Especies patógenas gastrointestinales

OBJETIVO:
Identificar las especies patógenas de las vías gastrointestinales a través del coprocultivo y de sus reacciones
bioquímicas
INTODUCCION
La alta incidencia de procesos infecciosos entéricos en la población en general, en países desarrollados y en
vías de desarrollo, y sus elevados índices de morbi−mortalidad entre determinadas subpoblaciones (niños y
ancianos), hacen que este tipo de patología siga cobrando gran interés desde el punto de vista clínico y
microbiológico.
En países en vías de desarrollo suele ser la causa más frecuente de muerte y desnutrición en pacientes en edad
pediátrica. En países desarrollados, debido al aumento de la calidad de vida, hay una disminución de la
frecuencia y mortalidad, siendo la mayoría de los procesos autolimitados y resueltos con tratamiento
adecuado.
FINALIDAD DEL COPROCULTIVO
La finalidad del coprocultivo es determinar el pronostico del o los agentes causantes de las infecciones
intestinales y toxiinfección alimentaria estas por lo general están producidas por m. O. Pertenecientes a la
familia de las entero bacterias no por ello se descarta a otros m. O. Como stafilococcus productores de entero
toxinas Estreptococos , Clostridios , etc. Así como también virus , hongos y parásitos .
La búsqueda del agente causal no se descarta después de procesado una sola muestra ,la eliminación del
posible agente patógeno se hace muchas beses en forma intermitente obligando al microbiólogo repetir el
análisis por lo común después de una semana .
INDICACIONES DEL COPROCULTIVO
Generalmente suele indicarse en un cuadro entérico infeccioso persistente de más de 2 ó 3 días, se aconseja la
toma de muestras para exámenes de laboratorio.
Se recomienda la evaluación del cuadro: su duración, su gravedad (grado de deshidratación, fiebre, sangre en
heces, pérdida de peso, etc.); y la evaluación de los antecedentes clínicos del paciente: uso reciente de
antibióticos (diarreas asociadas a uso de antibióticos), edad del paciente (los rota virus son la primera causa de
gastroenteritis deshidratante en niños), ingestión de mariscos poco cocidos (orienta hacia la infección por
vibriones o virus símil Norwalk), viajes a zonas tropicales (aumentarían las infecciones por parásitos, virus, y
E. coli entero hemorrágico O157), en huéspedes inmuncomprometidos se tendrían que considerar un amplio
espectro de agentes etiológicos (bacterianos, parasitarios, víricos y micológicos), en brotes epidémicos se debe
orientar hacia la presencia de S. aureus, Cl. perfringens, Salmonella, Vibriones, Shigella, Campylobacter, E.
coli, B. Céreus. Algunos de ellos escapan a la rutina diagnóstica (S. aureus, B. Céreus, etc.) porque lo que
suele interesar es el estudio de su poder toxigénico. Finalmente en cuadros gastroentéricos que persisten
durante más de 10 días, se recomiendan los exámenes parasicológicos.
ETIOLOGÍA
El número de microorganismos responsables de cuadros entéricos se ha ido ampliando debido al mejor
conocimiento de los mismos y al desarrollo de métodos diagnósticos cada vez más sensibles.
1
Diversos microorganismos afectan directamente o a través de sus toxinas al tubo digestivo provocando
cuadros diarreicos, dolor abdominal, vómitos, fiebre, etc.
Las infecciones gastrointestinales pueden tener una etiología bacteriana y/o toxiinfección alimentaría, vírica y
parasitaria.
BACTERIANA : Entre las que incluiremos Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Shigella, Yersinia
entero colitica ,E. Coli entero patógeno , Psedomonas , Aeromonas , hidrófila , Pleciomonas , B. Céreus ,
Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, vibrios, y otras menos frecuentes como Mycobacterium
tuberculosis .
VIRICA : Los virus productores de gastroenteritis son Rotavirus, Adenovirus, virus Norwalk, entre otros.
PARASITARIA : Los agentes etiológicos parasitarios pueden representar un amplio grupo de los que sólo
mencionaremos algunos como Giardia lambia , Cryptosporidium, Entamoeba histolítica, Ciclos porra,
Blastocystis, etc.
MICOTICA : levaduras como cándida albicans .
Al igual que en el caso de otras muestras humanas, sería conveniente que el clínico orientase al laboratorio
sobre el proceso de infección y la etiología sospechosa. Todo ello repercutirá en beneficio del paciente,
permitiendo ganar tiempo en la obtención del diagnóstico y disminuyendo el coste del precio del análisis.
Esta orientación es de gran importancia, y en caso de no recibirla, sin ningún tipo de reparos debe ser el
microbiólogo quien la solicite al médico para que le dé informes sobre detalles epidemiológicos, período de
incubación, así como si el paciente cursa o no con fiebre. Es preciso recordar que las intoxicaciones
alimentarias, es decir, las debidas a toxinas producidas fuera del hospedador y después ingeridas,
generalmente no cursan con fiebre y tienen un período de incubación muy corto; en cambio, las producidas
directamente por microorganismos cursan habitualmente con fiebre y tardan más en aparecer.
En la tabla 1 se justifica, en parte, lo expuesto.
RELACION ENTRE ALGUNOS TIPOS DE GASTROENTERITIS Y LA FIEBRE (1)
Patología causada por
Período de incubación (3) Síntomas comunes (4)
(2)
Náuseas, vómitos,
calambres abdominales,
Staphylococcus aureus. Toxina (termoestable). 2−6 horas.
diarrea (30 %), sin fiebre o
muy poca.
Diarrea, dolor abdominal,
Salmonella.
Infección
12−36 horas.
por lo común fiebre.
Diarrea líquida con mucus;
Shigella
Infección
24−72 horas.
la fiebre es habitual
Toxina (moderadamente
Diarrea, calambres, sin
Clostridium perfringens.
6−12 horas.
termoestable)
fiebre o muy poca.
Gastroenteritis inicial
Clostridium botulinum. Toxina (termoestable)
Variable (de horas a días) seguida por efectos de tipo
curare.
Microorganismos
2
(1) La tabla describe algunos microorganismos productores de gastroenteritis.
(2) Patología causada por la producción de toxinas o por enteroinvasividad.
(3) El efecto patológico se manifiesta generalmente antes si el microorganismo produce toxinas.
(4) Entre los síntomas de gastroenteritis figura siempre la diarrea y sólo en los casos de infección es habitual
la fiebre.
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Se utilizaran heces recientes en un recipiente limpio de boca ancha y cierre hermético con un volumen
mínimo de 2 a 4 g en heces pastosas y 5 a 10 ml en heces líquidas.
En general debe desaconsejarse el uso de hisopos rectales y restringirlo a casos excepcionales como en
neonatos. En muestras digestivas se puede utilizar aspirado gástrico o duodenal.
Las biopsias y muestras obtenidas por endoscopia son fundamentales para la búsqueda de Helicobacter pylori
(biopsia gástrica y duodenal).
La biopsia rectal es empleada para la detección de Entamoeba histolítica.
El meconio se suele utilizar para estudio periférico en neonatos con riesgo de sepsis.
En muestras para estudio parasicológico se envían con frecuencia estas en frascos cerrados con líquido
conservador.
La obtención de la muestra se hará depositando directamente la misma en un recipiente estéril, para lo cual
puede servir una placa de Petri o un frasco de boca ancha. En caso de no ser posible esta toma directa, se
recogerá con una cuchara estéril alguna porción del material fecal recién emitido, que no haya entrado en
contacto con el frasco receptor (orinal), y se verterá en un contenedor estéril.
Se recomienda procesar las muestras en el menor tiempo posible puesto que un numero de m. O. No
sobreviven a lo cambios en el PH lo cual ocurre cuando baja la temperatura , esto es especialmente importante
cuando se trata de Shigella y un numero apreciable de salmonellas , si se desea preservar las muestras se
deben de someter a la acción de un preservante como el buffer fosfato 0.033 M mezclado con igual volumen
de glicerina se estará frente a un PH de 7.0 . las muestras se obtienen por evacuación natural o mediante frotis
rectal de una evacuación natural tomar las porciones que presenten mucosidad y sangre , cuando se obtiene la
muestra por frotis rectal se debe de utilizar una torunda de 6 y sembrar inmediatamente en los medios
apropiados o en su efecto colocar en un medio de transporte . este método de toma de muestra es por lo
general utilizado en lactantes .
El producto así recogido se debe sembrar inmediatamente, incluso en la misma habitación del paciente si ello
es posible, pues algunos patógenos intestinales, concretamente Shigella y algunas especies de Salmonella,
sobreviven muy poco tiempo a los cambios de pH que sufren las heces en contacto con el ambiente. En caso
de no poder sembrar la muestra «in situ», y ante la necesidad de mandarla a un laboratorio, aunque esté
relativamente cercano, es conveniente enviar parte de ella, incluida en algún medio de transporte que
mantenga el pH cercano a la neutralidad. Entre estos medios de transporte se pueden citar:
a) Buffer fosfato 0,033 M, mezclado en partes iguales con glicerina.
b) Medio tamponado con indicador (Sachs, 1939). Es parecido al anterior, con la innovación de incluir un
indicador, que señala que el medio sólo se puede utilizar en condiciones de coloración rosa y que se debe
desechar cuando adquiere tonalidad amarilla.
3
c) Medio de Hajna. Es un excelente medio para el transporte de heces que contienen Salmonella o Shigella..
Puede adquirirse comercializado en forma deshidratada y añadirle, una vez rehidratado, glicerina al 30 por
100.
d) Caldo GN. Debido también a Hajna.
e) Medio de transporte de Cary−Blair. Es quizá el más aceptado universalmente. Permite incluso la
recuperación de anaerobios.
NÚMERO DE MUESTRAS
Si con la primera muestra no se detecta la presencia de entero patógenos, es necesario enviar dos tomas más
en diferentes días.
MUESTRAS INADECUADAS
No se consideran adecuadas las heces emitidas no procesadas antes de 2 horas y no refrigeradas y el envío de
tres muestras de heces el mismo día.
OBSERVACIONES
Las muestras deberán tomarse antes de la administración de antibióticos y se debe indicar siempre en el
volante de petición el juicio diagnóstico de presunción, la edad y explícitamente algunas investigaciones
especiales como toxina de C. difficile.
PROCESAMIENTO Y VALORACIÓN
OBSERVACIÓN DE LA MUESTRA
Se puede realizar un examen microscópico para detectar polimorfo nucleares (sugiere infección por un
patógeno invasivo) y flora predominante.
Al recibir la muestra en el laboratorio se observarán detenidamente sus características, tales como el olor,
color, consistencia, o la presencia de mucosidades, sangre, o restos de alimentos sin digerir. Estos detalles
pueden orientar algo el diagnóstico; así, por ejemplo, unas heces líquidas con grumos en forma de agua de
arroz, harán pensar en el cólera, o la sangre y mucosidades indicarán una sintomatología inflamatoria del
intestino, que puede ser debida a una disentería.
Hay autores que completan esta apreciación microscópica, mezclando en un porta una pequeña porción de
heces con una gota de azul de metileno, tapándolo con un cubre y observando la preparación con objetivo de
inmersión, intentando descubrir leucocitos. Su presencia denotará que hay inflamación en el intestino, la cual
suele estar producida por agentes infecciosos invasores como Salmonella, Shigella o E. coli enteroinvasivo; en
cambio, ante un proceso gastroenterítico, con heces exentas de glóbulos blancos, se sospecha una etiología
virásica, o una bacteriana capaz de producir toxina, como vibrio cholerae, Staphylococcus aureus,
Clostridium perfringens, Clostridium botulinum o E. coli entero tóxico. Incluso hay investigadores que afinan
más, y con una técnica de coloración como la de Wright, llegan a establecer las distinciones etiológicas
expuestas en la tabla 2.
ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES ASOCIADAS CON LEUCOCITOS FECALES
Enfermedad
Tipo de leucocito predominante (2)
4
Porcentaje de pacientes con
leucocitosis fecal (1)
Shigelosis
Salmonelosis (no por S.
typhi)
Fiebre tifoidea
100
82
100
E. coli (invasor)
100
Colitis ulcerosa (activa)
100
Disentería amebiana (activa) Variable
Controles sanos, diarrea
virásica, cólera.
Leucocitos polimorfo nucleares (media 84
%).
Leucocitos polimorfo nucleares (media 75
%).
Leucocitos mononucleares (media 95 %)
Leucocitos polimorfonucleares (media 85
%).
Leucocitos polimorfonucleares (media 88%)
(eosinófilos, media 8 %).
Por lo general mononucleares, salvo
infección bacteriana secundaria
0−10
• La leucocitosis fecal se puede apreciar, simplemente, por observación entre porta y cubre.
• El tipo de leucocitos se observa después de una coloración de Gram.
EXAMEN DIRECTO CON SOLUCION DE LUGOL Y SOLUCION SALINA
Es un método muy fácil de realizar , valido para la búsqueda de huevecillos, trofozoitos, larvas y quistes de
helmintos y protozoarios.
TÉCNICA:
• Se toma un fragmento de materia fecal de aproximadamente 1mm de diámetro con el aplicador.
• Se lleva a un porta, el cual contendrá una gota de solución salina o yodo lugol.
• Se emulsiona perfectamente, se protege con un cubre y se observa al microscopio. Si la muestra tiene moco
con sangre se realiza una toma igual del sitio.
EXAMEN RUTINARIO
Consiste fundamentalmente en la inoculación de la muestra diluida en solución fisiológica en diversos medios
de cultivo, alguno de ellos general como el Agar sangre para evaluación general de la flora.
Otros medios moderadamente selectivos para aislamiento de entero bacterias patógenas como MacConkey,
Salmonella−Shigella, XLD (xilosa−lisina−desoxicolato), CIN (cefsulodina−irgasan−novobiocina) que
permiten el crecimiento de Salmonella, Shigella, Yersinia. Sabouraud cloranfenicol para cándida cuando se
presenta en disbacteriosis.
Medios líquidos de enriquecimiento, para la recuperación de algunos microorganismos, como el medio de
Selenito
Medios para Campylobacter como el medio de Skirrow, en ambiente microaerofílico. También en este mismo
ambiente, diversos medios como el Agar sangre, se pueden emplear para Helicobacter.
Detección de rotavirus y adenovirus en niños, especialmente en meses invernales y de temperatura templada.
CULTIVOS O PRUEBAS ESPECIALES
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Se debe hacer constar en el volante de petición esa circunstancia. Por ejemplo para detección de Vibrio sp. con
medios como agua de peptona y TCBS. En toxina de Clostridium difficile, especial atención a enfermos que
hayan usado recientemente antibióticos durante algunos días.
Detección de toxina de E. coli entero patógeno O157H7 en heces hemorrágicas.
En los casos poco frecuentes de búsqueda de cepa Salmonella lactosa positiva, añadir a los medios habituales
Agar sulfito bismuto o verde brillante. Aeromonas mesófilas con temperatura de incubación de 25 a 30 °C.
