TEMA3 TECNICAS HISTOLOGICAS

TEMA3 TECNICAS HISTOLOGICAS
Se denomina técnica histológica al conjunto de operaciones a que se somete
una materia organizada, a fin de que sea posible su estudio por medio del
microscopio, posibilitando la observación de estructuras no visibles al ojo
humano.
PASOS GENERALES DE LAS TECNICAS HISTOLOGICAS
1. Obtención del material histológico para estudiar: Los tejidos se pueden
obtener de diferentes formas:

Biopsia

Abiopsia

Necropsia (llamada vulgarmente autopsia)
2. Proceso de fijación: En este paso el tejido obtenido se coloca en una
sustancia fijadora para evitar los cambios post-mortem Unos de los
fijadores mas usado es el Formol al 10% (Formaldehido). En el caso de
que utilicemos más adelante el microscopio electrónico, usaremos
glutaraldehido (proteínas) u osmio (lípidos).
3. Lavados: Se debe lavar el tejido para quitar exceso de fijador
4. Deshidratación: Suena incoherente que se deba lavar el tejido y después
deshidratarlo, entonces ¿para que lavarlo? El exceso de fijador al
momento de la infiltración, incluso en la microtomia, podría afectar los
cortes, por eso se debe lavar. La deshidratación se hace con el uso de
alcohol de una menor concentración a una mayor.
5. Aclaramiento: En este paso el se sustituye el alcohol por un disolvente
de parafina lo mas usado es el Xilol (Xileno) ya que como esta
deshidratado el xilol entrara hasta la mas profundo del tejido. También el
tejido pierde color hasta un tono acaramelado
6. Infiltración: En este paso la muestra se coloca en parafina liquida, cabe
mencionar que se debe usar parafina histológica, como se ha dicho en el
paso anterior el tejido esta completamente lleno de xilol, ahora debido a
osmosis sale el xilol y entra la parafina. La Deshidratación, Aclaramiento
e Infiltración se pueden realizar manualmente pero hoy en día existe una
maquina que lo puede realizar.
7. Inclusión: Aquí se forman bloques de parafina y dentro de estos bloques
están las muestras a estudiar. hay maquinas especializadas para la
inclusión en parafina de tejidos Después que se incluyeron los bloques y
por consecuente se dejaron secar, estos se deben poner a enfriar en un
congelador para su posterior corte
8. Microtomía: Se realizan cortes muy delgados que van de acuerdo a lo
requerido o costumbre del laboratorio donde se realice la técnica, los
cortes van desde .5 micras hasta 8 u 10 micras. Los cortes se echan al
baño de flotación y se ´pescan´ con un portaobjetos, se marca con la
fecha, el tejido que es y con que tinción se va a procesar. El ángulo de
corte entre el cuchillo y el bloque ha de ser entre 10º y 15º. Una vez
realizado el corte se da un baño de agua destilada, para que la parafina
se estire. Un buen corte histológico debe tener un grosor en torno a 3-5
micras.
9. Tinción: Hay muchos tipos de tinciones para diferenciar en los tejidos
diferentes estructuras o sustancias; La tinción mas usada o también
llamada "De Rutina" es la de Hematoxilina y Eosina (HyE) esta usa un
colorante llamado Hematoxilina en su composición según Harris que tiñe
las sustancias ácidas o que las contengan, como el núcleo que contiene
el Ácido Desoxirribonúcleico (ADN) La Eosina Amarillenta tiñe las
estructuras básicas como el citoplasma y demás organelos
FIJADORES
Son sustancias que se utilizan para preservar la estructura del tejido semejante
a la que tenían en vida; ya que los fijadores detienen la autolisis celular. La
fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas
Condiciones que debe tener un fijador:






