO
9
ELISA-I
11
SEROAGLUTINACIÓN EN TUBO Y 2-MERCAPTOETANOL
12
ELISA-C
15
POLARIZACIÓN FLUORESCENTE
16
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE
17
PRECIPITACIÓN EN GEL DE AGAR
20
REACCIÓN A LA TUBERCULINA
23
EXTRACTO RESOLUCIÓN 438/2006 y 115/99
28
Técnicas serológicas: consideraciones generales.
Las técnicas serológicas permiten la detección de anticuerpos específicos contra un
determinado antígeno. Para realizar un diagnóstico certero es necesario que el suero con
el cual se trabaja sea de la mejor calidad posible, y una de las características
fundamentales es que esté libre de hemólisis, ya que la presencia de hemoglobina puede
llegar a alterar el resultado de las pruebas.
Con el objeto de obtener suero de excelente calidad, el veterinario que realice la
extracción de sangre debe tener en cuenta:
- trabajar con material limpio y seco
- las jeringas deben tener émbolo en perfectas condiciones que permitan
un suave deslizamiento
-
las agujas de extracción deben ser de bisel corto, ya que el bisel largo permite la
entrada de aire produciendo hemólisis
-
cuando se trabaja con temperaturas ambientales extremas hay que tener la
precaución de acondicionar las muestras
-
identificar cada muestra con número, y colocarla en la gradilla siguiendo
siempre el mismo orden
-
ubicar las gradillas para su traslado al laboratorio en un recipiente donde no haya
movilidad para obtener una rápida exudación de suero
-. extraer aproximadamente 10 ml de sangre para que exude unos 4 ml de suero
En el laboratorio se puede esperar la retracción del coágulo a temperatura ambiente
o a baño María a 37º C, para luego centrifugar la muestra 5 minutos a 3000 rpm.
Una vez retraído el coágulo hay que sacar el suero con pipeta Pasteur con mucho
cuidado y es aconsejable dividirlo en alícuotas. Si no se trabaja con el mismo en el día,
hay que refrigerarlo o llevarlo a “freezer” (solamente se frizará el suero extraído por
medio de centrífuga).
En las pruebas diagnósticas que se hacen en el laboratorio es cotidiano el uso de
pipetas, sobre todo las de Bang, para brucelosis, por eso es importante saber que las
mismas se manejan siempre con el dedo índice y no con el pulgar, ya que este es
menos sensible.
1
La graduación de las pipetas es la que indica el número de color inscripto en la
parte superior de la misma, y la manera de medir una cantidad se hace enrasando en
cero y luego descargando la cantidad indicada. Ejemplo: para descargar 0.08ml en la
prueba BPA, enraso en cero y descargo hasta 0.08, el resto lo vuelvo a colocar en el
recipiente que contiene el suero.
Medición de la respuesta inmune humoral: clasificación de pruebas
Para medir
la respuesta inmune humoral se utilizan una serie de pruebas
diagnósticas según sea la enfermedad que se trate. Una enfermedad puede ser
diagnosticada con una o más pruebas, pero es importante saber que hay reacciones que
son más específicas que otras y que hay enfermedades que tienen legislación sobre el
tipo de diagnóstico a realizar.
Antes de comenzar con la clasificación es necesario tener en claro tres conceptos:
-
Sensibilidad: es la capacidad de una prueba para detectar animales enfermos
(verdaderos positivos) en una población enferma.
-
Especificidad: es la capacidad de una prueba para detectar animales sanos
(verdaderos negativos) dentro de una población sana.
-
Fundamento de una prueba: es aquello que nos permite poder visualizar la
reacción. Es muy importante que este concepto no se confunda con el objetivo
de la reacción. Ejemplo: el fundamento de la prueba de Inmunofluorescencia es
el uso de una sustancia fluorescente que nos permite ver la unión del antígeno
con el anticuerpo.
Las reacciones para medir la respuesta inmune humoral se clasifican en:
PRIMARIAS: son aquellas que miden la presencia del complejo antígenoanticuerpo.
2
Pruebas inmunoenzimáticas
*Elisa: el fundamento es la utilización de una enzima que genera una reacción
colorimétrica.
-indirecto: detecta Ac
-sandwich: detecta Ag
-competición: detecta Ac
*Western blotting: detecta antígenos mediante la combinación de
electroforesis proteica con Elisa o radioinmunoensayo.
Pruebas de inmunofluorescencia: se fundamentan en la utilización de sustancias
fluorescentes como marcadores.
*Directa: detecta Ag
*Indirecta: detecta Ac
*Citometría de flujo: detecta Ag
Pruebas de Radioinmunoensayo: se fundamentan en la utilización de isótopos
radioactivos como marcadores
-para detección de Ag
-para detección de Ac
SECUNDARIAS: son aquellas pruebas que miden una consecuencia de la
formación del complejo Ag-Ac y dependen de las características físicas del
antígeno.
Aglutinación: el antígeno es particulado, grande. Como los Ac son bivalentes
pueden establecer enlaces cruzados con partículas de Ag como bacterias y
aglomerarse o aglutinarse.
3
-Aglutinación:-- en placa
-- en tubo
-Aglutinación pasiva
-Coaglutinación
-Hemoaglutinación / inhibición de la hemoaglutinación
Precipitación: el antígeno en este caso es soluble, y en contacto con su Ac
específico forma complejos que se insolubilizan y precipitan.
-Difusión doble
-Inmunoelectroforesis
-Inmunodifusión radial
-Contrainmunoelectroforesis
Fijación de complemento: la activación (fijación) del complemento por Ac unido a
Ag hace que se generen complejos de ataque de membrana. Si el Ac se une a
glóbulos rojos estos se destruyen y sobreviene hemólisis.
TERCIARIAS
Neutralización: estimación de la capacidad de un Ac de neutralizar la actividad
biológica de un Ag cuando se mezcla con él in vitro.
Protección: neutralización in vivo. Se utiliza para determinar la capacidad
protectora de un Ac específico frente a su Ag.
4
TEST DE COAGULACION POR GLUTARALDEHIDO
.
Fundamento: se basa en la coagulación de las gammaglobulinas
Se utiliza para la detección de animales hipogammaglobulinémicos. Las proteínas del
suero forman un complejo insoluble en presencia de pequeñas concentraciones de
glutaraldehído.