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y Bacillus cereus relacionados con brotes de toxiinfección
alimentaria, sólo en laboratorios que realicen análisis de alimentos.
Ensayos para virus causantes de esta patología, como rotavirus, adenovirus , etc.
AISLAMIENTO Y CULTIVO
MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
Muestra de materia fecal en frasco con tapa.
Placas estériles de: agar soya tripticaseína, agar EMB, agar endo, agar S−S, agar verde brillante. , Mac
Conkey , XLD .
Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo tetrationato.
Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo nutritivo estéril.
Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo selenito
Mechero, asa, incubadora.
Al día siguiente:
Placas con coprocultivo.
Equipo de coloración de Gram
Serie de tubos de cultivo para pruebas bioquímicas tales como TSI , SIM , LIA , CITRATO DE SIMONS ,
UREA , etc.
Mechero, asa, tina, puente, piseta.
Lámpara de alcohol.
SIEMBRA DE MUESTRAS PARA BACTERIOLOGÍA
BIOSEGURIDAD
Tómense precauciones de asepsia al manipular los especimenes. al inocular en los tubos es indispensable el
uso de mascarillas y gorra. trabajar siempre frente a la flama del mechero
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Para hacer el coprocultivo, es decir, la siembra de las muestras fecales, se recogerán aquellas partes del
contenido intestinal que llamen más la atención por su aspecto sanguinolento o mucoso, pues es allí donde
abundan los microorganismos patógenos.
La inoculación se efectuará sobre medios de cultivo propios y selectivos de los principales patógenos
intestinales, incluyendo, dada su importancia, un medio de enriquecimiento para Salmonella (Selenito o
tetrationato). Las cepas de Salmonella aisladas se identificarán por pruebas bioquímicas y se confirmará su
identidad mediante un polivalente serológico. No es necesario que los pequeños laboratorios dispongan de
todo el amplio material perecedero para serotipificar a Salmonella. La presencia de Shigella también se
confirmará serológicamente
Es discutible la inclusión rutinaria de métodos y medios para el diagnóstico de Vibrio cholerae y
Campylobacter. El primero porque es poco frecuente y además porque las características clínicas del paciente
y las de la muestra ya orientarían hacia ello en caso necesario. El segundo porque, aunque actualmente ocupa
el primer puesto en incidencia patológica intestinal, su metodología de cultivo e incubación resulta cara para
una práctica sistemática de todas y cada una de las solicitudes. En este caso se valorará individualmente cada
muestra, concediendo especial importancia a la edad del paciente y a la consistencia del producto.
Todo lo tratado demuestra que la Microbiología es una ciencia viva, en constante desarrollo, y que su
investigador, aunque tenga establecidos unos esquemas teóricos a seguir, deberá en ocasiones hacer uso de
improvisaciones prácticas, vinculadas a su experiencia científica.
las muestras obtenidas según los métodos señalados estas deben ser procesadas en el menor tiempo posible
utilizando para ello una torunda o una ansa de kolle sembrar mas o menos 1 g de muestra en los medios de
enriquecimiento escogiendo de preferencia las porciones que presentan mucosidad y sangre paralelamente se
deben sembrar en placas con agar Salmonella − Shigella , agar verde brillante , xld agar y agar mac conkey
este ultimo con la finalidad de aislar E. Coli entero patógeno (EPI) muy común en las diarreas infantiles , los
medios sembrados deben dejarse en incubación por 24− 48 horas a 37°C .
ESQUEMA A SEGUIR EN EL PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA DEL COPROCULTIVO
PROCEDIMIENTO
1) Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de tetrationato. Inocular con asa por
emulsión.
2) De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de caldo nutritivo.
3) Etiquetar con los datos escolares
4) Levar a la incubadora a 37ºC durante 24 horas. Colocar los tubos en gradilla de rejilla, de tal manera que se
mantengan en posición vertical para evitar que el líquido se derrame.
RESIEMBRA.
BIOSEGURIDAD
Al inocular las placas, es indispensable el uso de mascarillas as y gorra. Trabajar frente a la flama.
1) Retirar los tubos de la incubadora.
2) Disponer sobre la mesa una serie de medios selectivos (agar EMB, agar S−S, agar verde brillante y agar
soya tripticaseina) para resembrar el cultivo en caldo de tetrationato.
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3) Disponer sobre la mesa una serie de los mismos medios selectivos para resembrar el cultivo en caldo
nutritivo.
4) Resembrar en cada una de las placas el inóculo correspondiente por la técnica de estrias cruzadas
sectoriales. Usar solo una asada para cada placa.
5) Sellar las placas. Etiquetar con los datos escolares
6) Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posición invertida. Mantenerlas durante 24 horas.
Al día siguiente:
1) Retirar las placas de la incubadora.
2) Efectuar análisis macroscópico de cada una para valoración de la prueba presuntiva respecto a la
fermentación de la lactosa, de acuerdo a la siguiente:
GUIA DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA
La prueba de identificación presuntiva para diferenciación de los bacilos entéricos Gram. negativos se basa en
la valoración de la fermentación de la lactosa sobre medios de cultivo adicionados con este carbohidrato,
como el agar endo o el agar EMB:
a) Enterobacilos que producen fermentación rápida de la lactosa: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae.
b) Enterobacilos que producen fermentación lenta de la lactosa: Edwarsiella, Serratia, Citrabacter, Arizona,
Providencia, Erwinia.
c) Enterobacilos que no producen fermentación de la lactosa: Shigella, Salmonella, Proteus, Pseudomonas.
La manera de cómo metabolizan este azúcar en los diferentes medios de cultivo selectivos se manifiestan por
cambios en el color del medio con respecto al que originalmente tenía o bien por la coloración de las colonias,
la cual es típica en algunos de elos, al respecto, se sugiere utilizar la siguiente tabla:
BACTERIAS
MEDIOS
EMB
DE
MAC
CONKEY
CULTIVO
SSA
Opacas parte
central negra ,
periferie
transparente
SALMONELLA
translucidas
incoloras
incoloras
transparentes
PROTEUS
Translucidas o
incoloras
centro negro ,
Translucidas o
periferie
incoloras
transparente
E. COOLÍ OTRAS
COLIFORMES
Centro oscuro
conbrillometalico
Rojas, rosadas Rojas o rosadas
rodeadas por
poco coloreadas
una zona de
con centro rosado
HK
XLD
Negras si
producen
Colonias
SH2 y rojas
verdes
si no
−azuladas
producen
SH2
Opacas ,
amarillas
(Mirabilis y
Vulgaris)
Salmón
Opacas −
−anaranjado amarillas
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SHIGUELLA
translucidas
incoloras
bilis
precipitada
incoloras
transparentes
PSEUDOMONAS
translucidas
incoloras
translucidas
incoloras
KLEBSIELLA
Mucosas mas
grandes que E. Coli Rosadas y
tienden a unirse ,
mucosas
siempre convexas
ENTEROBACTER ,
SERRATIA
Blancas o
Brillo metálico mas
Rojas − rosadas cremosas opacas
grandes que E.coli
y mucosas
ARIZONA
translucidas
incoloras
CITROBACTER
Transparentes con
brillo verde
metálico
Incoloras
transparentes
rojas las LF.
opacas
transparentes
Principalmente
inhibidas o
translucidas
incoloras
Rojas rosadas ,
incoloras con el
centro rosado
Parte central
negra y bordes
transparentes
Verde
−azulado
Rojas
A veces
colonias
rojas
Opacas −
amarillas
Colonias
opacas y
amarillas
Colonias
rojas con la
parte central
negra
LEYENDA
EMB : Eosin methilene blue agar
SSA : salmonella − shiguella agar
XLD : xilose −lycine desoxicolato agar
Mc C : agar Mac Conkey
VB : agar verde brillante
HK : agar enterico de hektone
3) Efectuar análisis microscópico por el método de Gram de cada una de las placas para confirmación de la
morfología de los bacilos entéricos gram negativos en los medios selectivos y para búsqueda e identificación
de Entero cocos en los medios de uso general como el agar soya tripticaseina.
4) Seleccionar en los medios selectivos una variedad de colonias consideradas como sospechosas de
pertenecer a algún género patógeno (segundo grupo en la tabla anterior) y resembrarlas en los medios
diferenciales para conocer sus REACCIONES BIOQUÍMICAS como se indica a continuación.
CONTROL E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
al termino de la incubacion se seleccionan las colonias sospechosas en las placas de agar SS , VB ,y agar Mac
conkey de los caldos senbrados se repican en los mismos medios señalados . se ara enfasis en la busqueda de
colonias pequeñas no fermentadoras de lactosa con excepcion de E. coli EPI que si fermenta la lactosa y
presenta las mismas caracteristicas morfologicas de una E.coli componente normal de la flora intestinal , la
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unica forma de identificar este m.o . es por serologia , las colonias seleccionadas se suspenden en una gota de
suero OB polivalente colocada en un porta obgeto , se homogenisa y se ajita por vaiven ,observar si presenta
aglutinacion o no sobre un fondo oscuro . otras colonias sospechosas son seleccionadas para su identificacion
bioquimica en los medios de TSI , LIA, citrato de simons , urea ,SIM entre otros . al termino de 24 horas de
incuvacion a 37°c se efectuan las lecturas utilizando la tabladeidentificacion de enterobacterias .
Es indudable que la Salmonella y shiguella son los m.o.que frecuentemente producen cuadros de toxiinfecion ,
tanto en elhombre como en los animales pudiendo encontrarlos con mayor fasilidad durante los tres primeros
dias del cuadro diarreico . para el aislamiento de Salmonella y sgiguella los autores Tailor y Eschelhart
Rollender y Coll recomiendan el uso de medio de cultivo XLD , la siembra debe ser directa y lo mas fina
posible a fin de obtener colonias aisladas , encanbio cuando se trata de medios altamente selectivos la sienbra
por estrias es abundante . El cresimiento de Salmonellas en medio XLD se presenta como colonias rojas,
muchas veses con el centro de la misma de color negro .
Cuando sequiere aislar Estafilococos patogenos se hace uso demedios furtemente inhibidores de laflora
intestinal grm negativa. tal es el caso del medio manitol salado y el agar Baird Parker en elprimero
sedesarrollan colonias doradas rodeadas de un alo amarillo por fermentacion del azucar y en el segundo las
colonias son pequeñas , negras y rodeadas de un alo transparente devido a la ovolisis .
La inbestigacion de cocos patogenos no deve ser descartado en la rutina entos se an encontrado en el orden de
15− 20 % segun Ginton y Col. Asi mismo de manera obcional se puede investigar Candida albicans
,Mycobacterium tuberculosis y V.cholerae esto inplica disponer de mayor tienpo y los costos aumentan
considerablemente , su inbestigacion esta superitado deacuerdo a la nesesidad del clinico tratante .
Por lo tanto un examen de materia fecal nos lleva a determinar la existencia de trastornos de la digestion ,
alteraciones en las paredes gastrointestinales y la existencia de parasitos y m. o.patogenos .
prebiamente es nesesario efectuar un examen macroscopico , suspendiendo la muestra en solucion ficiologica
y en una placa petri , inclinando esta se podra aprecia si hay moco , restos alimenticios ,pus restos o parasitos
adultos ,etc. posteriormente efectuaruna obserbacion microscopica de un preparado en una lamina portaobgeto
con nsolucion de lugol y salina , la existencia de polimorfonucleares y piocitos indica una inflamacion o
infeccion , encanbio si las heces son ndiarreicas pero que en el examen no seobserban muchos
polimorfonucleares ni piocitos ,puede que eltrastorno sea de origen alimenticio y no nesesariamente de origen
bacteriano ,esto no libera al microbiologo de prosesar la muestra para su inbestigacion rutinaria .
REACCIONES BIOQUÍMICAS
1) Disponer a la temperatura ambiente en gradilla una serie doble de tubos de cultivo para reacciones
bioquímicas.
2) Resembrar del medio de cultivo que contiene las colonias de bacilos Gram. negativos seleccionados como
sospechosas a los medios para bioquímicas dejando uno de uno sin sembrar para emplearlo como control
negativo.
a) En los medios inclinados sembrar por estrías.
b) En los medios verticales sembrar por picadura. asa
c) En los medios líquidos sembrar por emulsión.
3) Etiquetar con los datos escolares. Llevar a la incubadora por 24 horas.
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AL DIA SIGUIENTE:
4) Retirar las series de tubos con las reacciones bioquímicas.
5) Interpretar las reacciones bioquímicas en cada uno de los tubos, de la siguiente manera.
AGAR HIERRO DE KLIGLER
Es una prueba diferencial y además se trata de una multiprueba. Se compone de dos hidratos de carbono
(Lactosa en un 1% y Glucosa en un 0,1%). La Glucosa se encuentra en menor cantidad para que se consuma
antes de las 24 horas de incubación y necesariamente las bacterias tengan que consumir las peptonas, con lo
que se produce amoníaco y se alcaliniza el medio.
1.− hay 3 formas básicas de fermentación en este medio de cultivo:
ð Que solamente se fermente la Glucosa: por principio, todas las enterobacterias fermentan la glucosa.
Cuando la glucosa se acaba y la bacteria no es capaz de utilizar la lactosa, se alimentará de las peptonas del
medio.
Método: la siembra se hace en profundidad (condiciones anaerobias) y en superficie (condiciones aerobias).
La muestra debe proceder de un medio de cultivo puro, se tomará una colonia con un hilo de siembra y se hará
la inoculación del medio de cultivo primero en profundidad, y segundo, según sacamos el asa, en superficie.
La lectura se realizará tras un tiempo de incubación de 24 horas (que se ha de cumplir a rajatabla) a 35−37ºC.
Resultados: Si se fermenta la Glucosa, se producen unos compuestos que acidifican el medio y, por lo tanto,
el medio virará a amarillo. Si además de la Glucosa utiliza las peptonas, que producen amoniaco, el medio se
alcaliniza y en lugar de virar a amarillo virará a rojo intenso. Esto último solo ocurre en la siembra que se ha
hecho en la superficie, es decir, que veremos la superficie roja y el fondo amarillo. Esto es así porque los
productos metabólicos son diferentes si la transformación es aeróbica o anaeróbica.
ð Que fermente tanto la Glucosa como la Lactosa: Se observará el medio totalmente amarillo, debido al pH
ácido.
ð Que no fermente ninguna: se alimenta desde el principio de las peptonas, por lo tanto podremos afirmar
que no se trata de una Enterobacteria. Se originarán una serie de productos alcalinos que virarán el medio a
rojo tanto en el fondo como en la superficie, siempre y cuando la bacteria sea capaz de consumir las peptonas
tanto en medio aerobio como anaerobio. Si la bacteria solo fuera capaz de utilizar las peptonas de forma
aerobia, la superficie aparecería roja, mientras que el fondo permanecería sin cambios.
2 Observación de la producción de gas (CO2 y H2): Si en el medio se forma alguno de estos gases, se
observarán algunos cambios en el medio de cultivo:
− Aparición de burbujas.
