Espectrofotometría de absorción

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN DEL
AZUL DE METILENO Y DE LA CIANMETAHEMOGLOBINA
• FUNDAMENTO
Cuando se pretende determinar, espectrofotométricamente la concentración de un soluto de una disolución, es
imprescindible conocer las longitudes de onda a las que se produce la máxima absorción. Lo ideal es hacer
incidir sobre la solución un haz de luz con la longitud de onda que se produce la máxima absorción; para
descubrir la capacidad de absorción de una sustancia a distintas longitudes de onda, se hace un barrido de
longitudes de onda.
Cada sustancia tiene su espectro característico, por lo que podemos indentificarla en una solución cuya
composición desconocemos, y esto se suele emplear en la determinación de tóxicos en líquidos biológicos.
Existen dos formas de llevar a cabo los espectros de absorción:
• Manualmente: se lleva a cabo en un espectrofotómetro de haz simple, se coloca en la cubeta la
solución y vamos midiendo las absorbancias a distintas longitudes de onda.
• Automáticamente: se lleva a cabo en un espectrofotómetro de haz doble, en el que se sitúa la cubeta
con el blanco en una de sus celdas y en la otra la solución problema, se programa el aparato para q
haga incidir distintas longitudes de onda y este hace el barrido.
• AZUL DE METILENO
• Preparación de la mesa de trabajo:
♦ Papel de filtro
♦ Vaso de precipitado
♦ Matraz
♦ Pipeta de 5 ml
♦ Pipeta pasteur
♦ Tubo de ensayo
♦ Cubetas
♦ Espectrofotómetro
♦ Servilletas
♦ Preparar la solución, 25 ml de una disolución de 0.1% de concentración de azul de metileno, a
partir de una de 1%; para lo cual se pipetea 2.5 ml de azul de metileno y se le añade agua
destilada hasta los 25 ml.
Dispensar en un tubo de ensayo 5 ml.
♦ En una cubeta del espectrofotómetro vertemos la solución de azul de
metileno.
♦ Vamos a medir distintas longitudes de onda: 340, 405, 500, 546, 578 y
630.
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♦ Preparamos el espectrofotómetro, vamos a realizar esta práctica de forma manual.
⋅ Lo enchufamos y conectamos
⋅ Código 100 + enter
⋅ Utilidad 1 + enter
⋅ Código (nº que le vayamos a poner a nuestra técnica : X) + enter
⋅ Identificación (print) 0 (relativo a la absorbancia) + enter
⋅ Modo (print) 0 (relativo a la absorbancia) + enter
⋅ WL1 (1ª longitud de onda) + enter
⋅ WL2 no me hace falta + enter
⋅ Temperatura 37º + enter
⋅ Retardo de lectura 1 seg + enter
⋅ Terminado esto saldrán impresas todas las condiciones descritas y la técnica
ya está programada.
♦ Ejecución de la técnica
◊ Stop + código (X) + enter
◊ Nos pedirá que metamos un blanco, q será en este caso agua destilada + read.
◊ A continuación nos pedirá q metamos la muestra + read.
◊ Stop + código (X) + enter
◊ Identificación 0 + enter...... igual q antes hacemos todos los pasos otra vez, lo único q
cambia es que la longitud de onda va variando.
♦ A continuación vamos a realizar la misma técnica pero de una forma
automática.
♦ Ya tenemos conectado el espectrofotómetro
♦ Colocamos dos blancos en sus cubetas, que van a seguir siendo agua destilada y le damos a
Medida autocero.
♦ Sacamos una de las cubetas de blanco, la de abajo, y en su lugar colocamos la muestra.
♦ Le hemos metido los parámetros de longitudes de onda a la que queremos que nos mida las
absorbancias. (700 − 200 nm)
♦ El espectrofotómetro comienza a leer las absorbancias y hace la gráfica.
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