Materiales:
1) Solución de glutaraldehído. La solución madre se prepara de la siguiente manera: a
4 ml de glutaraldehído al 25 % agregarle 6 ml de agua destilada; ésta debe ser
almacenada en frasco color caramelo en heladera no más de 15 días. Se usa 0,05 ml.
2) Suero de terneros 0,5 ml
3) Tubos de hemólisis.
Metodología:
Se utiliza la técnica de Sandholn.
Se extrae sangre de vena yugular a terneros de tres a siete días de edad, se deja coagular
y se extrae el suero.
a. Colocar en un tubo de ensayo 0,5 ml de suero.
b. Agregar 0,05 ml de glutaraldehído al 10 %.
c. Agitar y se dejar una hora a temperatura ambiente (controlar cada 10 minutos).
Interpretación:
Coágulo firme de color amarillo que puede tornarse opaco: POSITIVO (más de 0,6 g
% de gammaglobulina).
Sin coágulo: NEGATIVO (menos de 0,4 grs %).
Si se forma un gel semisólido: INCOMPLETA (entre 0,4 y 0,6 grs %).
5
TEST DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC
MODIFICADO
Fundamento
El test de Turbidez del Sulfato de Zinc Modificado (TTSO4ZnM) es un método
semicuantitativo que sirve para determinar el nivel de gammaglobulinas séricas y su
fundamento está basado en la precipitación de las mismas.
Los terneros después de calostrar y hasta los 15 días de vida tienen 1,5 grs % de
gammaglobulinas en el suero, valores por debajo del mencionado corresponde a un
calostrado incorrecto y los valores mínimos a un no calostrado.
Los potrillos después de recibir calostro deben tener 0,4 grs % (0,4 grs/100ml) de Ig en
el suero, los potrillos que tienen menos de esa cantidad aumentan los riesgos de
infección.
Materiales:
1) Muestra de suero sin hemólisis.
2) Pipetas de 0,1 ml, 1 ml y 5 ml.
3) Agua destilada.
4) Solución de sulfato de zinc (207 mg en 7 litros de agua destilada a pH neutro,
conservada a 4ºC)
5) Nefelómetro Nº 1 (0,1 ml de cloruro de bario al 1 % + 9,9 ml de ácido sulfúrico al
1 %).
6) Nefelómetro Nº 2 (0,2 ml de cloruro de bario al 1 % + 9,8 ml de ácido sulfúrico al
1 %).
7) Tubos de ensayo con sus respectivos tapones.
Metodología:
a. La muestra de sangre debe ser extraída por punción yugular con aguja limpia y
seca. Luego se deja reposar a temperatura ambiente hasta la exudación del suero,
debiéndose descartar si posee algún grado de hemólisis. La prueba debe
realizarse en el día, no pudiéndose utilizar sueros congelados o refrigerados.
b. Tomar un tubo de ensayo (igual al de los nefelómetros) y colocar 1 ml de agua
destilada.
c. Agregar 0,1 ml de la muestra de suero.
6
d. Agregar 5 ml de la solución de sulfato de zinc.
e. Homogeneizar la muestra hasta la aparición de la turbidez homogénea, no agitar
violentamente ni formar espuma.
f. Comparar la turbidez obtenida con los nefelómetros 1 y 2 (recordar que antes de
utilizar los nefelómetros se los debe homogeneizar bien y además taparlos en
forma correcta. Pueden conservarse 6 meses en heladera).
Interpretación:
Turbidez menor a la presente en el Nef. 1: Calostrado incorrecto.
Turbidez igual a la presente en el Nef.1: Calostrado incorrecto.
Turbidez intermedia entre Nef.1 y 2: Calostrado incorrecto.
Turbidez igual o mayor al Nef. 2: Calostrado correcto.
7
PLAN DE CONTROL Y ERRADICACIÓN DE BRUCELOSIS: Resolución 438/2006.
VACUNACIÓN: a todas las terneras entre 3-8 meses de edad con vacuna Brucella abortus cepa 19.
SANEAMIENTO: machos enteros de más de 6 meses de edad y hembras de más de 18 meses de edad.
-PRUEBAS TAMIZ: BPA (Prueba del Antígeno Bufferado en Placa), ELISA-I (Elisa indirecto)
Prueba sensible: detecta Ig G y M
Se clasifica a los animales como:
NEGATIVOS (-)
REACCIONANTES (+)
-PRUEBAS COMPLEMENTARIAS: SAT (Seroaglutinación en tubo). Detecta Ig G y M.
+
2-ME (2 mercapto-etanol). Detecta Ig G.
FPA (Prueba de la Polarización Fluorescente).
ELISA-C (Elisa competición).
Se clasifica a los animales como:
NEGATIVOS (+)
POSITIVOS (+)
-PRUEBA DEFINITORIA: FC (Fijación de complemento)
-VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA: PAL (Prueba del anillo en leche)
Prueba sensible, de rodeo, detecta Ac antibrucelas en leche.
ELISA-I (Elisa indirecto).
Se clasifica al establecimiento como:
NEGATIVOS (-)
SOSPECHOSOS (+)
8
PRUEBA DEL ANTÍGENO BRUCÉLICO ACIDIFICADO
(BPA)
Fundamento:
Es una prueba de aglutinación que se fundamenta en la unión de un Ac a su Ag
específico que se encuentra en estado particulado. En proporciones óptimas, esta unión
se manifiesta con la formación de grumos .
Es una prueba tamiz que se considera como negativa o positiva. A los animales se los
clasifica como negativos o reaccionantes respectivamente, debiendo estos últimos ser
sometidos a pruebas complementarias para su diagnóstico definitivo.
Es una prueba cualitativa de aglutinación en placa, que presenta la ventaja de ser
realizada en una sola dilución.
Materiales:
1) Antígeno corpuscular con 10 % de concentración celular, suspendido en una solución
tope a pH 3,8 y coloreado de azul.
2) Suero problema en perfectas condiciones (sin hemólisis ni contaminación).
3) Aglutinoscopio con placa de vidrio dividida en cuadrados de 4 x 4 cm.