− Fracturas en el agar.
1.− Desplazamiento del medio de cultivo hacia la boca del mismo debido a una producción intensa de gas.
ð Observación de la producción de Sulfhídrico (SH2). Para que se produzca el SH2
ð Las condiciones han de ser ácidas
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ð Se necesita una fuente que suministre el azufre (Tiosulfato de Sodio)
ð Se necesita un indicador que nos permita visualizarlo (Sal de hierro Citrato Férrico Amoniacal). Este
indicador hace que el SH2 precipite en forma de un precipitado negro. Si la cantidad precipitada es pequeña,
el precipitado se observará en la superficie del medio de cultivo. Si, por el contrario, la producción de SH2 es
muy intensa, toda la parte profunda del tubo se verá negra. Ahora bien, si todo el fondo se ve negro ¿cómo
sabremos el viraje del medio?. Pues bien, como para que se pueda producir el Sulfhídrico es necesario que se
den unas condiciones ácidas, deberemos suponer que el medio de cultivo habrá virado a amarillo en el fondo.
En la superficie si podremos diferencias entre el rojo y el amarillo sin ningún problema.
PRUEBA DE LA CATALASA
Definición: Es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas
(a excepción del Estreptococcus, por eso es una prueba que nos permite diferenciar entre Estafilococos y
Estreptococos).
Función: Descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2 o agua oxigenada) que se forma como producto
terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azúcares:
2 H2O2 ððððð 2 H2O + O2 (gas)
Catalasa
Técnica: Consiste en recoger con el asa de siembra una colonia procedente de un cultivo puro, reciente y
colocarla sobre un portaobjetos. A continuación agregamos 1 gota de peróxido de hidrógeno al
30%(comercial) sobre el microorganismo con una pipeta Pasteur (no es necesario homogeneizar).
Resultados:
1 Si la prueba es POSITIVA: se formarán inmediatamente burbujas bien visibles.
2 Si la prueba es NEGATIVA: no se observará burbujeo.
Precauciones: es importante que la muestra no tenga su origen en un medio que contenga sangre, ya que
podríamos obtener falsos positivos.
PRUEBA DE LA OXIDASA O CITOCROMOOXIDASA
Principio: se basa en determinar la presencia de las enzimas oxidasas, las cuales catalizan la transferencia de
electrones desde el sustrato, que es generalmente orgánico, hasta el oxígeno.
Técnica: Se realizará según las instrucciones de la casa que nos proporcione el producto. Generalmente, en las
oxidasas positivas, se produce una reacción entre la enzima y un sustrato que está en la tira reactiva dando
lugar a un producto coloreado que suele ser el azul de indofenol. El reactivo puede variar de una casa
comercial a otra, así una prueba oxidasa+ se observará de un color que oscila entre el púrpura y el negro.
Precauciones: No tomar la muestra de medios coloreados.
PRUEBA DEL INDOL
Principio: se basa en determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el indol de la molécula de
triptófano, que es un aminoácido, que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar metabolitos
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indólicos. A este grupo de enzimas, capaces de desdoblar el triptófano se les denomina triptofanasas.
Técnica: Se utiliza un caldo de triptona o de peptona (a veces también se utiliza un medio semisólido: medio
de S.I.M = Sulfhídrico; Indol; Movilidad). Se disponen 5 mL del medio en cada uno de los tubos que vayamos
a utilizar para la prueba, esterilizamos, inoculamos e incubamos (35−37ºC / 24h). Por último, para saber si se
ha producido el Indol añadimos 5 gotas del reactivo de Kovacs indol.
Resultados:
1 Si la prueba es POSITIVA: aparece un anillo rojo en la superficie del medio.
2 Si la prueba es NEGATIVA: permanece un color amarillo, que es el color del reactivo (el reactivo es un
aldehído)
PRUEBA DEL CITRATO
Principio: consiste en determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono
alcalinizando el medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado para observar la fermentación de citrato
contiene también sales de amonio inorgánicas. Un organismo que es capaz de utilizar el citrato como única
fuente de carbono, utiliza también las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. Estas sales de amonio
se van a desdoblar en amoniaco produciendo la consiguiente alcalinidad. El medio utilizado es el Agar Citrato
de Simmons que lleva como indicador el azul de bromotimol (cuando el pH es alcalino vira a azul intenso,
mientras que el medio sin inocular tiene un color verde).
Técnica: Se utiliza un tubo inclinado. Hacemos la estría en superficie con un inóculo poco denso y lo
llevamos a incubar (35−37ºC / 24h)
Resultados:
1.− Si la prueba es POSITIVA: En la superficie del medio de cultivo se observa un viraje del verde a azul
intenso.
2.−Si la prueba es NEGATIVA: no se produce viraje, se queda verde.
PRUEBA DEL ROJO METILO−VOGES PROSKAUER (RM−VP)
INTRODUCCIÓN: Para el metabolismo de los Hidratos de Carbono se pueden dar varios procesos:
• Glucólisis: proceso de hidrólisis por el cual se transforma la glucosa en ácido pirúvico.
• Vías alternativas
− Pentosas fosfato: se puede usar al mismo tiempo que la Glucólisis o de forma independiente.
− Entner Douduroff: la utilizan algunas Enterobacterias sin necesidad de utilizar la Glucólisis y la vía de las
pentosas fosfato.
El ácido pirúvico puede usarse mediante:
ðVía aeróbica: Respiración.
ð El aceptor final de electrones es una molécula inorgánica (O2).
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ð Como productos obtenemos CO2 y H2O
ð Empoacetilo + CoA ciclo de Krebs + cadena transportadora de e−
ðVía anaerobia: Fermentación.
ð El aceptor final de electrones es una molécula orgánica.
ð Es de menor rendimiento energético que la Glucólisis.
ð Puede ser de tres tipos:
ð Láctica
ð Alcohólica
ð Ácido mixta o del Grupo Califorme: tiene como productos:
− Ácidos mixtos: fórmico, acético, succínico, etílico... (RM+)
− Butilenglicol ó Butanediol Acetoína (RM−)
ROJO DE METILO (RM)
Principio: Es una prueba que mide de forma cualitativa los productos ácidos que se originan por el
metabolismo de la Glucosa de forma que, cuando estos ácidos se producen en cantidad elevada, consiguen
superar el sistema amortiguador llevando el pH del medio hasta 4 − 4,5.
Técnica: Se siembra 1 tubo para la prueba RM y otro para la de VP para cada muestra. Se incuba a 30−37ºC
durante 48 horas a 4 días ó incluso 6 días, y finalizado el período de incubación le añadimos al tubo del RM
0,1−0,2 mL del reactivo Rojo de Metilo.
Resultados:
• Si la prueba es POSITIVA aparece coloración roja en la superficie de contacto del reactivo y del
medio de cultivo.
• Si la prueba es NEGATIVA se queda el color del medio (amarillo)
Precauciones:
Es importante incubar como mínimo 48 horas. Si se observa un color anaranjado hay que continuar con la
incubación hasta 4 días.
Si hacemos la lectura antes de las 48 horas todas las enterobacterias darán la prueba positiva, ya que todas
fermentan la glucosa.
Las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo positivas producen como consecuencia del metabolismo de
la glucosa unos productos ácidos en gran cantidad y estables. Trascurridas las 48 horas se añade el indicador.
En este caso, los ácidos habrán superado el sistema amortiguador del tampón (pH = 4 − 4,5), por el contrario,
las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo negativas también producen ácidos pero se producen en
menor cantidad, son menos estables, se produce mayor cantidad de CO2 y, además, se producen productos
como consecuencia de la degradación de las peptonas, con lo que el pH tiende a la neutralidad, es decir que
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tiende a alcalinizarse.
VOGES−PROSKAUER
Principio: Es una prueba que pone de manifiesto un producto final neutro que es la Acetoína.
Técnica: Se inocula y se incuba durante 24 − 48 horas. Para poner de manifiesto la acetoína se utilizan 0,6
mL de ð−naftol al 5% (intensifica el color) y 0,2 mL de KOH ó NaOH al 40% (oxida la acetoína en diacetilo,
que es el producto coloreado junto con el alcali y las peptonas). Es importante que se añadan en este orden y
tienen que ser medidas exactas.
Resultados: Se realiza la lectura a los 10−15 min de la adición de los reactivos:
1.− Si la prueba es POSITIVA se observa un color rojo rosado en la superficie del medio.
2.− Si la prueba es NEGATIVA se observa un color amarillo en la superficie del medio
Precauciones:
Después de la incubación del reactivo es importante dejar destapado el tubo con el fin de que el O2 se ponga
en contacto con los productos formados, de tal forma que se acelere la reacción.
En la mayoría de los casos, las enterobacterias que son RM+ son PV− y viceversa.
O.N.P.G ORTONITROFENOL ð−D−GALACTOPIRANÓSIDO
Principio: Es una prueba que pone de manifiesto la capacidad de un m.o de fermentar la Lactosa, demostrando
la presencia ó ausencia de la enzima ð−galactosidasa cuando se emplea un compuesto orgánico que es el
ONPG. Si en la célula bacteriana se encuentran enzimas para metabolizar la lactosa, el reactivo ONPG es
hidrolizado, liberando un compuesto amarillo (ortonitrofenol).
Estas enzimas son inducidas y están controladas genéticamente. Pueden disminuir o desaparecer después de
varias generaciones si el sustrato no está presente.
NOTA: las enzimas inducidas son aquellas que la bacteria produce exclusivamente cuando se encuentra el
sustrato sobre el que se va a ejercer su acción. Las enzimas constitutivas son aquellas que son producidas por
la bacteria independientemente de que el sustrato se encuentre o no en el medio de cultivo.
Para que se produzca la fermentación de la Lactosa, un microorganismo necesita 2 enzimas:
ððð ð − galactosidasa permeasa: Se encuentra en la membrana celular. Transporta la Lactosa al interior
celular.
ððð ð −D− galactosidasa: Hidroliza la Lactosa en el interior celular.
En función de que la bacteria tenga una, las dos o ninguna de las enzimas, podemos clasificarlas en:
ð Activas: Poseen las dos enzimas.
ð Retardadas: Carecen de la ð−galactosidasa permeasa y poseen la ð−D−galactosidasa. Tardan más tiempo
en degradas la Lactosa porque tienen que producir la permeasa.
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ð No fermentadores: No poseen ninguna de las enzimas.
Técnica: Es necesario partir de un cultivo puro, reciente, preferiblemente obtenido a partir de un medio de
cultivo de Kligler. Tomaremos una cantidad espesa de inóculo para demostrar rápidamente la presencia de la
enzima.
A partir del cultivo preparamos una suspensión del microorganismo en un tubo de hemólisis con 0,5 mL de
agua destilada. Ponemos un disco de ONPG en el tubo y lo incubamos a 37ºC.
Resultados:
• Si la prueba es POSITIVA: en los 15−30 minutos posteriores a la adición del disco, el medio se habrá
vuelto amarillo.
• Si la prueba es NEGATIVA: habrá que esperar entre 2,3 o incluso 24 horas para una buena
confirmación. El medio no cambiará de color.
PRUEBA DE LAS DESCARBOXILASAS
Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad que tiene un microorganismo, mediante la
enzima correspondiente, para decarboxilar un aminoácido (Lisina, Arginina, Ornitina). Son enzimas inducidas
y, generalmente, estas reacciones se producen en condiciones anaerobias. Son capaces de actuar sobre
distintos aminoácidos, la enzima ataca al grupo carboxilo (−COOH) y da lugar a una amina y a CO2.
Nosotros sólo realizaremos la prueba de la Lisina Carboxilasa. Si esta enzima se encuentra presente se
formará Cadaverina y CO2 (alcaliniza).
Dependiendo del medio de cultivo que se utilice, una vez inoculado, es necesario sellarlo para obtener las
condiciones anaerobias. En este caso del caldo de Lisina no es necesario sellarlo, basta un tapón metálico,
preferiblemente de rosca.
Técnica: Inoculamos el medio de cultivo (caldo) con un inóculo escaso y lo incubamos durante 24 horas a
37ºC. En algunos casos es necesario incubar hasta 4 días.
Resultados: El medio sin inocular es de color púrpura y suele contener glucosa y el aminoácido que
queremos estudiar.
• Si la prueba es POSITIVA: el medio tomará un color púrpura amarillento o púrpura turbio. Primero
habrá pasado por el color amarillo y luego habrá revirado al púrpura.
• Si la prueba es NEGATIVA: el medio tomara un color amarillo brillante. Solo se consume la glucosa.
Precauciones: Es conveniente guardar un tubo sin inocular con el fin de comprobar los resultados.
Prueba de la Ureasa
Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad orgánica de algunas bacterias de desdoblar la
urea en dos moléculas de amoníaco, mediante la acción de la enzima Ureasa, que es una enzima constitutiva.
Técnica: Se pueden utilizar distintos medios de cultivo:
• Agar base de urea: tiene el inconveniente que hay que prepararlo, esterilizarlo y, antes de que se
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enfríe, hay que añadirle la urea. Se usa de forma inclinada.
• Caldo de urea: ya lleva incorporada la urea. Directamente se siembra el microorganismo y se incuba.
Resultados: Se observa a las 24 o incluso a las 48 horas.
ð Si la prueba es POSITIVA: el medio se observará de un color rosado
ð Si la prueba es NEGATIVA: no se producirá ningún cambio de color. Se mantendrá el color
amarillo−anaranjado del medio inicial.
Prueba de la Fenilalanina Desaminasa
Principio: La prueba pone de manifiesto la capacidad enzimática de un microorganismo para desaminar la
fenilalanina, originándose el ácido fenilpirúvico.
Técnica: Se utiliza el medio fenilalanina en tubo inclinado. Se siembra un inóculo denso, reciente, puro y se
incuba durante 24 horas.
Resultados: Para poner de manifiesto el producto coloreado se añade Cloruro Férrico al 10% : Ác.
Fenilpirúvico + Cloruro Férrico COLOR
Dejamos resbalar por la superficie del agar inclinado 5−6 gotas del reactivo y se mueve el tubo suavemente
para extenderlo.
1.− Si la prueba es POSITIVA: aparece un color verde sobre la superficie.
2.− Si la prueba es NEGATIVA: se queda del color del Cloruro Férrico, es decir, amarillo.
CARACTERISTICAS DE BACTERIAS PATOGENAS
A continuación se precisan algunas características clínicas y de cultivo de las bacterias reconocidas como
entero patógenas y se discuten las de alguna cuya etiología es dudosa.
Salmonella : Las últimas tendencias en taxonomía aceptan el establecimiento de una sola especie de
Salmonella. Le Minor, en la última edición de «EI Manual de Bergey» (1984), propone como única especie a
Salmonella Choleraesuis subdividida en seis subespecies.
