Determinación de Inhibidores

 Introducción
 Clasificación de inhibidores
 Importancia en la salud pública
 Método de detección de inhibidores
 Descripción de los métodos microbiológicos (Galesloot y
Delvotest P y P-multi)
¿Qué son?
Son moléculas que bloquean o producen un enlentecimiento en el
crecimiento bacteriano. Sustancias que en la leche tienen efecto
bacteriostático o bactericida.
 Reglamento Bromatólogico Nacional (Dec. 315/994)
 Deseables o no?
Genera problemas a diferentes sectores de la sociedad:
 PRODUCTOR: Pago por calidad
 INDUSTRIA: Calidad de la materia prima y efectos en los
productos a elaborar (productos fermentados)
 CONSUMIDOR: Salud pública
TIPOS DE INHIBIDORES:
1. Naturales
2. Químicos
3. Bacteriófagos
4. Antibióticos
Artificiales: sustancias bacteriostáticas o
bactericidas (inhibidoras del crecimiento
bacteriano), cuya presencia en leche no es
ni natural ni deseada
INHBIDORES NATURALES
 Sustancias antibacterianas presentes en leche cruda
 Clasificación:
• Inhibición específica:
• Inmunoglobulinas
• Aglutininas
• Inhibición inespecífica:
• Lactoperoxidasa
• Lizozima
• Lactoferrina
INHIBIDORES QUÍMICOS
 Presentes en leche debido a prácticas defectuosas (lavado
maquina de ordeñe, concentraciones no adecuadas, etc)
 Detergentes e Higienizantes
 Desinfectantes (clorados, yodados)
BACTERIÓFAGOS
 Son virus de las bacterias
 Provocan lisis bacteriana
 Están ligados a la falta de higiene y mal manejo de las
tecnologías
ANTIBIÓTICOS
 Se utilizan para combatir enfermedades causadas por
microorganismos, por ej: mastitis

Clasificación:
• Familia Química (ß-lactámicos,
Tetracilcinas, Aminoglucósidos)
• Efecto- bacteriostático y bactericida
• Espectro de actividad
Macrólidos,
Problemas que plantean los residuos de antibióticos en leche
Importancia desde el punto de vista tecnológico:
La penicilina pierde solamente un 8% de su actividad luego de
la pasteurización. Un tratamiento térmico más exigente (90°C
por 30 minutos), destruye el 20% de la actividad de la
penicilina y la esterilización un 50%.
ANTIBIÓTICOS
 La cantidad de antibiótico que llega a la glándula mamaria
depende de:
• Principio activo y vehículo (oleosos o acuoso)
• Dosis y vía de administración (determina el % de
antibiótico que se elimina por leche)
• Tiempo transcurrido entre el fin del tratamiento y
el ordeño (tiempo de espera)
 1962, Food and Drug Administration (FDA) de EEUU
 Fines de la década del 60, la Organización Mundial de la
Salud (OMS) y otros organismos internacionales (FAO)
establecen normas
 Antibacterianos “residuos”, “concentraciones residuales” o
“inhibidores”
Para cada sustancia se fija un límite máximo de residuo (LMR) o
“niveles de seguridad” o “tolerancia” para la protección hacia el
consumidor.
 Salud pública
• Alergias
• Resistencia
 Industria láctea: • Interferencia con los cultivos iniciadores en la
elaboración de queso y yogur
 Ganadero (sanciones)
 Salud pública
• Alergias
• Resistencia
 Industria láctea: • Interferencia con los cultivos iniciadores en la
elaboración de queso y yogur
 Ganadero (sanciones)
Efectos en procesos industriales (queso y productos fermentados):
 Demora en la acidificación
 Demora en la coagulación
 Coagulación deficiente
 Disminución en la retención de agua
Efectos en procesos industriales (queso y productos fermentados):
 Desarrollo de microorganismos indeseables
 Alteración de las características normales del producto
 Interferencia en la formación de aroma en manteca
fermentada
 Microbiológicos
• Prueba de fermentación (coagulación)
• GALESLOOT (Disco de filtro)
• DELVOTEST (P y P multi)
 Enzimáticos
• Penzime III
• SNAP
 Ensayos de sustitución y competencia
(receptores)
• CHARM I y II (14C y tritio, H3)
• Parallux (sust. fluorescentes)
 Métodos
microbiológicos
• Prueba de la coagulación
• GALESLOOT (Disco de filtro)
• DELVOTEST (P y P multi)
Principio
Verificar la capacidad de fermentación de un cultivo de
Streptococcus termophilus (yogur) en la leche a controlar.
Si un inóculo del cultivo falla en producir la acidificación y
coagulación, la prueba se considera positiva.
• Prueba sencilla
• Dificultades para su estandarización
• No está considerada en las ordenanzas internacionales
Principio:
Sustancias inhibidoras (leche) difunden por el medio impidiendo
el desarrollo de una cepa bacteriana, verificándose una zona clara
alrededor del disco (halo) (Federación Internacional de lechería, FIL, 1991)
Metodología:
 Sembrar 1ml de un cultivo del m.o Bacillus stearotermophilus
var. calidolactis
 Agregar el medio de cultivo TSA, (previamente fundido y
enfriado)
 Identificar
 Tomar los discos con pinza estéril (discos y pinza),
impregnarlos con la leche problema homogeneizada
 Depositarlos sobre el medio (solidificado), leve presión
 Invertir la caja e incubar a 55º durante 2 ½hs.