4) Gotero estandar de antígeno, calibrado para distribuir exactamente 0,03 ml por gota.
5) Pipetas de Bang o automáticas.
6) Mezcladores (plástico, acrílico o vidrio).
7) Reloj de laboratorio.
Metodología:
Previo a la prueba, la placa, el suero y el antígeno deben estar a temperatura ambiente
(18 a 26 º C) durante 40 minutos.
Agitar suavemente el antígeno durante cinco minutos. Si el suero estuviera congelado,
descongelarlo y mezclarlo bien, invirtiendo el tubo varias veces.
a. Colocar la placa sobre el aglutinoscopio.
b. Con una pipeta de Bang (o automática) en posición de 45º y apoyada sobre la
placa de vidrio, depositar 0,08 ml de suero.
9
c. Con el gotero en posición vertical y a una altura de 3 cm dejar caer una gota de
0,03 ml de antígeno sobre el suero.
d. Mezclar bien el suero con el antígeno abarcando una superficie circular de 3 cm
de diámetro.
e. Retirar la placa de vidrio e imprimir dos o tres movimientos en forma rotativa
para homogeneizar la mezcla.
f. Colocar la placa sobre el aglutinoscopio y taparlo, permaneciendo la luz
apagada.
g. Efectuar una nueva rotación pasados los cinco minutos.
h. A los ocho minutos, rotando suavemente la placa, y con la luz encendida,
proceder a la lectura
Interpretación:
Las reacciones se clasifican en:
POSITIVAS: Cuando se forman grumos y el sobrenadante queda transparente.
NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es homogénea y sin grumos.
10
ENZIMOINMUNOENSAYO INDIRECTO (ELISA-I)
Fundamento:
El método recomendado por la OIE, validado en Argentina, se basa en el uso del
lipopolisacárido liso (LPS-l) de la membrana externa de B. abortus y de un anticuerpo
monoclonal anti-IgG1 de bovino conjugado con la enzima peroxidasa. Los anticuerpos
contra Brucella presentes en el suero o leche reconocen especificamente epitopes
presentes en el LPS-l. Al agregar el conjugado la anti-IgG1 se une al anticuerpo y la
enzima libre en presencia del substrato y un cromógeno produce un cambio de color. La
intensidad del color está directamente relacionada con la concentración de anticuerpos
presentes en la muestra .
11
PRUEBAS DE SEROAGLUTINACIÓN EN TUBO Y 2MERCAPTOETANOL (SAT + 2-ME)
Fundamento:
La prueba de seroaglutinación en tubos (SAT) o método de Wright tuvo su origen
en Inglaterra (Wright, 1.898). Actualmente se emplea cuando se desea conocer el
contenido total de anticuerpos brucélicos en el suero, en términos de Unidades
Internacionales por mililitro de suero (UI/ml); pues detecta la presencia de los
anticuerpos Ig.M e Ig.G. La prueba del 2-mercaptoetanol (2-ME) se basa en la
propiedad de esta sustancia química de degradar los anticuerpos Ig.M. Por lo tanto
es una prueba selectiva-cuantitativa, que detecta solamente la Ig.G existente en el
suero. Tuvo su origen en los EE. UU. (Anderson y col,1.964).
Son pruebas complementarias para el diagnóstico de la brucelosis bovina y se
examinarán por éstas técnicas todos los animales que hayan resultado positivos al
BPA.
Las pruebas de 2-ME y SAT deben hacerse en simultáneo por lo siguiente:
 La prueba del 2-ME da fenómenos de zona*, frecuentemente, con sueros muy
positivos. Esto no ocurre con SAT, si el antígeno está en bien elaborado.
 La prueba del 2-ME puede resultar negativa, en animales con infección
reciente, que todavía no tienen Ac. Ig.G, pero sí Ig.M, en cantidad de 100 UI o
más.
 La solución del 2-ME, pudo haberse alterado (oxidado) y la prueba estaría
midiendo erróneamente inmunoglobulinas, condenando a animales no
infectados.
* Fenómeno de zona o prozona: Inhibición de la aglutinación a causa de la
presencia de concentraciones altas de anticuerpos.
Materiales:
1)
2)
3)
4)
5)
Antígeno de Wright, estandarizado previamente
concentración de 4,5 % de Brucellas.
Solución salina fenolada al 5 ‰.
Solución de 2-mercaptoetanol ( 2-ME) 0,1 Molar.
Solución fisiológica.
Suero problema.
y
Preparación de Solución Salina Fenolada:
Colocar en 955 ml de solución fisiológica,5 ml de fenol.
Preparación de Solución Fisiológica:
Colocar 8,5 grs de cloruro de sodio en agua destilada csp 1.000 ml.
Preparación de la Solución de 2-Mercaptoetanol:
12
mantenido
en
Agregar a 100 ml de solución fisiológica 0,78 ml de 2-mercaptoetanol solución
madre para obtener una solución 0,1 Molar (el 2-ME tiene un peso molecular de 78,13
grs). Esta solución es muy sensible a la luz, al calor y al aire, por lo que debe
conservarse en frasco color ámbar entre 4 y 8 ºC y descartarla transcurrida una semana.
Preparación del Antígeno para la prueba:
Agregar a 98 ml de solución fisiológica, 2 ml de antígeno.
6)
7)
8)
9)
10)
11)
Tubos de serología de 13 x 100 mm limpios y secos.
Gradillas portatubos.
Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 o jeringas automáticas dosificadoras de 1 ml.
Pipetas de Bang, limpias y secas.
Estufa o baño maría a 37,5 ºC.
Reloj de laboratorio.
Metodología:
a. Colocar en la gradilla dos hileras de tubos de 13 x 100 mm de cuatro
tubos cada una. Una hilera para SAT y la otra para 2-ME.
b. Con una pipeta cargar el suero hasta sobrepasar la graduación superior.