En el XIV Congreso Internacional de Microbiología celebrado en Manchester (1986), el Comité Internacional
de Sistemática Bacteriana a través del Subcomité Internacional de Enterobacteriaceae , ha decidido modificar
el nombre de Salmonella Choleraesuis , propuesto por Le Minor, por el de Salmonella enterica , quedando los
gérmenes conocidos tradicionalmente como S. Enteritidis , S. typhimurium, S. dublin, etc., en la categoría de
serotipo, biotipo o bioserotipo dentro de su correspondiente subespecie (datos facilitados por el doctor Usera.
Majadahonda).
De forma general se podría decir que la Salmonella produce dos cuadros clínicos muy diferenciados, y que en
ambos casos puede hacerse el diagnóstico a partir del coprocultivo.
Estos dos cuadros son la fiebre tifoidea y la salmonelosis gastrointestinal. El primero está producido por
Salmonella Typhi y con menos frecuencia por Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi B. El segundo
está causado por otros serotipos como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Cholerae
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suis, etc. En contra de esta clara diferenciación, aceptada por todos, hay autores que señalan que pierde valor
cuando se trata de niños, y que en ellos cualquier Salmonella puede producir los dos síndromes.
El diagnóstico de la fiebre tifoidea puede hacerse por métodos directos y por métodos indirectos. Los
primeros son aquellos que permiten aislar el microorganismo, como son: el hemocultivo y el coprocultivo. A
veces, aunque es raro, se puede aislar también el germen de la orina.
Los métodos indirectos son aquellos que ponen de manifiesto la acción del germen sobre el organismo, es
decir, demuestran la presencia de anticuerpos específicos contra el agente etiológico.
En este punto se podría cuestionar ¿qué métodos son mejores? ¿cuáles ayudan más a hacer el diagnóstico? La
respuesta sería que todo depende del momento en que se halle la infección, del tiempo transcurrido desde el
comienzo de la enfermedad.
− El hemocultivo presenta un máximo de positividad durante la primera semana. − El coprocultivo permite
aislar con un 30−50 por 100 de posibilidad Salmonella durante todo el transcurso de la enfermedad, siempre y
cuando el paciente no esté bajo tratamiento, aunque el máximo de positividad se obtiene durante la segunda
semana de evolución.
Las técnicas indirectas, es decir, las serológicas, y, concretando más, las de aglutinación, tienen un máximo de
efectividad a partir de las dos−tres semanas de evolución.
Para aislar Salmonella, las siembras de las heces se efectuarán sobre medios de enriquecimiento (Selenito de
Leifson, tetrationato de Kauffman, GN de Hajna, etcétera), y al mismo tiempo sobre medios selectivos (SS,
Wilson Blair, desoxicolato citrato, Hektoen, etc.), resembrando a las doce−dieciséis horas de incubación un
asa de las primeras en una placa de estos últimos. Con las colonias sospechosas se realizarán pruebas de
identificación.
En el otro síndrome clínico, es decir, la infección gastrointestinal, el coprocultivo es a menudo el único
método que permite demostrar la etiología. El hemocultivo es sólo efectivo en algunas ocasiones.
Shigella : Existen cuatro grupos de Shigella, representados respectivamente por Sh. dysenteriae, Sh. sonnei,
Sh. flexneri, y Sh. boydii. Hoy en día se está intentando una tipificación por colicinotipia, es decir, por la
susceptibilidad a las colicinas.
La Shigella es un germen muy lábil y que resiste muy poco tiempo en las heces del organismo humano, a esto
se debe la necesidad de sembrar lo antes posible las muestras sospechosas de contener Shigella. Incluso hay
autores que recomiendan hacerlo en la misma habitación del paciente.
El medio de cultivo más utilizado es el selectivo llamado SS, o Salmonella−Shigella, que se siembra con ún
inóculo abundante.
La Shigella es productora de la disentería bacteriana, y de muchas colitis en verano. A pesar de ser la
responsable de las citadas enfermedades, en la actualidad la tendencia es no tratar las infecciones debidas a
este microorganismo. En España no es frecuente la Sh. dysenteriae, siendo la más común Sh. sonnei.
Muchos autores están de acuerdo en considerar que la Shigella causante de gastroenteritis bacteriana es
eliminada por el efecto de arrastre de la diarrea, y por otro lado, su condición lábil les hace sensibles al resto
de la flora bacteriana intestinal. Estos motivos justifican según los citados autores, la no utilización de
antibióticos, que actuarían sobre la mayoría de gérmenes intestinales, eliminando la competencia,
favoreciendo la aparición de resistencias y alargando el período de convalecencia. Esto transformaría al
paciente en portador crónico.
Precisamente fue en una Shigella, donde Watanabe, un investigador japonés, descubrió el fenómeno de la
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conjugación bacteriana, al comprobar la transmisión de trozos de DNA llamados plásmidos, de una bacteria a
otra, a través de un canal protoplasmático que les conecta. Si en este trozo de cromosoma está codificada la
resistencia a un antibiótico, o a un determinado grupo de antibióticos, la bacteria receptora se volverá, al igual
que la donadora, insensible a los citados fármacos.
De todas maneras, la cuestión de no establecer tratamiento es difícil para aquellos clínicos que están en
contacto con los pacientes, sobre todo si éstos son niños.
Según la misma idea antes aportada, tampoco sería correcto dar antidiarreicos, porque ello evita la expulsión
de los gérmenes patógenos, los cuales, al quedar retenidos al abrigo intestinal aumentarán cuantitativamente,
incrementando su agresividad sobre el tracto intestinal. En este punto es también necesario evaluar la
necesidad de anteponer al citado efecto infeccioso, el hecho de evitar una deshidratación en el niño pequeño.
Vibrio : Hay varias especies del género Vibrio que son responsables de distorsiones intestinales. La más
importante, Vibrio cholerae, produce su efecto gracias a una toxina muy semejante a la del E. coli entero
patógeno. En los casos típicos, las heces presentan un aspecto conocido como agua de arroz, debido a su color
blanco y consistencia líquida, con grumos que contienen gran cantidad de pequeños bacilos Gram. negativos
ligeramente curvados.
El aislamiento de las heces se hace utilizando medios selectivos, como el agua de peptona alcalina (pH 8,4), o
el de Nakanishi modificado o TCBS, a base de tiosulfato, citrato, bilis y sacarosa.
Otros vibrios semejantes al Vibrio cholerae, como su biotipo El Tor, y los vibrios NAG o no aglutinables,
fabrican de igual forma la citada entero toxina, poseyendo estos últimos también un cierto efecto invasor del
tejido intestinal.
Si los vibrios NAG se encuentran principalmente en aguas dulces, el Vibrio parahaemolyticus vive en el agua
del mar, dándose cada vez con mayor frecuencia cuadros de gastroenteritis transmitidos a partir de los
llamados frutos del mar (mariscos y pescados poco cocidos).
Yersinia : Es otro miembro de la familia Enterobacteriaceae que suele producir trastornos intestinales. De sus
tres especies, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudo tuberculosis y Yersinia pestis, sólo las dos primeras
están implicadas en los citados procesos, especialmente la inicial. La Yersinia pseudo tuberculosis se incluye,
pues ha sido asociada últimamente en Rusia con cuadros entéricos, cuadros que ellos califican como fiebre
escarlatinosa del Lejano Oriente.
La Yersinia enterocolitica produce gastroenteritis aguda, caracterizada por fiebre, cefaleas, dolores
abdominales agudos y diarrea líquida. También se ha implicado con otras afecciones abdominales con dolor,
que se localiza en la fosa iliaca derecha, y que hace pensar en una apendicitis. Se trata de la linfoadenitis
mesentérica aguda benigna, que no acostumbra a evolucionar con diarrea, y la única forma de hacer el
diagnóstico es a partir de los ganglios.
La Yersinia enterocolitica crece bien en medios ordinarios como el agar SS o el agar desoxicolato. Aunque las
colonias aparecen a las cuarenta y ocho−setenta y dos horas, su pequeñez y poca proporción en ocasiones les
hace pasar desapercibidas. Para facilitar su aislamiento se utilizan medios selectivo como el Drigalski
Norwegian medium, el Oxalate «Y» médium, o el Wauters, y como enriquecimiento se usa el enfriamiento a
4° C durante tres semanas en Selenito o BHI. Lógicamente, los diagnósticos hechos con estos procesos de
enriquecimiento no son válidos para implantar un tratamiento clínico, pero sí para estudios epidemiológicos.
Hasta ahora no se han comercializado sueros anti−Yersinia que permitan confirmar la identificación
bioquímica. Los laboratorios que quieran efectuar esta comprobación, pueden mandar las cepas a laboratorios
de referencia.
Indirectamente puede hacerse el diagnóstico enfrentando suero del paciente con una mezcla polivalente, o,
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cuando menos, que contenga los serotipos 3 y 9. Títulos iguales o superiores a 1/160 son significativos.
Escherichia coli : Gracias a los trabajos empezados por Kauffmann, y sobre la base de 157 antígenos
somáticos (0), 93 capsulares (K) y 52 flagelares (H) de los que hay tres variedades (L, A y B), es posible
identificar serológicamente a E. coli.
Esta determinación serológica, en la práctica diaria de los laboratorios de microbiología, sólo se realiza para la
investigación de una serie de Escherichia coli denominados entero patógenos, y cuya patología parece
reducirse a gastroenteritis infantiles en niños menores de dos años y medio.
Ahora bien, en la actualidad se duda de su verdadera intervención, pues es posible aislarlos de muchas heces
infantiles que no tienen síntomas de gastroenteritis. Nuestra opinión es que sólo es valorable en caso de
epidemias en las que se aísle un solo serotipo. En casos aislados sólo podremos imputarle con seguridad la
etiología del proceso si comprobamos su capacidad entero patogénica. E. coli entero patógeno puede efectuar
de dos maneras su acción intestinal, una produciendo entero toxinas, de las cuales se conocen dos (ST o
estable al calor y LT o lábil al calor, que es parecida antigénicamente a la entero toxina de V. cholerae ) y otra
por la invasión de las células epiteliales del intestino, produciendo un cuadro disenteriforme, denominándose
respectivamente E. coli enterotoxigénico y E. coli enteroinvasivo.
La capacidad entero tóxica por producción de LT se investiga inoculando extracto bruto del cultivo sobre
células Vero y observando cambios celulares debidos a alteraciones del contenido en AMP cíclico.
La capacidad entero tóxica por ST se demuestra inoculando extracto bruto de su cultivo en ratones lactantes
de uno a tres días.
La propiedad enteroinvasiva se pone de manifiesto por el test de Anton, inoculando 10 e8 células bacterianas
en el saco conjuntival de cobayas, y observando, en caso positivo a las veinticuatro−cuarenta y ocho horas, la
producción de una inflamación corneo−conjuntival.
Como se comprenderá, estas técnicas generalmente no están al alcance de laboratorios pluridisciplinarios, por
lo que es aconsejable mandar la cepa a laboratorios especializados para que hagan su estudio, hecho que, por
otro lado, no solucionará el problema, ya que cuando se consiga el resultado, el paciente probablemente estará
ya curado.
Por otro lado es difícil establecer una relación entre enteropatogenicidad y serotipo de E. Coli, ya que los
factores entero patogénicos conocidos hasta ahora: capacidad de producir entero toxinas (ST y LT) e invadir
la mucosa intestinal, dependen de plásmidos independientes del material genético que codifica su estructura
antigénica. En consecuencia, sería necesario estudiar, por un lado, la capacidad entero patogénica, por otro
lado, el serotipo y, finalmente, la presencia del plásmido «ent».
Anaerobios esporulados : Los anaerobios esporulados no suelen producir infecciones gastrointestinales, y en
la literatura sólo se cita con escasa frecuencia la presencia de Clostridium perfringens causante de
intoxicaciones alimentarias. También se han mencionado casos de colitis pseudo membranosa debidos a
Clostridium difficile.
Otros microorganismos que con menor frecuencia se consideran responsables de gastroenteritis son los
siguientes:
Cándida : sobre todo Cándida albicans, que es aislada mayoritariamente de heces patológicas de niños
pequeños. En ocasiones es posible su hallazgo en el contenido fecal de adultos con trastornos intestinales
recién llegados de patses del Medio y Lejano Oriente (Egipto, India, etcétera).
Pseudomonas : Frecuente en personas tratadas largo tiempo con antibióticos de amplio espectro.
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Staphylococcus aureus : Su presencia es favorecida también por terapia con antibióticos de amplio espectro.
Además de este efecto por sobrecrecimiento, son muy frecuentes las intoxicaciones alimentarias por la entero
toxina, producida por el microorganismo.
Campylobacter : Desde hace algún tiempo se reconoce a Campylobacter jejuni como el patógeno intestinal
con mayor morbilidad. Generalmente afecta a niños pequeños, a los que produce diarrea, dolores
abdominales, fiebre, náuseas y a veces vómitos.
La fuente de infección suele ser el agua, o, más frecuentemente, los alimentos de origen animal. También se
encuentra en abundancia en las heces de animales domésticos.
El desarrollo de su patología no está bien definido, ya que mientras que, por un lado, produce manifestaciones
enteroinvasivas (con producción de sangre y leucocitos), por otro, hay constancia de que libera una entero
toxina similar a la de Vibrio cholerae y E. coli enterotoxigénico.
Para el diagnóstico microbiológico, la siembra de las heces debe hacerse muy rápidamente, preferiblemente
antes de dos horas. En caso de no ser posible, se incluirá la muestra en un medio de transporte adecuado (el
mejor es el de Cary−Blair).
Para el cultivo de Campylobacter se precisan unas condiciones especiales, que son: disponer de un medio
selectivo, temperatura de incubación de 42−43° C y atmósfera microaerofílica (reducida de oxígeno) con C02.
Hay varios medios de cultivo selectivos apropiados, la mayoría de ellos comercializados, como el Skirrow, el
Butzler o el Campy BAP, no siendo necesario utilizar ningún medio de enriquecimiento previo.
La incubación a 42−43° C se realiza por espacio de cuarenta y ocho−setenta y dos horas en una atmósfera que
contiene un 5 por 100 de 02, 10 por 100 de C02 y 85 por 100 de N2. Hay casas comerciales que preparan
sobres generadores de este tipo de atmósfera. Las placas pueden incluirse dentro de jarras de anaerobiosis,
donde se incorporan también estos sobres.
Con las colonias sospechosas crecidas en los medios antes mencionados, se efectúa una identificación
presuntiva, observando su morfología vacilar Gram. negativa en espiral (es mejor usar como colorante de
contraste fucsina fenicada al 0,3 por 100), su movilidad característica y la capacidad de dar positiva la prueba
de la oxidasa.
Se puede completar la determinación con una batería de pruebas bioquímicas, de las cuales destacamos la
catalasa, la reducción de nitratos, la producción de SH2 y la hidrólisis del hipurato.
Aeromonas : Aeromonas hydrophila se aísla con relativa frecuencia de heces diarreicas, habiéndose
comprobado su capacidad entero tóxica y enteroinvasiva. Hay autores que también implican en estos procesos
a Pleciomonas shigelloides.