Alto poder de penetración, para fijar las capas mas profundas
Actuar con rapidez, matando y fijando las células
No provocar estructuras artificiales
No retraer el tejido, ni volverlos quebradizos
No debe dificultar la coloración y ejecución de cortes.
Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban
vivos.
TIPOS DE FIJADORES
FIJADORES QUIMICOS SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los
casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente
cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos
topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en
microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados
(sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).
d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva
muy bien estructuras celulares.
FIJADORES QUIMICOS COMPUESTOS:
a)
b)
c)
d)
Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
FIJADORES FÍSICOS:
a) Desecación: Se lo utiliza en extendidos de sangre, líquidos de punción.
Si se efectúa rápidamente detiene los procesos de post – mortem y
permite el empleo posterior de fijadores químicos o calor seco para
completar la fijación.
b) Calor seco: Es utilizado a menudo en bacteriología sobre extendidos
desecados, poco empleado en histología.
c) Calor húmedo: En forma de agua hirviente es utilizado en algunas
investigaciones microquímicas o para fijar invertebrados.
d) Frío: No es un verdadero fijador, pero detiene los procesos vitales y los
cadavéricos de necrosis y autolisis, pero en cuanto deja de actuar, se
reanudan las actividades vitales si la célula no ha muerto, o se
desarrollan los procesos de post – mortem.
e) Congelación – desecación
REGLAS DE LA FIJACIÓN:
 El material debe ser cortado en trozos pequeños y no demasiado
grueso, para facilitar la penetración del fijador.
 La relación del volumen entre el objeto a fijar y el fijador, varía según el
fijador empleado, pero como mínimo la relación debe ser de 1 a 20.
 El líquido fijador se debe verter primero en el frasco y luego se
introducen los trozos de tejido; en caso contrario quedan éstos pegados
en el fondo y no se fijan por ese lado. Si son tejidos que tienden a ir al
fondo (hígado, músculo, glándulas), se debe agitar el frasco durante
unos minutos. Los tejidos que flotan (pulmón, grasas), se recubren con
un trozo de algodón o papel de filtro para que se pongan totalmente en
contacto con el fijador.
 La duración del tiempo de fijación varía según el fijador utilizado, el
tamaño y la textura del tejido. El general y como promedio, 24 horas es
suficiente, pero puede quedar en el líquido fijador, sobre todo con el
formol taponado durante varios años.
 la osmoralidad es un factor importante y debe en lo posible tener una
concentración iónica en el fijador similar al tejido que se va a fijar. Las
variaciones de la osmoralidad se logran por la adición de cloruro de
sodio, sacarosa o dextrán.
COLORACION
Colorantes: Son todas aquellas sustancias que pueden comunicar su color a
otros cuerpos, sea el mismo color que ellas tienen (colorantes ortocromáticos),
o bien teñir de un color distinto (colorantes metacromáticos, ejemplo: Azul de
Toluidina, tiñe de rojo determinados grupos químicos de las células y azul todo
lo demás).
Coloración es el proceso por el cual un cuerpo toma color bajo la acción de un
colorante y no desaparece con lavados de la misma sustancia en que se
disolvió el colorante. Las estructuras contenidas en las preparaciones
histológicas, poseen poco contraste o carecen de él completamente, por lo que
no van a poder ser distinguidas al microscopio. Este inconveniente queda
salvado por la propiedad que tienen los distintos componentes celulares y
tisulares de incorporar con variable intensidad sustancias colorantes. La
coloración puede ser:
 Sustancias basófilas: Son los componentes de las estructuras
tiñen con colorantes básicos.
 Sustancias acidófilas: Son los componentes de las estructuras
tiñen con colorantes ácidos.
 Sustancias neutrófilas: Son los componentes de las estructuras
tiñen con colorantes neutros.
 Sustancias azurófilas: Son los componentes de las estructuras
tiñen con azul de metileno.
 Sustancias osmiófilas: Son los componentes de las estructuras
tiñen con tetróxido de osmio.
 Sustancias argirófilas: Son los componentes de las estructuras
tiñen con sales de plata.
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CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SU ORIGEN
Colorantes naturales:

Animales ( carmín )

Vegetales ( hematoxilina, orceína, azafrán )
Colorantes artificiales o sintéticos

Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado
(eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos.

Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro
(azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes
nucleares

Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son
coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.

Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que
tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para
preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).
La coloración puede ser:
 Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución
colorante empleada.
 Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un
color diferente al del colorante empleado.
COLORANTES MAS UTILIZADOS EN HISTOLOGIA
Hematoxilina
 Colorante vegetal, básico
 Tiene afinidad por los componentes ácidos de la célula, los tiñe de color
azul violáceo
 Tiñe los componentes nucleares.
 Se denomina basòfilos
Eosina
 Colorante artificial, acido
 Tiene afinidad por los componentes básicos de la célula, los tiñe de color
rosado
 Tiñe citoplasma y organelos
 Se denomina acidòfilos.
La Hematoxilina: es un colorante nuclear, está cargado positivamente y es por
lo tanto un colorante básico. Se deposita en los grupos fosfatos del ADN y ARN
que tienen carga negativa. Es el colorante nuclear más utilizado. Se lo obtiene
a partir de la extracción del palo de campeche (hematoxilon campechianum).
La sustancia es incolora y ha de ser transformada primero por oxidación en
hemateína que es el auténtico colorante. La hemateína es un colorante
indirecto, por lo que requiere el uso de un mordiente, que en la práctica el más
usado es el Hemalumbre de Mayer, que forma parte de la coloración
hematoxilina – eosina, y que está compuesto por hemateína, alumbre de
potasio y ácido cítrico. Colorea al núcleo de color violeta. Es una coloración
progresiva. La Eosina: es un colorante artificial, débilmente ácido que
pertenece al grupo de las fluoresceínas. Es fácilmente soluble en agua.
Colorea al citoplasma, tejido conjuntivo, fibras colágenas de rosado intenso.
Químicamente es un eosinato de potasio, siendo el ácido eosínico el que actúa
en la coloración. Es una coloración regresiva y directa.
ALGUNOS METODOS UTILIZADOS EN LAS TECNICAS HISTOLOGICAS
1. METODOS EN VIVO O INMEDIATO
a) Cultivo de tejidos: es un importante método para el estudio de
poblaciones celulares vivas fuera del organismo, el método se le
denomina a menudo “in vitro”. Las condiciones para llevar a cabo este
método son las siguientes:
 Se realiza el corte del tejido que se quiera estudiar
 Se coloca en un recipiente estéril, se le agrega una solución que
tenga una composición similar a los líquidos tisulares.
 Se le añaden ciertas enzimas proteolíticas como la tripsina y
colagenasa, cuya función es romper los enlaces intercelulares,
permitiendo así obtener células individuales.
 Luego se añaden estas células a un medio de cultivo nutritivo,
como plasma o sangre, el cual va a permitir el crecimiento de
estas células.
 Debe añadirse soluciones de antibióticos con la finalidad de inhibir
el crecimiento bacteriano.
 El cultivo debe mantenerse a una temperatura de 37ºC para
simular la temperatura corporal.
De esta manera se lleva a cabo el cultivo de células vivas, donde se obtendrán
clones de células para cualquier estudio histológico; estas células para
conservarlas mas tiempo se pueden congelar, sin embargo existen ocasiones
donde se le debe añadir nitrógeno liquido a -196ºC para preservarlas por
meses o años y al descongelarlas estarán en condiciones para seguir su
crecimiento.
b) Coloración vital: Consiste en el empleo de soluciones muy diluidas de
sustancias colorantes no tóxicas, para estudiar a una muestra de células
o tejidos. Los colorantes utilizados son el Verde Jano, Azul tripán, Rojo
congo, Rojo neutro, Azul pirrol, etc. Se clasifica en :
 Coloración intravital: Se basa en la introducción de colorantes no
tóxicos en el organismo vivo por vías digestiva, subcutánea, al
torrente sanguíneo o linfático; por ejemplo: la alizarina se utiliza
para estudiar el crecimiento óseo, ya que este se fija a la matriz
ósea. En algunas ocasiones lo utilizan para estudios con
animales luego de aplicar la técnica matan al animal y se sigue
los pasos de la Técnica Histológica corriente. En la observación
microscópica se verán determinadas estructuras que contienen el
colorante.
 Coloración supravital: Se realiza sobre células libres, extraídas del
organismo, como el caso de células sanguíneas, células de
raspado de la mucosa bucal o vaginal, cortes finos de tejido
cartilaginoso que conserva su vitalidad. Hay que proceder a la
observación rápida antes de que comiencen los procesos de post
– morten.
2. METODOS MEDIATO O POST MORTEN
Los tejidos muertos se preparan de acuerdo al microscopio que se vaya a
utilizar.