Con una toalla de papel limpiar el extremo de la pipeta, manteniéndola
en posición vertical hasta enrasar la graduación cero. Insertar la pipeta
hasta el fondo de los primeros tubos de las dos hileras (de cuatro tubos
cada una) y dejar que fluya 0,08 ml de suero en cada uno. Utilizando la
misma técnica se coloca 0,04 ml en los segundos tubos, 0,02 ml en los
terceros y 0,01 ml en los cuartos tubos.
c. Con una pipeta o jeringa automática agregar a cada tubo 1 ml de solución
salina fenolada (en la primer hilera) y 1 ml de solución de 2-ME (en la
segunda hilera); mezclar bien agitando la gradilla.
d. La dilución del suero en el primer tubo es de 1/25, en el segundo 1/50, en
el tercero 1/100 y en el cuarto 1/200.
e. Dejar la gradilla con las mezclas en reposo durante 60 minutos, a
temperatura ambiente. Agregar 1 ml de antígeno al 2 % en cada tubo,
mezclar bien agitando la gradilla.
f. Poner en la gradilla un tubo sin suero y depositar en él 2 ml de antígeno,
sirve de testigo para controlar el antígeno.
g. Incluir un suero que en SAT aglutine con un título de 1/200 o superior y
sea negativo a la prueba de 2-ME, sirve de testigo para controlar la
solución de 2-ME.
h. Incubar en estufa a 37,5 º C, durante 42 a 48 horas.
Interpretación:
En los días claros, se colocan los tubos frente a la ventana, a la altura de la vista. Si
hay poca luz natural se hace la lectura contra un fondo negro opaco, con una fuerte
luz que atraviese los tubos.
Las reacciones se clasifican en:
POSITIVA: se identifica con el signo (+). Si el líquido de la mezcla suero-antígeno
aparece claro y una suave agitación suspende los grumos sedimentados, sin
romperlos.
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INCOMPLETA: se identifica con el signo (I). Si la mezcla suero-antígeno aparece
parcialmente clara y una suave agitación suspende los grumos sedimentados y
algunos se desmenuzan completamente.
NEGATIVA: se identifica con el signo (-). Si la mezcla suero-antígeno no aparece
clara y una suave agitación no revela grumos.
Calificación de los animales:
o Los animales cuyos sueros dan reacciones negativas, se consideran
negativos, cualquiera sea la especie.
o Los animales caprinos, porcinos y ovinos, cuyos sueros dan reacción
positiva o incompleta en la dilución 1/25 y/o superiores se consideran
infectados.
o En los bovinos: los machos enteros y las hembras no vacunadas de
terneras se consideran infectados cuando sus sueros dan reacción
incompleta o positiva a la dilución 1/25 y/o superiores.
o Las hembras vacunadas de terneras se consideran infectadas, cuando sus
sueros dan reacción incompleta o positiva, a la prueba de 2mercaptoetanol, a partir de la dilución 1/50; sospechosas cuando dan
reacción positiva e incompleta en la dilución 1/25.
Los sueros de las hembras sospechosas deben examinarse de inmediato por la
prueba de fijación del complemento, de lo contrario, esas hembras deberán
apartarse en potreros aislados y serán sangradas transcurridas tres a cuatro
semanas.
Nota: El líquido del tubo testigo (para el antígeno) puede no aparecer claro y parte
del antígeno puede estar sedimentado en el fondo, al agitar el tubo, suavemente,
levanta el sedimento y se observa como una tenue columna de humo, que desaparece
rápidamente, porque no hay grumos.
Un fenómeno similar se observa con muchos sueros negativos (SAT),
principalmente si están contaminados.
El fenol es sólido (cristales). Para usarlo se licua, colocando el frasco (o mejor,
pasando parte de los cristales a otro frasco) en baño maría a 75 - 80 ºC.
14
ENZIMOINMUNOENSAYO COMPETITIVO (ELISA-C)
Fundamento:
La técnica descripta por Gall y Nielsen, validada en Argentina, se basa en el uso del
LPS-l de Brucella abortus como antígeno, un anticuerpo monoclonal M84 que reconoce
un epitope de la cadena O del LPS-l y un conjugado compuesto por un anticuerpo anti
M84 unido a la peroxidasa. Los anticuerpos contra Brucella spp. presentes en el suero
compiten con el M84 por su epitope específico e inhiben la reacción antígenoanticuerpo con el monoclonal.
Cuando un suero es negativo el M84 se une a su epitope y al agregar el conjugado la
peroxidasa en presencia del sustrato cromógeno produce color. Cuando un suero es
positivo el M84 es desplazado por los anticuerpos específicos del suero y el sustrato no
encuentra a la enzima por lo que no se desarrolla color.
La prueba detecta todos los isotipos de inmunoglobulinas presentes en el suero. Los
bovinos vacunados con cepa 19 producen temporalmente anticuerpos contra el
anticuerpo específico del M84, por lo que sólo después de los cuatro meses de efectuada
la vacunación ELISA-C permite discriminar anticuerpos provenientes de la vacunación
de los específicos de infección .
15
POLARIZACIÓN FLUORESCENTE (FPA)
En el curso del año 2006 se incorporan al Plan Nacional de Brucelosis las técnicas de
ElLISA y FPA por la Resolución 438/2006 del SENASA.
Fundamento:
Se produce in vitro una reacción antígeno-anticuerpo, enfrentando el suero de un animal
enfermo de brucelosis con una fracción de del antígeno de bruecella (cadena O), este
complejo forma una masa grande que en suspensión gira mas lentamente . Además ese
antígeno se conjuga con isotiocianato de fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos
haces de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados de despolarización en función
de su velocidad de rotación.
Metodología
12345-
Agregar 10 µl de suero problema a 1 ml de buffer.
Leer el blanco
Agregar 10 µl de Antígeno.
Incubar 2 minutos
Realizar la lectura.
Interpretación
Los resultados son expresados como (unidades de milipolarización mP) del suero
frente al anígeno.
SUERO POSITIVO + Ag. con IFTC = luz despolarizada mayor 105 mP.
SUERO NEGATIVO + Ag con IFTC = luz despolarizada menor a 94 mP.
16
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE
(PAL)
Fundamento:
La prueba del anillo en leche detecta la presencia de anticuerpos antibrucelas en leche.
Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado de azul formando un complejo
antígeno-anticuerpo que se adhiere a la superficie de los glóbulos de grasa de la leche
ascendiendo con ellos para formar la capa de crema coloreada (anillo).
En ausencia de anticuerpos específicos, la capa de crema será blanca y la columna de
leche estará coloreada por las células de brucellas teñidas (Ag.) que contiene en
suspensión.