Otros entero patógenos son Edwarsiella, Streptococcus faecalis variedad liquefaciens, que produce
toxiinfección, y Bacillus cereus, que da lugar a intoxicaciones.
ESTUDIO DELOS DIFERENTES AGENTES PATOGENOS INTESTINALES
GENERO : CAMPYLOBACTER
Son pequeños bacilos Gram− que tienen forma de coma, forma espiral y, en ocasiones, también se les puede
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observar en forma de S. Son microaerofílicos, móviles por un único flagelo polar y no esporulados. No
fermentan carbohidratos y dan positiva la prueba de la Oxidasa y la Catalasa.
Campylobacter suele encontrarse en el tracto gastrointestinal de un gran número de animales y en el hombre
producen infecciones gastrointestinales. También se les asocia, aunque en menor grado a infecciones
extraintestinales, sobre todo en pacientes con SIDA.
ESPECIES CLÍNICAS
Las más importantes para el hombre, y que son agentes etiológicos de la diarrea son:
• Campylobacter jejuni
• Campylobacter coli
• Campylobacter laridis
El Campylobacter fetus subespecie fetus produce cuadros de septicemia en pacientes con un sistema
inmunitario deficiente.
Aislamiento a partir de muestras clínicas
Cuando se trata de un aislamiento a partir de heces es recomendable hacer el análisis lo más pronto posible. Si
se va a retrasar, es necesario usar un medio de transporte: Cary Blair ó Campy−Thio, en los cuales se
mantiene de 1 a 2 semanas a 4ºC.
Las condiciones bajo las cuales deben realizarse los cultivos son:
• Utilizar medios de cultivo selectivos para estos microorganismos.
• Temperatura de incubación de 41ºC (porque los más importantes son termofílicos).
• Condiciones reducidas de Oxígeno (microaerofílicos).
•
Medios Selectivos
• Skirrow
• Campy−BAP
• Butzler
Generalmente no se suelen usar medios de enriquecimiento cuando la muestra procede de heces. Sí es útil en
aquellos casos en que está disminuido el número de bacterias por haber permanecido las heces durante un
tiempo a temperatura ambiente.
También es importante usar un medio de enriquecimiento cuando la muestra procede de personas que están en
tratamiento o en portadores.
Incubación
Se deben incubar a 42ºC durante unas 72 horas, en el caso de Campylobacter jejuni y C.coli. De esta forma
eliminamos la flora acompañante.
Para otras especies de Campylobacter:
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• Utilizar medios selectivos sin cefaloesporinas
• Incubación a 37ºC durante 7 días en atmósfera microaerofílica.
Métodos alternativos para el aislamiento de Campylobacter en heces
ð Filtrar las heces (eliminamos coliformes y flora contaminante), diluir y se siembra en un medio NO
selectivo. Se incuba a 42ºC en ambiente microaerofílico.
ð Colocar directamente el filtro sobre la superficie del agar. Echar 1 o 2 gotas de las heces sobre el filtro.
Hacer una primera incubación, retirar el filtro y volver a reincubar.
Aislamiento de Campylobacter a partir de muestras de sangre
Se aíslan en sangre: C. fetus, C. jejuni, C. laridis y otros que generalmente pueden aislarse en sangre como
agentes etiológicos de sepsis en pacientes con el sistema inmunitario deprimido o en enfermos de SIDA.
Aunque la mayoría crecen bien en medios con sangre, tienen el inconveniente de que tardan hasta 2 semanas
en desarrollarse en estos medios. Es preferible realizar un cultivo en medios líquidos y, a partir de estos,
realizar subcultivos en medios sólidos, en ambiente microaerofílico y a una temperatura de 37ºC.
IDENTIFICACIÓN
La identificación cuando se sospecha la presencia del Campylobacter consiste en una TINCIÓN DE GRAM,
en la cual se observan como bacilos Gram− que pueden adoptar una forma de S, aunque cuando la tinción de
Gram se realiza a partir de cultivos viejos pueden perder esta morfología.
También se puede hacer un MONTAJE EN FRESCO para observar la movilidad; las pruebas de la
OXIDASA y la CATALASA darán positivas y, para la diferenciación entre especies se pueden realizar las
siguientes pruebas:
• Crecimiento a distintas temperaturas
• Sensibilidad que presentan al ácido nalidixico y cefalotina
• Producción de SH2 en Agar Hierro de Kliger
• Reducción de Nitratos
Además de estas pruebas también se puede realizar la SEROTIPIFICACIÓN mediante técnicas de
Hemaglutinación Indirecta y Técnicas de Aglutinación en portaobjetos.
PATOGENIA. PATOLOGÍA
El que tiene mayor importancia desde el punto de vista clínico es el C. jejuni:
Campylobacter jejuni da lugar a gastroenteritis que se manifiesta con un cuadro diarreico y, en ocasiones
puede observarse la presencia de sangre en heces. Este m.o se adquiere generalmente por vía oral como
consecuencia de la ingesta de alimentos o bebidas contaminadas. También se puede producir por contacto con
animales infectados.
C. jejuni es un m.o muy sensible al pH ácido del estómago por lo que debe ingerirse un elevado número de
m.o para que se produzca la infección.
23
Se multiplica en el intestino delgado, invade el epitelio y produce inflamación. En ocasiones también puede
pasar al torrente circulatorio y desarrollar un cuadro de fiebre entérica. La diarrea que produce suele
acompañarse de dolor abdominal, cefalea y fiebre.
Campylobacter coli y Campylobacter laridis producen una infección gastrointestinal similar a la producida
por C. jejuni.
Campylobacter fetus y C. upsaliensis producen cuadros diarreicos en individuos normales y pueden
ocasionar bacteriemia en pacientes con el sistema inmunitario deprimido.
HELICOBACTER PYLORI
Se aísla en el estómago de pacientes con lesiones gástricas y úlcera gástrica. Es un bacilo Gram− con forma
espiral y con una gran actividad ureasa. Es un m.o móvil y el interés en él reside en que se le considera como
un importante factor de lesiones gástricas.
DETECCIÓN
Se pueden realizar MÉTODOS DIRECTOS dado que este m.o se localiza preferentemente en los pliegues de
la mucosa del estómago. Las pruebas más idóneas para el aislamiento del mismo serán las biopsias de las
zonas lesionadas (IMP: Las muestras deben proceder de Biopsias, NO de aspirados gástricos). Cuanto mayor
sea el número de biopsias que se realicen, mas posibilidades habrá de conseguir el aislamiento de este m.o.
Las muestras procedentes de biopsias deben enviarse directamente al laboratorio para proceder a su cultivo y,
si esto no fuese posible, es necesario utilizar un medio de transporte: Solución glucosada al 20%; Solución
Salina o Caldo Tioglicolato. En estos medios de transporte, el microorganismo se mantiene viable durante
aproximadamente 5 horas si la temperatura de conservación es de 4ºC.
De las biopsias, una parte se utiliza para la realización de un frotis (TINCIÓN DE GRAM ó GIEMSA). En la
tinción de Gram se observan bacilos Gram− con forma de espiral o una forma característica denominada
forma de U o de Arnés de bueyes.
El resto de la muestra de la biopsia se trocea o machaca en un mortero estéril y posteriormente se siembra.
Además de las tinciones también se pueden realizar PRUEBAS BIOQUÍMICAS como la prueba de
Reducción de Nitratos y la prueba de la Ureasa:
• Prueba Rápida: se realiza a partir de la muestra de la biopsia que se inocula en un medio para la
determinación de urea, como por ejemplo, Caldo de Urea o Cristensen. Evidencia, cuando es positiva,
que puede tratarse de H. Pylori.
• Prueba de la Urea Respiratoria: el paciente ingiere una urea marcada y tras un período determinado
de tiempo se mide el nivel de CO2 espirado.
Además de estos métodos también se utilizan los MÉTODOS SEROLÓGICOS que utilizan técnicas de
ELISA con las que pueden ponerse de manifiesto la presencia de IgG e IgA.
MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo utilizados para el aislamiento de Campylobacter procedente de estas biopsias son:
• Agar Mueller−Hinton con 5% de sangre de carnero
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• Agar Brucella con 1% de almidón soluble
• Agar sangre−chocolate−Skirrow−Thayer Martín, siempre que estén suplementados o bien con suero o
bien con almidón.
Además de estos medios se pueden usar medios SELECTIVOS que incorporan antibióticos con el fin de
inhibir la flora acompañante:
• Medio selectivo para Helicobacter pylori
• Medio Belo Horizonte
La temperatura óptima de crecimiento es de 37ºC, en ambiente microaerofílico, y la incubación debe
mantenerse al menos durante 7 días cuando se trata de aislamiento primario.
FACTORES DE PATOGENICIDAD
• Producción de Ureasa Crea un ambiente alcalino (CO2 y NH3) que le protege de la acidez gástrica.
• Proteasas Modifica el pH gástrico de la mucosa.
• Hemaglutininas Se adhieren a las células epiteliales.
• Citotoxinas (no tienen un papel determinado).
PATOLOGÍA
• Gastritis aguda
• Úlceras pépticas: H. Pylori se ha aislado en el 100% de los enfermos que padecen úlcera duodenal y
en un 80% de los enfermos que padecen una úlcera gástrica.
PSEUDOMONAS
Las especies de este género son bacilos Gram−, aerobios estrictos, Oxidasa+ y móviles por un flagelo polar.
No fermentan ningún tipo de carbohidrato pero pueden utilizar los azúcares por metabolismo oxidativo.
• Pseudomona aeruginosa
Es un m.o que crece bien en la mayor parte de los medio habituales de laboratorio, entre ellos MacConkey y
Levine. No fermenta ningún carbohidrato y es capaz de crecer a temperaturas de 42ºC.
En Agar Sangre da lugar a colonias de morfología variable, en ocasiones ð−hemolíticas y con un olor
característico a fruta. Elabora pigmentos hidrosolubles que colorean el agar como la piocianina de color azul,
pioverdina de color verde y piorrubina de color rojo. Es la única especie que produce piocianina, característica
que se puede utilizar para su identificación. La producción de pigmentos se puede potenciar recurriendo a
medios especiales como, por ejemplo, el King A y el King B.
Además existen medios selectivos para el aislamiento de P.aeruginosa a partir de muestras contaminadas
como heces y esputo como son el Agar Cetrimida y el Agar Irgarsen.
IDENTIFICACIÓN DE LA P.AERUGINOSA
Las características que ayudan a la identificación de P.aeruginosa son:
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− Crecimiento en la mayor parte de los medios de cultivo
− En Agar Sangre dan colonias azul−verdosas con olor afrutado
− Catalasa y Oxidasa+
− Reducción de Nitratos
− Crecimiento a 42ºC
− En Agar de Kligler produce un crecimiento en superficie sin viraje del medio
− Oxidación de Glucosa en un medio de Oxidación−Fermentación.
− Hidrólisis de Arginina
− No decarboxilan ni Lisina ni Ornitina
− Tolerancia a la Cetrimida
PATOGENICIDAD Y PATOLOGÍA DE LA P.AERUGINOSA
La P.aeruginosa posee un gran número de factores de virulencia que se encuentran implicados en los
mecanismos de patogenicidad del m.o, entre ellos fimbrias, que permiten su adherencia a células epiteliales;
cápsula polisacárida, que le protege de la fagocitosis; enzimas extracelulares, como proteasas, hemolisinas y
coagulasas; y endo y exotoxinas.
Posee además, la capacidad de sobrevivir en medios con bajo contenido en nutrientes, especialmente en
ambientes húmedos, de forma que se ha llegado a aislar en agua destilada y soluciones desinfectantes.
P.aeruginosa se haya implicada en un gran número de procesos infecciosos aunque siempre como patógeno
oportunista y en pacientes con algún tipo de alteración en su inmunidad. Es causante de infecciones
nosocomiales. Puede producir también infecciones oculares asociadas al uso de lentes de contacto, otitis
media en nadadores y, en ocasiones, puede producir septicemias.
• Pseudomona mallei y Pseudomona pseudomallei
Son las únicas especies del grupo consideradas como verdaderos patógenos.
P.mallei es el agente etiológico del Muermo, enfermedad que se transmite al hombre a través del ganado
equino. A deferencia del resto de las especies del género, no habita ni en el agua ni en el suelo, sino que se
encuentra perfectamente adaptada al hombre y animales a quien parasita.
P.pseudomallei es de vida libre y se encuentra en el agua y en el suelo. Es el agente etiológico de la
Meliovidosis, una infección rara en nuestro medio y que se manifiesta de diversas formas, como infección
pulmonar, abscesos, septicemia, etc. En el laboratorio crece en agar sangre dando colonias umbilicadas, de
crecimiento lento y con una zona de hemólisis alrededor. Puede crecer en Agar MacConkey y a temperaturas
de 42ºC.
• Otras Pseudomonas
− P.cepaia: produce fibrosis quística
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− P.fluorescens, P.pútida, P.putrefaciens y P.alcaligenes: se suelen aislar como agentes infecciosos en
pacientes cuyas defensas se encuentran comprometidas.
GENERO : ACINETOBACTER
Este género engloba m.o que se encuentran habitualmente en el suelo y en el agua. Se puede hallar presentes
en ambientes hospitalarios, donde producen infecciones en pacientes con las defensas disminuidas.
Dos especies son las que se aíslan con más frecuencia:
• A.calcoaceticus−subespecie anitratus
• A.calcoaceticus−subespecie Iwoffi
Estos m.o se han aislado en pacientes con neumonía, infección urinaria y sepsis. En el laboratorio crecen en
Agar MacConkey y en Agar Sangre donde dan colonias grises rodeadas de una zona de hemólisis.
Se diferencian de las Pseudomonas porque dan negativa la prueba de la Oxidasa, son Catalasa+ y no reducen
los Nitratos.
Al microscopio se observan como bacilos Gram− que, en ocasiones, pueden confundirse con las Neisserias.
ENERO :BRUCELLA
Son Coco−Bacilos, Gram−, inmóviles, no esporulados y aerobios estrictos. Algunas especies de Brucellas
pueden presentar cápsula.
Al microscopio se observan agrupados en parejas o formando cadenas cortas. La temperatura óptima de
crecimiento es de 35−37ºC.
Son Catalasa+. La mayor parte de las Brucellas dan positiva la prueba de la Oxidasa y reducen los Nitratos a
Nitritos.
Las especies de Brucellas son parásitos obligados de animales y, algunos de ellos, producen infección en el
hombre.
DIAGNÓSTICO A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS
1 Examen Directo: El examen de la muestra, previa tinción de Gram, ofrece pocos resultados, debido al
escaso numero de m.o que puede contener. La técnica del Ac fluorescente directo, que emplea Ac
anti−Brucella marcados con fluoresceína, proporciona mejores resultados que la tinción de Gram.
Las tinciones ofrecen un diagnóstico de presunción que no es definitivo por lo que siempre hay que realizar el
cultivo de las muestras.
2 Aislamiento de la Brucella. Medios de cultivo: realizamos el aislamiento cuando no se puede realizar la
identificación directamente de la muestra clínica.