Metodología:
Control negativo:
Colocar disco con leche normal (sin antibiótico)
Control positivo:
Colocar disco leche con antibiótico (penicilina 0.005 UI)
1.
2.
3.
4.
Lectura:
Positivo:
Zona sin crecimiento microbiano alrededor del disco
(verificar con el disco control)
Las muestras que presenten halos de inhibición de igual diámetro
o mayor que el del disco control se consideran positivas
Negativo:
Crecimiento homogéneo alrededor del disco
Principio:
 Se agrega la leche (con sust. nutritivas) a un gel de agar que contiene
Bacillus Stearotermophilus var. calidolactis
 Incubación
 Observa el cambio de coloración del medio
Metodología:
 Cortar las ampollas a utilizar
 Identificar
 Perforar el papel de aluminio con el extremo romo de la jeringa
 Agregar 0,1mL de la muestra con la jeringa con puntero estéril
 Llevar a baño de agua (64ºC durante 3hs).
 Realizar la lectura
Metodología:
Control negativo:
Leche en polvo descremada reconstituida, esterilizada en autoclave
Control positivo:
Preparar un control con penicilina concentración 0.006UI/ml
Lectura:
Negativo:
Amarillo (ausencia de sust inhibidoras), hubo acidificación del
medio por crecimiento microbiano
Positivo:
Púrpura, presencia de sust. inhibidoras (no
hubo crecimiento microbiano)
Dos presentaciones
Ampollas
Placas
ANTIBIÓTICO
Concentración mínima
detectable, (Color púrpura)
Penicilina
0.004 (UI/ml)
Cloxacilina
0.025 (mcg/ml)
Ampicilina
0.003 (mcg/ml)
Tetraciclina
0.20 (mcg/ml)
Oxitetraciclina
0.30 (mcg/ml)
 Métodos Enzimáticos
• Penzyme III
• SNAP
Principio
 Método enzimático y colorimétrico
 Precisa poca infraestructura
 Rápido (20 minutos)
 Detecta exclusivamente antibióticos del grupo ß-lactámicos
(Penicilina, Ampicilina)
 Enzima (DD-carboxipeptidasa), efecto residual será menor
cuanto mayor cantidad de antibiótico tenga la muestra
Principio
Principio
• Inmunoensayo diseñado para detectar la presencia de diferentes
antibióticos
• Si el atb esta presente en la muestra se unirá a los anticuerpos
de la prueba
• Espectro de detección: Betalactamicos
Tetraciclinas
Gentamicinas
Sulfamentazina
Metodología
• Cargar la muestra de leche (450µl ± 50µl)
• Agregue al tubo y mezcle
• Incube el tubo y el SNAP a 45ºC, tiempo según lo que se quiera
detectar.
Betalactamicos (5 min)
Tetraciclinas (5 min)
Gentamicinas (2 min)
Sulfamentazina (2 min)
Metodología
Metodología
• Adicione la muestra en la celda
• Cuando la muestra alcance el círculo de activación y el color
comience a desaparecer presione el activador
• Incube el SNAP para:
Betalactamicos (4 min)
Tetraciclinas (4min)
Gentamicinas (7 min)
Sulfamentazina (7 min)
Resultados
Negativo:
El circulo de la muestra es mas oscuro o igual que el Control
RECEPTOR SE UNE A LA BANDA (porque no hay atb)
Control
Control
-
Resultados
Positivo:
El circulo de la muestra es mas claro que el Control
RECEPTOR (sustrato) SE UNA AL ANTIBIOTICO
Control
+
Resultados
Resultados
Resultados
Sensibilidad
Antibiótico
ppb
Penicilina
Ampicilina
Amoxicilina
Cloxacilina
Ceftiofur
Cephapirina
3
6
6
30
6
2
Ventajas
• Fácil de usar (3 pasos, lectura clara)
• Rápido (resultado en menos de 10 minutos)
• No necesita mezclar reactivos
• Mínima capacitación requerida
• Confiable: sensitivo, no hay riesgo de contaminación
• Control incorporado en cada prueba
 Ensayos de
(receptores)
sustitución
y
competencia
• CHARM I y II (14C y tritio, H3)
• Parallux (sust. fluorecentes)
Principio
 Utiliza la especificidad de los sitios de fijación de cada
antibiótico (atb) para unirse a ciertas proteínas.
 El atb “problema” competirá con un atb “marcado” por el sitio
de fijación
 Los marcadores en general son enzimas, que frente al sustrato
adecuado, producen desarrollo de color. (visualmente o con
espectrofotómetro)
 CHARM (I y II) los marcadores son Carbono 14 (14C) o Tritio (H3)
Ventaja: Rapidez con que se realiza (10 a 15 minutos)
 Desventaja: Espectro reducido de detección. (CHARM I). Solo
grupo de ß-lactamicos (Penicilina, Ceftiofur, Cloxacilina,
Amoxicilina, Ampicilina, Cephapirina)
 CHARM II (modificación del CHARM I): Mayor espectro de
acción.
Niveles de detección de antibióticos (ppb) (mg/l)
GRUPO
PEN
AMP
AMX
CLX
CEFT
DHI
OXI
SULFA
CHARM
II
4.8
8
10
40
4.5
50
19
10
Adaptado y modificado de González, O.
(2000)
Niveles de detección de antibióticos (ppb) (mg/l)