Esta prueba se utiliza como test presuntivo para descubrir rebaños potencialmente
infectados en áreas de brucelosis.
Es empleada en la vigilancia epidemiológica para controlar las áreas libres y poder
descubrir los establecimientos en los que se reintroduzca la infección.
Tienen mayor exactitud en leche de varios animales y no en leche individual. La
efectividad de la vigilancia del PAL depende de la frecuencia de las pruebas hechas en
el rebaño:
Una sola prueba: 60 – 70 % de eficiencia.
Repetida a los 90 días: 95 % de eficiencia.
Se ha comprobado que la posibilidad de obtener una prueba del anillo en leche positiva
mezclando leche de 25 vacas, de las cuales dos son positivas a la seroaglutinación es de
96 % y cuando hay tres vacas positivas es del 99 %.
Materiales:
1) Muestra de leche
2) Antígeno de P.A.L.
3) Pipetas de 1 ml.
4) Tubos de hemólisis
5) Gotero que descargue 0.03 ml.
6) Heladera a 4 grados ºC
7) Estufa a 37 grados ºC
Metodología:
Toma de muestras:
En el campo: tan pronto se ha llenado el tanque, revolver bien el contenido para que la
dispersión de la nata sea homogénea, porque el exceso o bien la falta de grasa dificulta
la interpretación de la prueba. En un frasco, que contiene 5 ml de formol al 1 %, colocar
50 ml de leche. Para tomar la leche se utiliza un cucharón metálico, el cual se ha de
enjuagar cuidadosamente en agua después de utilizarlo. Las muestras bien identificadas
se transportan refrigeradas hasta el laboratorio evitando que se agiten vigorosamente.
Remitir la muestra informando el número de vacas que deriven leche al tanque.
17
Técnica:
a. Las muestras deben mantenerse en refrigeración a temperaturas de 4 a 6 ºC
hasta que hayan transcurrido no menos de 24 hs. de su recolección
(preferiblemente 48 a 72 hs.).
b. Una hora antes de ejecutar las pruebas, se llevan a temperatura ambiente
tanto la muestra como el antígeno a utilizar.
c. Mezclar la muestra invirtiendo varias veces el recipiente para disponer de
uniformidad de nata.
d. Tomar 1 ml de la muestra y colocarlo en un tubo de hemólisis.
e. Agregar una gota de antígeno de 0,03 ml, mezclar bien invirtiendo el tubo
varias veces sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno
sobre las paredes.
f. Incubar a 37 ºC durante una hora.
Interpretación:
(-)
Anillo de crema blanca, columna de leche azul.
(+) Anillo de crema y columna de leche del mismo color.
(++) Anillo de crema de color mas pronunciado que la columna de leche.
(+++) Anillo de crema color azul oscuro, columna de leche con algo de color.
(++++) Anillo de crema azul oscuro, columna de leche blanca.
Las reacciones se clasifican en negativas o positivas, en cambio los establecimientos
se clasifican como negativos o sospechosos, debido a que es una prueba presuntiva en la
que no hay evidencias directas de infección de animales individualmente.
Por lo expuesto anteriormente se deduce que es una prueba sencilla y de gran
efectividad, pero se debe respetar al máximo todas las indicaciones, de lo contrario se
obtendrán resultados falsos negativos o falsos positivos.
Falsos negativos:



El exceso o la escasez de crema dificulta la interpretación de la prueba.
La agitación vigorosa así como el uso de leche homogeneizada dificulta la
realización de la prueba.
El calentamiento de la leche interfiere en los resultados, por lo tanto la prueba no
se puede realizar con leche pasteurizada, a menos que se le agregue crema de
leche sin pasteurizar o que se la diluya con leche fresca de vacas negativas.
18
Falsos positivos:




Cuando la prueba se efectúa el mismo día que se ha recolectado la leche se
pueden obtener algunos resultados positivos falsos o dudosos.
La leche de calostro puede dar falsos positivos.
La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la
interpretación de la prueba debido a la decoloración del antígeno.
La leche de vacas próximas a secarse pueden dar resultados dudosos o falsos
positivos.
19
PRECIPITACIÓN EN GEL DE AGAR APLICADA AL
DIAGNÓSTICO DE AIE
Fundamento:
Se produce una reacción de precipitación cuando un Ag soluble es puesto en contacto
con su Ac específico, y cuando se encuentran en proporciones óptimas, forman una red
de complejos inmunes que se insolubilizan y precipitan.
Materiales:
1.
Agar: en el comercio existen varias marcas de agar para inmunodifusión. Tiene
la característica de ser muy purificado (no confundir con el agar bacteriológico
que se utiliza para la fabricación de medios de cultivos).
2.
Buffer: las soluciones de agar al 1 y 2 % utilizadas para
precipitación se deben preparar en el siguiente buffer:
a) Hidróxido de sodio........... 2 grs
b) Ácido bórico..................... 9 grs
c) Agua destilada c.s.p....1.000 ml
d) pH final: 8,6
e) Conservar a 4 º C.
la técnica de
3. Material de vidrio:
a) Placas de Petri.
b) Tubos de ensayo.
c) Frascos de vidrio (capacidad 10 ml Ej.: antibióticos).
d) Vasos de precipitado de 200 ml.
e) Probetas.
f)
Pipetas de Pasteur.
4.
Antígeno: el antígeno liofilizado se conserva a 4 º C, pero una vez reconstituido
se debe conservar congelado.
5.
Suero testigo o control: liofilizado conservar a 4 º C, y una vez reconstituido
congelarlo.
6.
Suero problema: sueros limpios, sin contaminación, que deben conservarse hasta
el estudio a 4 º C.
7. Cámara Húmeda: es el lugar donde colocaremos las placas a incubar. Consiste en
una caja que cierre correctamente (Ejemplo: una caja de transporte de vacunas) y
que en su interior contenga agua en poca cantidad. Esto es para evitar que se
deshidrate el agar de la placa impidiendo así la difusión de las proteínas a través
de los poros de gel.