Las Brucellas son m.o intracelulares, por lo que necesitan requerimientos nutricionales complejos.
El cultivo se realizará, por lo tanto, en medios enriquecidos, aunque hay Brucellas que se pueden desarrollar
en medios generales como Agar Sangre y Agar Chocolate:
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• Medios de cultivo Líquidos: Caldo Brucella.
• Medios de cultivo Sólidos: Agar Brucella complementado con suero o glicerina.
• Medios de cultivo Selectivos: Medio de Farell; Medio modificado de Thayer−Martin.
A todos los enfermos sospechosos de infección por Brucellas se les debe realizar un hemocultivo.
3 Identificación de Brucellas
Basada en la Morfología de las colonias:
− Lisas y transparentes: están relacionadas con la presencia de cepas virulentas. Presenta tanto la parte lipídica
A como la parte polisacárida O.
− Rugosas: están relacionadas con cepas avirulentas. Sólo poseen la parte lipídica A, y si poseen la parte
polisacárida, ésta es defectuosa, por lo que no se consideran
virulentas otra forma de diferenciar las formas virulentas de las avirulentas es sembrar en un medio Agar
Glucosa Glicerol. Una vez incubada la placa inundamos la superficie de la placa con una solución de cristal
violeta y observamos con una luz oblicua. Las colonias lisas se observarán de un azul verdoso, mientras que
las colonias rugosas se observarán de un azul rojizo o violeta rojizo.
Tinción de Gram:
Las Brucellas aparecen como coco−bacilos Gram− que se tiñen débilmente con el colorante de contraste, por
lo que es necesario mantener la acción del colorante de contraste (Safranina) por lo menos durante 3 minutos.
Es conveniente, antes de hacer la tinción de Gram, que si se sospecha la presencia de Brucellas, hagamos una
suspensión de una colonia en una solución salina fenicada al 1%, para evitar riesgos.
Pruebas Bioquímicas:
Son Catalasa+, la mayoría dan positiva la prueba de la Oxidasa, son Ureasa+, reducen los Nitratos a Nitritos y
no fermentan la Glucosa ni la Lactosa.
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO: (diagnóstico indirecto)
• Prueba de la Rosa de Bengala
• Aglutinación en tubo
• Prueba de antiglobulina para Brucella (Coombs indirecto)
La Prueba de la Rosa de Bengala y la aglutinación en tubo se realizan de la misma forma. Son pruebas de
aglutinación que se realizan con una suspensión de Brucellas a pH = 3,6. Para la prueba se preparan una serie
de diluciones:
Dilución 1/2 :100ðL de suero problema + 100ðL solución salina
Dilución 1/4 : 100ðL dilución anterior + 100ðL solución salina
Dilución 1/8: 100ðL dilución anterior + 100ðL solución salina
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.etc.
Una vez hechas las diluciones, colocamos 50ðL de las mismas en un porta y le añadimos 1 gota de la
suspensión de Brucellas.
Primero se detecta la presencia de la Brucella y después se realiza la cuantificación de la misma. Para que la
prueba se positivice, el paciente debe tener una concentración de Ac en suero de 25 UI/mL o superior. Para
conocer este dato calculamos el título:
TÍTULO = 25 UI/mL x Inversa de la Dilución
Las pruebas se deben repetir a los 15 días después de la seroconversión:
• Siempre que aumenta el título de Ac de una fase a otra significa que se encuentra en una fase aguda.
• Si el título se mantiene, pueden darse dos situaciones:
− Que se trate de Ac residuales
− Que se trate de una infección crónica
La Prueba de la antiglobulina para Brucella ó Coombs indirecto sirve para detectar Ac bloqueantes (IgA,
que se encuentran en las mucosas)
Enfrentamos el suero de paciente con la solución de brucellas e incubamos. El Ac bloqueante se une al Ag,
pero no produce la aglutinación. Para saber si realmente existe el Ac bloqueante o simplemente es que no
existe, añadimos la antiglobulina humana o suero de Coombs.
Si se produce la aglutinación significará que en el suero del paciente existía el Ac bloqueante, ya que la
antiglobulina humana se ha unido a este Ac y ha aglutinado.
Si no se produce la aglutinación significa que no existía Ac en el suero del paciente.
EPIDEMIOLOGÍA DE LAS BRUCELLAS
Las principales especies de Brucella con importancia patológica son:
• B. melitensis: produce la mayor parte de los casos de Brucelosis que se producen en España.
• B. abortus: producen una infección más leve que la melitensis. A veces cursa de forma asintomática
y es la causante de muchos de los abortos espontáneos que se dan en los animales.
• B. suis: suele afectar al ganado porcino pero tiene menos importancia desde el punto de vista clínico.
La Brucelosis es una antropozoonosis, es decir, que afecta a los animales de forma primaria y pueden
transmitirse al hombre. La infección puede producirse tanto por:
• Contagio Directo: se puede producir como consecuencia de un contacto con animales infectados o
bien por inhalación de aerosoles, o por contacto de productos infectados con las mucosas.
• Contagio Indirecto: se produce como consecuencia de ingestión de leche y sus derivados que no han
sido pasteurizado.
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Es importante destacar el peligro que supone para el personal sanitario la manipulación de muestras
sospechosas de Brucelosis ya que es fácil que pueda producirse el contagio por contacto con piel y mucosas,
por inhalación de aerosoles y por accidentes como consecuencia de la manipulación de agujas contaminadas
en la realización de los hemocultivos.
PATOGENIA
Generalmente, las Brucellas tienen un período de incubación que puede oscilar entre 1−6 semanas. Durante
este período, las Brucellas se multiplican en el interior de las células del retículo endotelial y, de esta forma,
elude la respuesta inmune del huésped.
Pueden pasar a la sangre y diseminarse en los tejidos. Es frecuente que la infección se localice en algún
órgano, generalmente hígado y médula ósea.
ENTEROBACTERIAS.
Son bacilos Gram−; Catalasa+; Oxidasa−; anaerobios facultativos...
Fermentan la glucosa con producción de ácido, con ó sin gas.
La mayor parte reduce los nitratos a nitritos, pueden ser móviles o inmóviles. Cuando son móviles, la mayoría
presenta flagelos perítricos.
Están ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan tanto a plantas como animales y suelo, y en el
hombre se encuentran como flora comensal en el intestino. Son responsables de un gran número de
infecciones, siendo particularmente frecuente su aislamiento a partir de determinadas muestras clínicas. Son
responsables del 50% de los casos de septicemia; de 60−70% de los casos de enteritis bacteriana aguda y más
del 70% de los casos de infecciones del tracto urinario.
• ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
ð Ag somático O: se encuentra en la pared celular y tiene naturaleza polisacárida.
ð Ag capsular K: polisacárido o proteína.
ð Ag flagelar H: naturaleza proteica.
ð Endotoxinas.
ð Exotoxinas.
ð Colicitinas: Son bacteriocinas,. Son toxinas contra otras cepas de la misma o distinta especie.
ð AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Todas aquellas muestras clínicas en las que se sospecha la presencia de Enterobacterias, generalmente
procedentes de heridas, líquidos y exudados orgánicos, orina y hemocultivos, deben sembrarse en un medio
general (Agar sangre o chocolate) ó en un medio selectivo.
Si la muestra procede de heces o hisopos rectales, se utilizarán medios selectivos diferenciales ó caldos de
enriquecimiento.
30
• MEDIOS DE CULTIVO
En función del origen de la muestra, podemos utilizar distintos medios de cultivo. Los que se utilizan más
frecuentemente son:
ð Medios de cultivo poco selectivos:
− Agar Mc Conkey
− Agar EMB Levine
ð Caldo de crecimiento:
− Selenito−Salmonella
− Tetrationato−Salmonella−Shigella (Toxoinfecciones alimentarias)
ð Medios de cultivo de Selectividad media−alta:
− Agar enterico Hecktren
− Agar salmonella−Shigella
− Agar verde brillante (para todo tipo de Salmonellas, excepto la S. typhi)
• Agar bismuto sulfito (selectivo para S. typhi)
PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAS
ð Pruebas Bioquímicas.
ð Sistemas comerciales de identificación.
ð Identificación serológica: permite la identificación a nivel de género y especie.
• Diagnóstico inmunológico.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
AGAR HIERRO DE KLIGLER
Es una prueba diferencial y además se trata de una multiprueba. Se compone de dos hidratos de carbono
(Lactosa en un 1% y Glucosa en un 0,1%). La Glucosa se encuentra en menor cantidad para que se consuma
antes de las 24 horas de incubación y necesariamente las bacterias tengan que consumir las peptonas, con lo
que se produce amoníaco y se alcaliniza el medio.
1.− hay 3 formas básicas de fermentación en este medio de cultivo:
ð Que solamente se fermente la Glucosa: por principio, todas las enterobacterias fermentan la glucosa.
Cuando la glucosa se acaba y la bacteria no es capaz de utilizar la lactosa, se alimentará de las peptonas del
medio.
31
Método: la siembra se hace en profundidad (condiciones anaerobias) y en superficie (condiciones aerobias).
La muestra debe proceder de un medio de cultivo puro, se tomará una colonia con un hilo de siembra y se hará
la inoculación del medio de cultivo primero en profundidad, y segundo, según sacamos el asa, en superficie.
La lectura se realizará tras un tiempo de incubación de 24 horas (que se ha de cumplir a rajatabla) a 35−37ºC.
Resultados: Si se fermenta la Glucosa, se producen unos compuestos que acidifican el medio y, por lo tanto,
el medio virará a amarillo. Si además de la Glucosa utiliza las peptonas, que producen amoniaco, el medio se
alcaliniza y en lugar de virar a amarillo virará a rojo intenso. Esto último solo ocurre en la siembra que se ha
hecho en la superficie, es decir, que veremos la superficie roja y el fondo amarillo. Esto es así porque los
productos metabólicos son diferentes si la transformación es aeróbica o anaeróbica.
ð Que fermente tanto la Glucosa como la Lactosa: Se observará el medio totalmente amarillo, debido al pH
ácido.
ð Que no fermente ninguna: se alimenta desde el principio de las peptonas, por lo tanto podremos afirmar
que no se trata de una Enterobacteria. Se originarán una serie de productos alcalinos que virarán el medio a
rojo tanto en el fondo como en la superficie, siempre y cuando la bacteria sea capaz de consumir las peptonas
tanto en medio aerobio como anaerobio. Si la bacteria solo fuera capaz de utilizar las peptonas de forma
aerobia, la superficie aparecería roja, mientras que el fondo permanecería sin cambios.
2 Observación de la producción de gas (CO2 y H2): Si en el medio se forma alguno de estos gases, se
observarán algunos cambios en el medio de cultivo:
− Aparición de burbujas.
− Fracturas en el agar.
1.− Desplazamiento del medio de cultivo hacia la boca del mismo debido a una producción intensa de gas.
ð Observación de la producción de Sulfhídrico (SH2). Para que se produzca el SH2
ð Las condiciones han de ser ácidas
ð Se necesita una fuente que suministre el azufre (Tiosulfato de Sodio)
ð Se necesita un indicador que nos permita visualizarlo (Sal de hierro Citrato Férrico Amoniacal). Este
indicador hace que el SH2 precipite en forma de un precipitado negro. Si la cantidad precipitada es pequeña,
el precipitado se observará en la superficie del medio de cultivo. Si, por el contrario, la producción de SH2 es
muy intensa, toda la parte profunda del tubo se verá negra. Ahora bien, si todo el fondo se ve negro ¿cómo
sabremos el viraje del medio?. Pues bien, como para que se pueda producir el Sulfhídrico es necesario que se
den unas condiciones ácidas, deberemos suponer que el medio de cultivo habrá virado a amarillo en el fondo.
En la superficie si podremos diferencias entre el rojo y el amarillo sin ningún problema.
PRUEBA DE LA CATALASA
Definición: Es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas
(a excepción del Estreptococcus, por eso es una prueba que nos permite diferenciar entre Estafilococos y
Estreptococos).
Función: Descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2 o agua oxigenada) que se forma como producto
terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azúcares:
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2 H2O2 ððððð 2 H2O + O2 (gas)
Catalasa
Técnica: Consiste en recoger con el asa de siembra una colonia procedente de un cultivo puro, reciente y
colocarla sobre un portaobjetos. A continuación agregamos 1 gota de peróxido de hidrógeno al
30%(comercial) sobre el microorganismo con una pipeta Pasteur (no es necesario homogeneizar).
Resultados:
1 Si la prueba es POSITIVA: se formarán inmediatamente burbujas bien visibles.
2 Si la prueba es NEGATIVA: no se observará burbujeo.
Precauciones: es importante que la muestra no tenga su origen en un medio que contenga sangre, ya que
podríamos obtener falsos positivos.
PRUEBA DE LA OXIDASA O CITOCROMOOXIDASA
Principio: se basa en determinar la presencia de las enzimas oxidasas, las cuales catalizan la transferencia de
electrones desde el sustrato, que es generalmente orgánico, hasta el oxígeno.
Técnica: Se realizará según las instrucciones de la casa que nos proporcione el producto. Generalmente, en las
oxidasas positivas, se produce una reacción entre la enzima y un sustrato que está en la tira reactiva dando
lugar a un producto coloreado que suele ser el azul de indofenol. El reactivo puede variar de una casa
comercial a otra, así una prueba oxidasa+ se observará de un color que oscila entre el púrpura y el negro.
Precauciones: No tomar la muestra de medios coloreados.
PRUEBA DEL INDOL
Principio: se basa en determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el indol de la molécula de
triptófano, que es un aminoácido, que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar metabolitos
indólicos. A este grupo de enzimas, capaces de desdoblar el triptófano se les denomina triptofanasas.
Técnica: Se utiliza un caldo de triptona o de peptona (a veces también se utiliza un medio semisólido: medio
de S.I.M = Sulfhídrico; Indol; Movilidad). Se disponen 5 mL del medio en cada uno de los tubos que vayamos
a utilizar para la prueba, esterilizamos, inoculamos e incubamos (35−37ºC / 24h). Por último, para saber si se
ha producido el Indol añadimos 5 gotas del reactivo de Kovacs indol.
Resultados:
1 Si la prueba es POSITIVA: aparece un anillo rojo en la superficie del medio.
2 Si la prueba es NEGATIVA: permanece un color amarillo, que es el color del reactivo (el reactivo es un
aldehído)
PRUEBA DEL CITRATO
Principio: consiste en determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono
alcalinizando el medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado para observar la fermentación de citrato
contiene también sales de amonio inorgánicas. Un organismo que es capaz de utilizar el citrato como única
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fuente de carbono, utiliza también las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. Estas sales de amonio
se van a desdoblar en amoniaco produciendo la consiguiente alcalinidad. El medio utilizado es el Agar Citrato
de Simmons que lleva como indicador el azul de bromotimol (cuando el pH es alcalino vira a azul intenso,
mientras que el medio sin inocular tiene un color verde).