PARA EL MICROSCOPIO OPTICO SE INCLUYEN LOS SIGUIENTES
PASOS:
 Fijación: se refiere al tratamiento con fijadores.
 Deshidratación y aclaramiento: debido a que gran parte del tejido esta
constituido por agua, se somete el tejido a una serie gradual de baños
de alcohol, iniciando con alcohol al 50% y alcanzando de manera
progresiva al 100% para eliminar el agua (deshidratación), luego este
tejido deshidratado se trata con xileno, una sustancia química que es
miscible con parafina fundida, el xileno torna al tejido transparente.
 Inclusión: con el objetivo de distinguir entre si las células que conforman
un tejido, se debe incluir el tejido en un medio apropiado que le de
firmeza al tejido para luego realizar los cortes, el medio habitual es la
parafina. Se coloca el tejido en un recipiente adecuado con parafina
fundida hasta que se infiltra por completo y se deja endurecer para
formar bloques de parafina.
 Corte: una vez que este listo el bloque de tejido debe cortarse, parta ello
vamos a utilizar un equipo llamado Micrótomo; se realizan cortes
delgados que permitan el paso de la luz, generalmente el espesor de los
cortes es de 5 a 10 µm
 Montaje: los cortes de parafina se montan en portaobjetos de vidrio y se
colorean con colorantes hidrosolubles que permiten diferenciar los
diversos componentes celulares.
 Tinción: el mas utilizado es la combinación de Hematoxilina-Eosina, que
tiñen los componentes nucleares de azul violáceo, mientras que casi
todas las estructuras citoplasmáticas adquieren una tonalidad rosada.
PARA EL MICROSCOPIO ELECTRONICO SE INCLUYEN LOS SIGUIENTES
PASOS:
 Fijación: se utiliza Glutaraldehido o teròxido de osmio
 Deshidratación: de igual manera que para el óptico
 Inclusión: para la inclusión se suelen utilizar resinas epoxi y distintos
materiales plásticos, que adquieran una gran dureza después del
secado y permiten la sección de cortes mas finos entre 0,02 a 0,1 µm,
para ello se utiliza el ultra micrótomo.
 Montaje: los cortes ultrafinos se montan en una rejilla pequeña de cobre,
denominado “grilla”. El haz de electrones atraviesa el corte por los
orificios de la grilla.
 Tinción o Coloración: generalmente se utiliza toluidina que es un
colorante básico, por su capacidad de penetrar los medios de inclusión
de resinas epoxi.
TÉCNICA DE CONGELACIN PARA M/E:
Mediante esta técnica es posible estudiar al M/E estructuras celulares
superficiales o puestas al descubierto por medio de la fractura de una muestra
congelada a muy bajas temperaturas, sin ningún tipo de procesamiento
químico que altere la ultraestructura de la misma.
La muestra se congela en nitrógeno líquidos (-196 °C). Mediante una cuchilla
se produce un corte que provoca una línea de fractura en la muestra, quedando
expuesta la superficie donde se produjo el corte. Esta superficie pierde agua
por sublimación y posteriormente se le evaporan carbón y metales pesados
desde diferentes ángulos, hasta cubrirla en su totalidad, logrando de esta
manera, una réplica o mascarilla de la misma. Por un procedimiento donde se
elimina el material biológico, la replica se separa de la muestra y se examina al
M/E, en ella se pueden apreciar las características de las estructuras que
quedaron impresas en la réplica
TÉCNICA DE FRACCIONAMIENTO CELULAR:
Cuando se requieren separar los componentes intracelulares (organitos), la
técnica de elección es la centrifugación o la ultracentrifugación en un medio
isotónico. Para esto es necesario romper previamente las células mediante
procedimientos mecánicos (en un homogeneizador con émbolo de vidrio o
teflón), con la consiguiente liberación al medio de sus componentes.
En la centrífuga las partículas de distinta densidad, forma y tamaño,
sedimentan a diferentes velocidades y tiempo. De este modo se obtienen
distintas porciones o fracciones celulares. Aunque con esta técnica se
obtienen fracciones celulares bastante puras, no es posible evitar la
contaminación de una determinada fracción con partes de otra.
Como se planteó anteriormente, el comportamiento de las diferentes partes de
la célula en el campo centrifugacional, está determinado por varios parámetros
que pueden coincidir en organitos diferentes; por ejemplo, una mitocondria
pequeña puede tener similar forma, talla y densidad que un lisosoma y, por
tanto, se obtiene una fracción mitocondrial contaminada por lisosomas. Este
hecho es necesario tenerlo en cuenta cuando se está estudiando el contenido
enzimático de determinada fracción, ya que se pueden falsear los resultados.