8. Sacabocado de bronce.
20
Metodología:
PREPARACIÓN DEL AGAR: en cada una de las placas de Petri se deben
colocar 5 ml de agar al 2 % y 15 ml de agar al 1 %, por lo tanto en este paso
prepararemos las dos soluciones de agar y luego fraccionaremos en frascos de 5 y 15
ml respectivamente para agilizar el manejo posterior.
Una forma de preparar cantidades justas para no desperdiciar material es la
siguiente:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
Pesar 1 gr de agar para inmunodufisión y colocarlo en vaso de precipitado.
Pesar 1 gr de agar y colocarlo en otro vaso de precipitado.
Agregar al primer vaso 10 ml de buffer frío y al segundo 20 ml.
Calentar buffer en otro recipiente (aproximadamente 150 ml).
Una vez disuelto el agar con el buffer frío agregar 40 ml de buffer caliente al
primer vaso, y 80 ml al segundo. Así obtenemos en el vaso uno 50 ml de agar
al 2 % y en el vaso dos 100 ml de agar al 1 %.
Tanto el vaso uno como el dos se colocan a ebullición a baño María.
Una vez que entran en ebullición se debe medir el volumen final de cada uno
en una probeta, en caso de faltar solución por pérdida de agua agregar buffer
caliente.
Los 50 ml con agar al 2 % se distribuyen en frascos con cantidades justas de
5 ml cada uno, y los 100 ml de agar al 1 % se distribuyen en tubos de ensayo
en cantidades justas de 15 ml Luego tapar muy bien los frascos y tubos.
Una vez distribuído se debe conservar a 4 ºC. En estas condiciones dura
varios meses, luego el agar comienza a deshidratarse, y esto se comprueba
porque se desprende de las paredes de vidrio del recipiente que lo contiene.
PREPARACION DE LA PLACA:
a. Colocar una caja de Petri limpia y seca en la superficie de la mesada en posición
horizontal.
b. Poner a baño María el frasco con 5 ml de agar al 2 %.
c. Una vez que el agar se disolvió distribuirlo rápidamente en la placa porque se
puede solidificar antes de terminar la distribución. Si la temperatura ambiente es
baja se recomienda calentar un poco la placa de Petri.
d. Una vez que la primera capa de agar solidificó (15 minutos aproximadamente),
disolver a baño María el tubo con 15 ml de agar al 1%. Una vez disuelto
distribuir con cuidado sobre la primera capa.
e. Dejar a temperatura de laboratorio durante 15 a 20 minutos y luego con cuidado
colocar en heladera a 4 º C como mínimo 40 minutos (las placas en estas
condiciones no duran más de siete días).
f. Luego preceder a perforar la primera capa con un sacabocado. Una vez
perforado retirar los trozos de agar con una bomba de vacío o con un alambre.
SIEMBRA: primero debemos sembrar los sueros problema a investigar, luego los
sueros testigos o controles y por último el antígeno con la siguiente distribución.
La metodología de siembra es la siguiente: con una pipeta automática o de Pasteur
limpia y seca, se procede a cargar el primer suero problema, que con mucho cuidado se
deposita en el pozo correspondiente hasta llenarlo completamente, tener mucho cuidado
en no desbordar el pozo. Con otra pipeta se llena otro pozo con otro suero problema.
21
Posteriormente se siembra con otra pipeta el suero testigo en los pozos
correspondientes, y por último con otra pipeta, el antígeno.
INCUBACIÓN: con cuidado se coloca la caja de Petri sin la tapa (para poder manejarla
mejor) en la cámara húmeda, luego se coloca la tapa correspondiente en la placa y se
cierra la cámara.
Interpretación:
A las 48 hs. se procede a la lectura sobre fondo negro y con incidencia lateral de luz.
NEGATIVO: la prueba es negativa cuando no se forma una línea entre el suero
problema y el antígeno.
POSITIVO: la prueba es positiva cuando se forma una línea continua entre el suero
problema y el antígeno.
DËBILMENTE POSITIVO: la línea control se curva ligeramente hacia el círculo que
contiene el antígeno pero no continúa formando una línea completa entre el suero
problema y el antígeno. Se recomienda que éstas reacciones sean repetidas antes de
informar el resultado.
FUERTEMENTE POSITIVO: la línea control se inclina hacia el antígeno antes de que
alcance el círculo que tiene el suero problema y se continúa con una ancha línea entre el
suero problema y el antígeno.
LINEAS INESPECIFICAS: cuando se forman líneas que cruzan la línea control dentro
del círculo que contiene el suero problema.
A. NEGATIVO
D. NEGATIVO
G. POSITIVO
B. POSITIVO
E. FUERTE POSITIVO
H. INESP.
C. DEBIL POSITIVO
F. POSITIVO
I.
22
INESP.
REACCIÓN A LA TUBERCULINA
Fundamento:
Cuando se inyecta en la piel de animales sensibilizados determinados antígenos,
puede presentarse en el foco de inyección una respuesta inflamatoria que tarda varias
horas en instalarse, esa reacción es de hipersensibilidad tardía, no es transferible de
un animal sensibilizado a uno normal con el suero, pero sí con el transporte de
linfocitos y es por esto, que no hay duda que se debe a células.
La reacción de hipersensibilidad tardía es una HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO
IV y se debe a la interacción entre el antígeno inyectado y los linfocitos T
sensibilizados.
Un ejemplo destacado de hipersensibilidad tardía es la reacción de la tuberculina,
respuesta que aparece en un animal tuberculoso en caso de inyección intradérmica de
tuberculina (Derivado Proteico Purificado a partir de cultivos de Mycobacterium
tuberculoso mamífero o aviar en la concentración de 1 mg./ml)
Además de ésta prueba existen otras pruebas cutáneas diagnósticas basadas en la
hipersensibilidad tardía como: la melitina, para el diagnóstico de B. melitensis; la
histoplasmina para el diagnóstico de Histoplasmosis y la coccidieimina para el
diagnóstico de Cocciodiomicosis.
La Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca de la República Argentina en
total acuerdo con el Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria
-SENASA- ha dictado la Resolución Nº 1.287/93 en la que se establecen las normas
y procedimientos del PLAN NACIONAL DE CONTROL Y ERRADICACIÓN DE
LA TUBERCULOSIS BOVINA.