Técnica: Se utiliza un tubo inclinado. Hacemos la estría en superficie con un inóculo poco denso y lo
llevamos a incubar (35−37ºC / 24h)
Resultados:
1.− Si la prueba es POSITIVA: En la superficie del medio de cultivo se observa un viraje del verde a azul
intenso.
2.−Si la prueba es NEGATIVA: no se produce viraje, se queda verde.
PRUEBA DEL ROJO METILO−VOGES PROSKAUER (RM−VP)
INTRODUCCIÓN: Para el metabolismo de los Hidratos de Carbono se pueden dar varios procesos:
• Glucólisis: proceso de hidrólisis por el cual se transforma la glucosa en ácido pirúvico.
• Vías alternativas
− Pentosas fosfato: se puede usar al mismo tiempo que la Glucólisis o de forma independiente.
− Entner Douduroff: la utilizan algunas Enterobacterias sin necesidad de utilizar la Glucólisis y la vía de las
pentosas fosfato.
El ácido pirúvico puede usarse mediante:
ðVía aeróbica: Respiración.
ð El aceptor final de electrones es una molécula inorgánica (O2).
ð Como productos obtenemos CO2 y H2O
ð Empoacetilo + CoA ciclo de Krebs + cadena transportadora de e−
ðVía anaerobia: Fermentación.
ð El aceptor final de electrones es una molécula orgánica.
ð Es de menor rendimiento energético que la Glucólisis.
ð Puede ser de tres tipos:
ð Láctica
ð Alcohólica
ð Ácido mixta o del Grupo Califorme: tiene como productos:
− Ácidos mixtos: fórmico, acético, succínico, etílico... (RM+)
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− Butilenglicol ó Butanediol Acetoína (RM−)
ROJO DE METILO (RM)
Principio: Es una prueba que mide de forma cualitativa los productos ácidos que se originan por el
metabolismo de la Glucosa de forma que, cuando estos ácidos se producen en cantidad elevada, consiguen
superar el sistema amortiguador llevando el pH del medio hasta 4 − 4,5.
Técnica: Se siembra 1 tubo para la prueba RM y otro para la de VP para cada muestra. Se incuba a 30−37ºC
durante 48 horas a 4 días ó incluso 6 días, y finalizado el período de incubación le añadimos al tubo del RM
0,1−0,2 mL del reactivo Rojo de Metilo.
Resultados:
• Si la prueba es POSITIVA aparece coloración roja en la superficie de contacto del reactivo y del
medio de cultivo.
• Si la prueba es NEGATIVA se queda el color del medio (amarillo)
Precauciones:
Es importante incubar como mínimo 48 horas. Si se observa un color anaranjado hay que continuar con la
incubación hasta 4 días.
Si hacemos la lectura antes de las 48 horas todas las enterobacterias darán la prueba positiva, ya que todas
fermentan la glucosa.
Las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo positivas producen como consecuencia del metabolismo de
la glucosa unos productos ácidos en gran cantidad y estables. Trascurridas las 48 horas se añade el indicador.
En este caso, los ácidos habrán superado el sistema amortiguador del tampón (pH = 4 − 4,5), por el contrario,
las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo negativas también producen ácidos pero se producen en
menor cantidad, son menos estables, se produce mayor cantidad de CO2 y, además, se producen productos
como consecuencia de la degradación de las peptonas, con lo que el pH tiende a la neutralidad, es decir que
tiende a alcalinizarse.
VOGES−PROSKAUER
Principio: Es una prueba que pone de manifiesto un producto final neutro que es la Acetoína.
Técnica: Se inocula y se incuba durante 24 − 48 horas. Para poner de manifiesto la acetoína se utilizan 0,6
mL de ð−naftol al 5% (intensifica el color) y 0,2 mL de KOH ó NaOH al 40% (oxida la acetoína en diacetilo,
que es el producto coloreado junto con el alcali y las peptonas). Es importante que se añadan en este orden y
tienen que ser medidas exactas.
Resultados: Se realiza la lectura a los 10−15 min de la adición de los reactivos:
1.− Si la prueba es POSITIVA se observa un color rojo rosado en la superficie del medio.
2.− Si la prueba es NEGATIVA se observa un color amarillo en la superficie del medio
Precauciones:
Después de la incubación del reactivo es importante dejar destapado el tubo con el fin de que el O2 se ponga
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en contacto con los productos formados, de tal forma que se acelere la reacción.
En la mayoría de los casos, las enterobacterias que son RM+ son PV− y viceversa.
O.N.P.G ORTONITROFENOL ð−D−GALACTOPIRANÓSIDO
Principio: Es una prueba que pone de manifiesto la capacidad de un m.o de fermentar la Lactosa, demostrando
la presencia ó ausencia de la enzima ð−galactosidasa cuando se emplea un compuesto orgánico que es el
ONPG. Si en la célula bacteriana se encuentran enzimas para metabolizar la lactosa, el reactivo ONPG es
hidrolizado, liberando un compuesto amarillo (ortonitrofenol).
Estas enzimas son inducidas y están controladas genéticamente. Pueden disminuir o desaparecer después de
varias generaciones si el sustrato no está presente.
NOTA: las enzimas inducidas son aquellas que la bacteria produce exclusivamente cuando se encuentra el
sustrato sobre el que se va a ejercer su acción. Las enzimas constitutivas son aquellas que son producidas por
la bacteria independientemente de que el sustrato se encuentre o no en el medio de cultivo.
Para que se produzca la fermentación de la Lactosa, un microorganismo necesita 2 enzimas:
ððð ð − galactosidasa permeasa: Se encuentra en la membrana celular. Transporta la Lactosa al interior
celular.
ððð ð −D− galactosidasa: Hidroliza la Lactosa en el interior celular.
En función de que la bacteria tenga una, las dos o ninguna de las enzimas, podemos clasificarlas en:
ð Activas: Poseen las dos enzimas.
ð Retardadas: Carecen de la ð−galactosidasa permeasa y poseen la ð−D−galactosidasa. Tardan más tiempo
en degradas la Lactosa porque tienen que producir la permeasa.
ð No fermentadores: No poseen ninguna de las enzimas.
Técnica: Es necesario partir de un cultivo puro, reciente, preferiblemente obtenido a partir de un medio de
cultivo de Kligler. Tomaremos una cantidad espesa de inóculo para demostrar rápidamente la presencia de la
enzima.
A partir del cultivo preparamos una suspensión del microorganismo en un tubo de hemólisis con 0,5 mL de
agua destilada. Ponemos un disco de ONPG en el tubo y lo incubamos a 37ºC.
Resultados:
• Si la prueba es POSITIVA: en los 15−30 minutos posteriores a la adición del disco, el medio se habrá
vuelto amarillo.
• Si la prueba es NEGATIVA: habrá que esperar entre 2,3 o incluso 24 horas para una buena
confirmación. El medio no cambiará de color.
PRUEBA DE LAS DESCARBOXILASAS
Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad que tiene un microorganismo, mediante la
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enzima correspondiente, para decarboxilar un aminoácido (Lisina, Arginina, Ornitina). Son enzimas inducidas
y, generalmente, estas reacciones se producen en condiciones anaerobias. Son capaces de actuar sobre
distintos aminoácidos, la enzima ataca al grupo carboxilo (−COOH) y da lugar a una amina y a CO2.
Nosotros sólo realizaremos la prueba de la Lisina Carboxilasa. Si esta enzima se encuentra presente se
formará Cadaverina y CO2 (alcaliniza).
Dependiendo del medio de cultivo que se utilice, una vez inoculado, es necesario sellarlo para obtener las
condiciones anaerobias. En este caso del caldo de Lisina no es necesario sellarlo, basta un tapón metálico,
preferiblemente de rosca.
Técnica: Inoculamos el medio de cultivo (caldo) con un inóculo escaso y lo incubamos durante 24 horas a
37ºC. En algunos casos es necesario incubar hasta 4 días.
Resultados: El medio sin inocular es de color púrpura y suele contener glucosa y el aminoácido que
queremos estudiar.
• Si la prueba es POSITIVA: el medio tomará un color púrpura amarillento o púrpura turbio. Primero
habrá pasado por el color amarillo y luego habrá revirado al púrpura.
• Si la prueba es NEGATIVA: el medio tomara un color amarillo brillante. Solo se consume la glucosa.
Precauciones: Es conveniente guardar un tubo sin inocular con el fin de comprobar los resultados.
Prueba de la Ureasa
Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad orgánica de algunas bacterias de desdoblar la
urea en dos moléculas de amoníaco, mediante la acción de la enzima Ureasa, que es una enzima constitutiva.
Técnica: Se pueden utilizar distintos medios de cultivo:
• Agar base de urea: tiene el inconveniente que hay que prepararlo, esterilizarlo y, antes de que se
enfríe, hay que añadirle la urea. Se usa de forma inclinada.
• Caldo de urea: ya lleva incorporada la urea. Directamente se siembra el microorganismo y se incuba.
Resultados: Se observa a las 24 o incluso a las 48 horas.
ð Si la prueba es POSITIVA: el medio se observará de un color rosado
ð Si la prueba es NEGATIVA: no se producirá ningún cambio de color. Se mantendrá el color
amarillo−anaranjado del medio inicial.
Prueba de la Fenilalanina Desaminasa
Principio: La prueba pone de manifiesto la capacidad enzimática de un microorganismo para desaminar la
fenilalanina, originándose el ácido fenilpirúvico.
Técnica: Se utiliza el medio fenilalanina en tubo inclinado. Se siembra un inóculo denso, reciente, puro y se
incuba durante 24 horas.
Resultados: Para poner de manifiesto el producto coloreado se añade Cloruro Férrico al 10% : Ác.
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Fenilpirúvico + Cloruro Férrico COLOR
Dejamos resbalar por la superficie del agar inclinado 5−6 gotas del reactivo y se mueve el tubo suavemente
para extenderlo.
1.− Si la prueba es POSITIVA: aparece un color verde sobre la superficie.
2.− Si la prueba es NEGATIVA: se queda del color del Cloruro Férrico, es decir, amarillo.
SISTEMAS COMERCIALES DE IDENTIFICACIÓN
API 10 S: La galería API 10 S consta de 10 microtúbulos que contienen sustratos deshidratados. Estos test se
inoculan con una suspensión bacteriana que reconstituye los medios. Durante la incubación, se producen
cambios de color espontáneos o revelados por adición de reactivos. Después de la incubación de 18−24 horas
a 35−37ºC, la lectura de reacciones se realiza visualmente con la Tabla de Lectura y la identificación se
alcanza consultando la lista de perfiles de la ficha técnica o con un software de identificación.
Técnica:
• Preparación de la galería: Repartir aproximadamente 3 mL de agua destilada en los alveolos del fondo de la
cámara de incubación con el fin de crear una atmósfera húmeda. Inscribir la referencia de la cepa en la
lengüeta lateral de la cámara
• Preparación del Inóculo: Preparar una suspensión de una colonia del m.o con 5mL de solución fisiológica al
0,85%.
3.− Inoculación de la galería:
− Llenar el tubo y la cúpula del test ðCITðcon la suspensión bacteriana.
− Llenar solo los tubos (y no las cúpulas) de los otros test.
− Crear una anaerobiosis en los test LDC, ODC, H2S, URE, llenando su cúpula con aceite de parafina.
− Cerrar la cámara de incubación
− Incubar a 35−37ºC durante 18−24 horas.
4.− Lectura de la galería: se utiliza la Tabla de Lectura. Anotar las reacciones espontáneas en la hoja de
resultados y luego leer los test que requieren añadir reactivos:
TDA: añadir 1 gota de cloruro Férrico. Una coloración marrón−rojiza indica una reacción positiva.
IND: añadir 1 gota de reactivo de Kovacs. Si la reacción es positiva aparecerá una coloración rosa.
NO2: añadir 1 gota de reactivos NIT1 y NIT2 en el tubo GLU. Esperar de 2 a 5 minutos. Una coloración roja
indica una reacción positiva.
se realiza mediante un perfil numérico. En la hoja de resultados, los test están separados en grupos de tres y un
valor 1, 2 ó 4 se indica para cada uno. Dado que la galería API 10 S consta de 1º test, al sumar los valores
dentro de cada grupo que corresponden a las reacciones positivas, se obtienen 4 cifras que corresponden al
perfil numérico.
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ENTEROTUBE: Se utiliza para la identificación de Enterobacteriaceae.
Técnica:
• Quitar los capuchones de protección roscados. Bajo el capuchón blanco se encuentra la punta de la aguja de
inoculación. Con la punta de la aguja sin flamear se pica ahora cuidadosamente una colonia bien aislada,
sin atravesar el agar.
• Extraer la aguja por todos los compartimentos, haciéndola girar ligeramente. Seguidamente se introduce de
nuevo la aguja hasta que la muesca de la aguja alcance la abertura del tubo. La punta de la aguja debe llegar
hasta el compartimento de citrato.
• Romper la aguja, doblándola hacia un lado, por la muesca. Con el extremo restante de la aguja rota se
perfora ahora la película plástica que recubre los orificios de aireación de los últimos 8 compartimentos
para así permitir en estos un crecimiento en aerobiosis. A continuación, enroscar de nuevo los capuchones.
• Incubar en posición vertical, con el compartimiento de glucosa hacia arriba, o bien en posición horizontal,
con la película de plástico hacia abajo a un temperatura de entre 35−37ºC durante 20−24 horas.
Después de la incubación se registran, en una ficha de interpretación, las reacciones positivas, a excepción de
los compartimentos del Indol y VP, ya que necesitan la adición de reactivos. Para la prueba del Indol añadir
con una jeringa 3 ó 4 gotas de reactivo de Kovacs, atravesando la superficie de plástico por arriba del
compartimiento de H2S / Indol. Será positivo si el reactivo agregado adquiere un color rojo en pocos
segundos. Para la prueba de VP inyectar 3 gotas de solución ð−naftol y 2 gotas de KOH por el orificio de
aireación lateral en el compartimiento de VP con el Enterotube en posición horizontal. Será positivo si el
reactivo agregado adquiere un color rojo dentro de los 10 minutos siguientes.
IDENTIFICACIÓN SERÓLOGICA
Se utiliza fundamentalmente para la identificación del género Salmonella, Shigella y E.coli.
Se basa en la utilización de pruebas de aglutinación mediante la identificación de al menos tres antígenos.
Estos antígenos son:
1.− Ag somático 0: Lo suelen poseer cepas como:
ð E.coli 0112: es una cepa enteroinvasiva que produce un cuadro de diarrea similar a la originada por Shigella.
ð E.coli 0157: produce una neurotoxina que da lugar a una colitis hemorrágica y al síndrome urémico
hemolítico.
ð Shigella: permite clasificar en cuatro grupos diferentes la identificación de este Ag somático 0.
2 .− Ag capsular K: Está constituido por polisacáridos de la cápsula. Es termolábil. Suele estar presente en
los géneros Klebsiella, Salmonella (algunas cepas pueden presentar un Ag Vi que está relacionado con la
mayor virulencia de las mismas) y E.coli.