Procedimiento para la tuberculinización en rodeosProcedimiento para el
saneamiento de la Tuberculosis (TBC) en los rodeos – In
Introducción
La tuberculosis es una enfermedad crónica en la que debe considerarse al rodeo
como una unidad epidemiológica. No pueden tenerse en cuenta animales enfermos y
sanos, sino referirse a la situación sanitaria de la población como un todo.
Las pruebas tuberculínicas negativas no son garantía sanitaria suficiente, si se
desconoce el estado sanitario del rodeo del cual proviene el o los animales, excepto
cuando los mismos provienen de un rodeo certificado libre, se puede garantizar dicha
condición. Por lo tanto es un instrumento valioso en el control y erradicación de la
TBC bovina y con ese criterio deben manejarse.
Las pruebas tuberculínicas y su interpretación:
La prueba tuberculínica es el procedimiento básico para reconocer los animales
infectados en el rodeo, siendo la vía de aplicación INTRADÉRMICA la única
aceptada .
Dos serán las pruebas tuberculínicas de uso corriente:


Prueba ano-caudal de rutina.
Prueba cervical simple de saneamiento.
23
Las tuberculinas:
Las tuberculinas que se podrán usar para animales son derivado protéico
purificado de tuberculina bovina (PPD), elaborada con Mycobacterium bovis y la PPD
aviar elaborada con una cepa de M. avium. La tuberculina aviar contiene un colorante,
el rojo Punceau; la bovina actualmente es incolora, hasta hace algunos años se usaba el
azul de Evans como colorante para distinguirla.
Las únicas tuberculinas PPD utilizadas en el país son las elaboradas por SENASA
y las producidas por laboratorios particulares que fueron controladas y aprobadas por
ese organismo.
Las tuberculinas PPD deben ser transportadas y conservadas en frío (2 – 8 ºC) y
protegidas de la luz solar directa. Una vez utilizado parte de reactivo debe descartarse el
resto si no se va a usar el mismo día.
Procedimiento para la aplicación de las tuberculinas:
1.
Instrumental: jeringas, agujas, calibradores.
Las jeringas serán de pequeño volumen (1 a 2 ml), graduadas en 0,1 ml. Las agujas
serán hipodérmicas, reutilizables conforme a las normas IRAM 9.031/78, calibre 6,
longitud de cánula 5 mm, punta tipo b (bisel corto). Podrán utilizarse agujas
descartables de similares características o de mayor longitud de cánula.
Para las pruebas tuberculínicas de animales difíciles de inmovilizar, como el caso de las
razas cebuinas, podrán usarse agujas más cortas.
Los calibradores podrán ser metálicos, plásticos o digitales graduados en mm.
2.
Técnica de aplicación de la tuberculina:
a)
b)
c)
Un ayudante debe inmovilizar al animal con una mocheta o con otro medios.
Se debe usar solo jeringas y agujas sanas.
En las inoculaciones para la prueba cervical se corta el pelo en la región a inyectar
y se mide el pliegue con un calibrador.
d) Si la piel de la tabla del cuello o ano-caudal está sucia, se debe limpiar el lugar de
inyección evitando el uso de desinfectantes o productos químicos que irriten la
piel.
e)
Una vez inmovilizado el animal y limpiado el lugar de la inyección, se procede a
inyectar la aguja en toda su longitud en las capas superficiales de la piel. Se debe tener
cuidado de no traspasar la piel con la punta de la aguja, retirar apenas la aguja e inyectar
0,1 ml de tuberculina. Se retira la aguja cuidadosamente si es posible, apretando entre el
pulgar y el índice la región inyectada para prevenir la pérdida de alguna parte, en el
lugar inoculado debe aparecer una pápula.
f)
No utilizar sobrantes de tuberculina de un día para el otro.
24
Técnica de lectura de las pruebas:
Leer después de las 72 hs. de haber inoculado, en casos de no ser posible se podrá
hacer la lectura con un margen de más o menos de 6 hs.
Inmovilizar al animal y verificar su identidad, ya sea por el número de tatuaje, a
fuego u otra identificación indeleble.
Medir el pliegue inoculado con el calibrador y anotar el engrosamiento (comparando
con la medida previa del pliegue y la actual y sacando por diferencia el aumento de
grosor). Toda reacción observada en las pruebas tuberculínicas debe ser anotada en un
protocolo. El registro de las pruebas es importante para las pruebas ulteriores del mismo
rodeo y para la evaluación del plan de erradicación en el área.
Seguir las pautas de interpretación de cada una de las pruebas para clasificar a los
animales
Prueba tuberculínica de rutina:
La prueba tuberculínica básica operativa o de rutina será aplicada en el tercio medio
del pliegue ano-caudal, a unos 6 cm de la base de la cola y en el centro del pliegue.
Interpretación:
El veterinario que realiza la prueba tuberculínica de rutina en un rodeo, tiene que
actuar con criterio epidemiológico, tomando en cuenta la totalidad del rodeo y no
interpretar los resultados en base a los animales considerados aisladamente.
En la primera prueba, cuando se desconoce si el rebaño está infectado o no, se
aplicará el siguiente criterio general:
POSITIVO: un engrosamiento de la piel de 5 mm o más.
SOSPECHOSO: un engrosamiento de 3 mm. o más y menos de 5 mm.
NEGATIVO: menos de 3 mm.
Prueba cervical simple:
La sensibilidad de la prueba cervical es superior a la del pliegue ano-caudal, ella se
aplica con el fin de obtener una mayor seguridad en la eliminación de bovinos
infectados en rodeos en los que se ha comprobado infección. Para la prueba el
establecimiento necesita contar con instalaciones adecuadas que aseguren una correcta
sujeción de los animales.
El lugar de inoculación es el tercio medio del cuello. Se corta el pelo a máquina o
tijera en el lugar de la inyección, una área de unos 5 a 6 cm2, se mide con el calibre el
grosor de la piel y se registra en el protocolo. Previa limpieza se aplica la inyección con
la jeringa de tuberculina.
Se inocula intradérmicamente 0,1 ml de PPD bovina (1 mg/ml) y se hace la lectura a
las 72 hs. de la inyección, midiendo con un calibrador el espesor de la piel.
Interpretación de la prueba cervical simple:
POSITIVO: un engrosamiento de la piel de 3 mm o más.
NEGATIVO: un engrosamiento menor de 3 mm.
25
DIAGNOSTICO TUBERCULINICO EN OTRAS ESPECIES
Prueba tuberculínica en porcinos:
Los animales que se someten a la prueba deben identificante en forma indeleble.
Los cerdos son susceptibles a tuberulosis por M. bovis, M. avium y M. tuberculosis,
por lo que en la prueba deben usarse las dos tuberculinas (PPD bovis y PPD avium).
Se inyecta 0,1 ml de tuberculina bovina y 0,1 ml de tuberculina aviar, con dos
jeringas reservadas específicamente para cada una de ellas (la tuberculina bovina se
inyecta del lado derecho, y la aviar del lado izquierdo).
El lugar de inyección intradérmino es la piel de la base de la oreja. Si esta región
estuviera traumatizada o tuviera otro defecto se puede hacer la prueba en los labios de la
vulva en la cerda o en conjunción de piel de mucosa del ano en el macho.
La lectura se hace a las 48 hs. y toda reacción tisular comprobada por palpación se
clasifica como reaccionante, debiéndose anotar si la misma se debe a la bovina o la
aviar.
Prueba tuberculínica en aves:
Si hay sospecha de tuberculosis y se comprueban lesiones tuberculosas por
necropsia, la prueba tuberculínica no es necesaria, ya que todas las aves del criadero
deben ser sacrificadas y la repoblación debe ser hecha con aves procedentes de un
criadero libre de la infección. Las aves nuevas deben ser puestas sobre un terreno no
contaminado.
Sin embargo la prueba tuberculínica puede ser útil en el comercio de aves y en las
que concurren a exposiciones. Las aves con susceptibles solo a Mycobacterium avium
por lo que en la prueba se usa exclusivamente la PPD aviar.
El reactivo se inyecta vía intradérmica en una de las barbillas a razón de 0,05 ml
La lectura se hace a las 48 hs. de aplicada la inyección y toda edematización de la
barbilla inoculada se interpreta como POSITIVA.
La prueba de tuberculina en equinos:
Esta prueba no debe ser aplicada en los equinos. Esta especie animal es hipersensible
a la tuberculina y da resultados equívocos.
La prueba de tuberculina en perros y gatos:
La misma no da resultados fidedignos en éstas especies, por ello no se aconseja su
empleo. Si hubiera la sospecha clínica de infección tuberculosa en individuos de esa
especie, los animales deben ser sacrificados; si se comprobaran lesiones tuberculosas, se
deberá recomendar que los dueños sean sometidos a exámenes médicos.
26
La prueba de tuberculina en caprinos y ovinos:
La tuberculosis en ovinos es muy rara, por lo que la prueba tuberculínica no es
practicada.
Los caprinos son susceptibles a la tuberculosis y se le puede aplicar
satisfactoriamente en el pliegue de la cola o en la tabla del cuello.
La técnica de aplicación e interpretación es similar a la de los bovinos.
27
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
SANIDAD ANIMAL
Resolución 438/2006
Adóptase el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y
Erradicación de la Brucelosis. Técnicas que lo conforman.
Bs. As., 2/8/2006
EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD
AGROALIMENTARIA
RESUELVE:
Artículo 1º — Adóptase el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de
Control y Erradicación de la Brucelosis en la REPUBLICA ARGENTINA, conformado
por las siguientes técnicas de diagnóstico: BPA (Buffered Plate Antigen) e I-ELISA
(ELISA indirecto) como Pruebas Tamiz, y como Pruebas confirmatorias, SAT
(Seroaglutinación en Tubo) y 2-ME (2-Mercaptoetanol), FPA (Polarización
Fluorescente), C-ELISA (ELISA Competición) y Fijación del Complemento; para la
Vigilancia Epidemiológica en leche, las Pruebas PAL (Prueba de Anillo en Leche e IELISA (ELISA Indirecto).
Art. 2º — Las Pruebas serológicas mencionadas en el artículo 1º de la presente
resolución, se refieren sólo a aquellas técnicas validadas y cuyos componentes fueron
presentados, controlados y aprobados por la Dirección de Laboratorios y Control
Técnico de este Servicio Nacional.
Art. 3º — Las Pruebas citadas precedentemente deberán ejecutarse e interpretarse
conforme al Manual de Procedimientos Técnicos de Diagnóstico de Brucelosis de la
Dirección de Laboratorios y Control Técnico.
Art. 4º — Ante resultados divergentes o contradictorios entre distintas pruebas, la de
Fijación del Complemento obrará como prueba de referencia, estableciendo el
diagnóstico serológico definitivo.
Art. 5º — Los resultados del diagnóstico serológico conforme a lo establecido en el
Manual de Procedimientos Técnicos de Diagnóstico de Brucelosis de la Dirección de
Laboratorios y Control Técnico, son un insumo para el diagnóstico de la enfermedad en
los animales, rodeos y/o establecimientos, los cuales deberán interpretarse con criterio
epidemiológico por los Veterinarios Acreditados y de los Servicios Sanitarios Oficiales,
para definir las discordancias que puedan presentarse entre el diagnóstico serológico y
la situación epidemiológica.
Art. 6º — Ante casos de discordancia entre la condición epidemiológica y los
resultados serológicos, el Veterinario Acreditado podrá solicitar ante la Oficina Local de
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la jurisdicción correspondiente, la revisión del caso por el epidemiólogo asignado al
área o al Programa de Brucelosis del SENASA.
Art. 7º — Para que los diagnósticos puedan ser certificados oficialmente, los reactivos,
materiales, métodos, personal e instalaciones que se utilicen en la ejecución e
información de los mismos, deberán ajustarse a las condiciones establecidas por la
Dirección de Laboratorios y Control Técnico del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTAR1A.
Art. 8º — La Dirección Nacional de Sanidad Animal del mencionado Servicio Nacional
podrá revisar y modificar el Sistema de Diagnóstico aplicado al Programa de Control y
Erradicación, conforme a la evaluación que surja de su aplicación en la lucha sanitaria y
a la evolución de la campaña, manteniendo las condiciones prescriptas en el Artículo 3º
de la presente resolución.
Art. 9º — Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial
y archívese. — Jorge N. Amaya.
29