3 Ag flagelar H: Está formado por proteína. Son termolábiles.
DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO
ð PATOLOGÍAS
ENTEROBACTERIAS ASOCIADAS CON INFECCIONES GASTROINTESTINALES Y FIEBRE
ENTÉRICA
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ESCHERICHIA COLI : Es una bacteria que se asocia con 4 tipos distintos de infección entérica:
• E.coli enterotoxigénica (ETEC)
Esta es la que se asocia en mayor grado con las diarreas infantiles en los países subdesarrollados y es causante
también de la diarrea del viajero. Generalmente, este tipo de diarreas se produce como consecuencia de la
ingestión de agua y alimentos contaminados. Para que se produzca el cuadro diarreico es necesario que se
ingiera una elevada cantidad de m.o ya que estos no suelen resistir la acción de pH ácido del estómago.
El m.o coloniza el intestino delgado favoreciendo la adhesión mediante las fimbrias que posee, además
produce 2 tipos de toxinas: una termolábil y otra termoestable. Estas toxinas inducen una secreción activa de
metabolitos a la luz intestinal y el cuadro clínico se manifiesta como diarrea acuosa, nauseas, dolor abdominal
y fiebre.
• E.coli enteroinvasiva (EIEC)
Estas cepas de E.coli dan lugar a un cuadro similar a la Shigellosis. Son capaces de invadir y multiplicarse en
las células epiteliales de la mucosa intestinal, produce fiebre, dolor abdominal y diarrea acuosa con
eliminación de sangre y moco. En ocasiones puede producir un cuadro de toxemia.
• E.coli enteropatógena (EPC)
Estas cepas de E.coli pueden dañar la mucosa intestinal originando descamación de la misma. Algunas cepas
producen toxinas que tienen una acción citotóxica.
El cuadro clínico se presenta con diarrea, eliminación de moco y apenas presencia de sangre. Suelen afectar
con mayor frecuencia a los lactantes y a niños de corta edad.
• E.coli 0157: H7
Suele producir dos cuadros clínicos:
• Colitis hemorrágica. Es una forma grave de diarrea.
• Síndrome urémico hemolítico.. Se produce una insuficiencia renal, anemia hemolítica y
trombocitopenia.
SALMONELLA : Produce gastroenteritis transmitidas generalmente por el consumo de alimentos
contaminados por el m.o. Es móvil.
El reservorio de la Salmonella suele ser los animales, excepto la Salmonella typhi cuyo reservorio es el
hombre.
Los puentes de las infecciones por Salmonella suelen ser las aves y sus productos, y con menor frecuencia,
leche y sus derivados.
Para que se produzcan los cuadros de gastroenteritis es necesaria la ingestión de un gran
número de m.o ya que la acidez gástrica disminuye el número de m.o viables. Aquellos que sobreviven a la
acidez gástrica pasan al intestino delgado donde se multiplican. Esta proliferación del m.o en el intestino
puede cursar sin sintomatología clínica o de forma sintomática. En éste último caso, se puede manifestar como
enterocolitis, bacteriemia o fiebre entérica:
40
• Fiebre Entérica: El cuadro de esta fiebre suele estar producido por S. typhi o por S. paratuphi. Da
lugar a lo que se conoce como fiebres tifoideas o paratifoideas.
Una vez que se produce la ingestión de estas salmonellas y llegan al intestino delgado, pueden atravesar el
sistema linfático y alcanzar el torrente circulatorio produciéndose la diseminación a otros órganos.
• Bacteriemia: Suele estar producida por S.cholerae, S.suis y otros tipos de Salmonella.
• Enterocolitis: Suelen estar causadas por S. typhimurium que es la forma más común de manifestarse
las infecciones por Salmonella.
Este tipo de infecciones producidas por S. typhimurium, después de transcurridas de 8 a 48 horas de la
ingestión de alimentos contaminados se produce un cuadro de nauseas, vómitos y diarrea. La que más
importancia tiene en el cuadro clínico de las Salmonellas es la Enterocolitis, porque se produce por la
ingestión de alimentos. No citan tratamiento antibiótico.
SHIGELLA : Son una de las causas más frecuentes de diarrea bacteriana. La diarrea producida por Shigella
también se conoce como disentería bacilar.
La vía de transmisión de este microorganismo es la vía fecal−oral y también a través de los alimentos
contaminados con heces. Resiste la acidez gástrica, por lo que es suficiente un pequeño número de m.o para
producir la infección. Se multiplica en la mucosa intestinal aunque sin llegar a atravesarla, por este motivo, los
hemocultivos serán negativos.
• SHIGELLA DYSENTERIDE TIPO I
Elabora una toxina termolábil que es neurotóxica y citotóxica. Produce una diarrea similar a la enterotoxina
termolábil de E.coli. El carácter neurotóxico de la toxina determina que, en ocasiones, se puedan producir
cuadros de meningitis y coma. Generalmente, los niños de corta edad son los más afectados por este tipo de
infección.
YERSINIA : Dentro de este género, la Yersinia enterocolítica, da lugar a cuadros de gastroenteritis por
ingestión de agua o alimentos contaminados. Con menor frecuencia, también se produce la infección por
contacto directo con animales infectados. Este m.o es capaz de crecer a temperaturas de refrigeración, por lo
que es un m.o a tener en cuenta en la industria alimentaria. Para que se produzca la infección es necesario que
el sujeto ingiera gran cantidad de inóculo.
Con menor frecuencia se aíslan también Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia intermedia, que también
originan cuadros de gastroenteritis.
ENTEROBACTERIAS ASOCIADAS CON INFECCIONES EXTRAINTESTINALES
YERSINIA PESTIS : Es el agente etiológico de la peste bubónica. Se transmite por la picadura de la pulga o
por manipulación de animales infectados. El principal reservorio lo constituyen las ratas.
Una vez que el m.o penetra a través de la piel, como consecuencia de la picadura, es fagocitado por
macrófagos y leucocitos en cuyo interior se multiplican. Durante esta fase intercelular el m.o sintetiza dos Ag,
uno proteico y otro lipoproteico, que permiten que el m.o no sea destruido por las células inmunitarias una vez
que se produce la lisis de la célula que parasita.
Las infecciones por Yersinia pestis se pueden manifestar como peste bubónica, peste sistémica o peste
neumónica.
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En la peste bubónica hay una infección de los ganglios linfáticos con inflamación, pudiendo producirse
cuadros de neumonía por diseminación hematógena. La peste sistémica se caracteriza por fiebre y
bacteriemia. La peste neumónica es muy contagiosa por vía aérea.
E.coli : Es la principal causa de infecciones del tracto urinario. Pueden dar lugar a cuadros de cistitis, uretritis,
pielonefritis y sepsis.
Las cepas implicadas en este tipo de infecciones son las denominadas Urohepatogénicas, debido a que poseen
elementos de adherencia entre otros factores de patogenicidad.
El E.coli también produce infecciones de tipo nosocomial, entre las que se encuentran neumonías e
infecciones de heridas quirúrgicas.
Además puede producir meningitis neonatal, que está producida por una cepa con Ag capsular denominada
K1.
Klebsiella − Enterobacter − Serratia : Este grupo de enterobacterias da lugar a infecciones de origen
nosocomial.
• Klebsiella pneumoniae. Es el agente etiológico de aproximadamente el 3% de las neumonías de
origen bacteriano. Suele afectar a individuos con diabetes, alcoholismo o infecciones pulmonares.
(inmóvil)
• El género Enterobacter engloba patógenos oportunistas que producen principalmente infecciones de
heridas, quemaduras e infecciones de tracto respiratorio y urinario.
• Serratia es un género formado por especies habitualmente saprofitas del suelo que pueden producir
infecciones nosocomiales, principalmente del tracto respiratorio y urinario.
Proteus−Morganella−Providencia: Estos géneros se suelen relacionar con infecciones del tracto urinario. La
capacidad que tienen para hidrolizar la orina produce la liberación de amoníaco, lo que determina una
alcalinización de la misma que induce a la formación de cálculos. Por otro lado, la movilidad del género
Proteus favorece la invasividad del tracto urinario por parte de esta enterobacteria. El género Providencia se
ha asociado a bacteriemias en pacientes con catéteres venosos.
Citrobacter: Esta bacteria se engloba dentro del género de patógenos oportunistas. Se asocia con infecciones
urinarias y respiratorias en pacientes hospitalizados. (móvil).
El Citrobacter diversus se asocia en casos de meningitis en neonatos.
GÉNERO I: VIBRIO
Son bacilos Gram−, anaerobios facultativos, móviles (flagelo polar), Oxidasa+, reducen los nitratos a nitritos,
todos los miembros de este género son capaces de crecer en medios que contienen sal (halofílicos).
El género Vibrio está ampliamente distribuido en la naturaleza. Son bacterias acuáticas. Ciertas especies de
Vibrios producen infecciones localizadas y otras especies pueden dar lugar también a infecciones sistémicas.
ð ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
Poseen el antígeno flagelar H, que es termolábil y el antígeno somático O, que es termoestable, de
naturaleza polisacárida, específicos y que se utilizan para la serotipificación.
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Vibrio cholerae 01
Son los que producen las epidemias de cólera. Estas cepas epidémicas de V.cholerae se pueden separar según
factores específicos en los serotipos: Ogawa ; Inaba y Hikojima. Además de estos serotipos, se conocen
también dos biotipos de V.cholerae 01 que son el Clásico y El Tor.
ð TOXINAS
El V.cholerae produce una potente enterotoxina que provoca un aumento de la secreción de agua y electrolitos
a la luz intestinal.
El biotipo El Tor de V.cholerae produce hemolisinas que son termolábiles y tienen una actividad citotóxica.
Otras especies de Vibrios producen toxinas extracelulares con actividad citolítica y citotóxica.
ð AISLAMIENTO
• Transporte de las muestras:
Para aquellas muestras que son extraintestinales, el procesamiento de las mismas se realiza de igual manera
que para el aislamiento de otras bacterias.
Cuando la muestra son heces, y no se van a procesar inmediatamente después de su recogida, es necesario
utilizar un medio de transporte (Ej. Cary−Blair) con el fin de evitar la exposición al aire de la muestra, ya que
los Vibrios son muy sensibles a la desecación.
• Medios de cultivo: Los Vibrios se desarrollan bien en:
ð Agar sangre: los Vibrios desarrollan colonias con o sin hemólisis, Oxidasa+.
ð Agar MacConkey: dan lugar a colonias incoloras, Lactosa−.
Cuando se sospecha una infección entérica por V.cholerae es necesario incluir una placa de un medio
selectivo : Agar TCBS (Triptosa, Citrato, Bilis, Sacarosa). En este medio, los Vibrios que son fermentadores
de sacarosa producen colonias amarillas, mientras que los no fermentadores dan lugar a colonias verde
azuladas.
Cuando es necesario utilizar caldos de enriquecimiento para el aislamiento, a partir de las heces, es
conveniente utilizar Agua de Peptona alcalina con un 1% de Cloruro Sódico.
ð IDENTIFICACIÓN
ð Tinción de Gram: son bacilos Gram−, cortos, rectos o curvados.
ð Pruebas bioquímicas: se utilizan los medios habituales para la identificación de enterobacterias, siempre y
cuando estén enriquecidos con Cloruro Sódico.
ð PATOLOGÍA
ð Vibrio cholerae 01: Es el agente etiológico del Cólera. Tiene 2 biotipos el Clásico y El Tor.
El biotipo El Tor causa infecciones menos graves que el biotipo Clásico. La infección se adquiere por vía oral,
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se necesita una dosis de m.o alta y, una vez que han superado la mucosa gástrica, los Vibrios se fijan en las
células epiteliales del intestino delgado donde elaboran la enterotoxina.
Los síntomas clínicos son nauseas, vómitos, dolor abdominal y diarrea acuosa. Las deposiciones son
continuas, lo que conduce a una pérdida masiva de agua y electrolitos.
El tratamiento es fundamentalmente sintomático y consiste en la reposición de líquidos y electrolitos.
ð Vibrio cholerae NO 01: También producen cuadros de gastroenteritis, aunque más leves que el cólera y, en
ocasiones también se aíslan en infecciones extraintestinales:
− Vibrio vulnificus: es el más patogénico.
− Vibrio parahaemolyticus: es junto con el V.cholerae el m.o que con más frecuencia se aísla en clínica. Se
asocia con infecciones gastrointestinales por consumo de pescado crudo.
ð EPIDEMIOLOGÍA Y CONTROL
Los factores de riesgo para la adquisición de infecciones por especies de Vibrios no coléricos son el consumo
de pescado y mariscos crudos o poco cocinados y el contacto con heridas y mucosas con aguas contaminadas.
Por lo que respecta al Cólera, la diseminación del mismo se produce por contacto de persona a persona y por
el consumo de alimentos y aguas contaminadas.
El control de las infecciones producidas por los Vibrios consiste en la educación sanitaria y en la mejora de
las condiciones higiénico−sanitarias.
GENERO: AEROMONAS
Son bacilos Gram−, anaerobios facultativos, Oxidasa+, fermentan la Glucosa con o sin producción de gas, son
móviles (flagelo polar), capaces de crecer en un amplio intervalo de temperaturas.
Se diferencian de los Vibrios porque no crecen en concentraciones al 6,5% de Cloruro Sódico. Habitan aguas
dulces y saladas, sonde infectan a los peces y, en el hombre, se asocian a infecciones gastrointestinales.
• PATOLOGÍA
Consiste en diarrea aguda (infección más frecuente producida por este tipo de microorganismo que se asocia a
la diarrea del viajero). Con menos frecuencia puede dar lugar a celulitis e infecciones de heridas por contacto
con agua o tierra contaminada.
GÉNERO : PLESIOMONAS
Este género comprende una única especie, P.shigelloides, que produce Catalasa y Oxidasa, fermenta la
Glucosa sin producción de gas, es capaz de crecer en un amplio margen de temperaturas siendo la óptima
37ºC.
Generalmente habita en el intestino de peces de agua dulce y animales. Se asocia con infecciones intestinales
en áreas tropicales y subtropicales.
• MEDIOS DE CULTIVO. AISLAMIENTO
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Se desarrollan en agar sangre y también en Agar Salmonella−Shigella.
Se distingue de las Enterobacterias por la prueba de la Oxidasa.
Se distingue de las Aeromonas por la prueba de la Dnasa (Aeromonas son +)
Se distingue de los Vibrios en que no toleran la sal (Vibrios sí).
GÉNERO : ESTAFILOCOCOS
Son Cocos Gram+, aerobios y anaerobios facultativos, inmóviles, Catalasa +, no esporulados, generalmente
no capsulados y se agrupan en racimos u otras formas (parejas, tetradas,...). Resisten a la acción del calor,
sales biliares, cloruro sódico 9,5% y a la optoquina.
El género Sataphylococcus se compone de 27 especies, la mayor parte de las cuales son flora habitual del
hombre y se localizan preferentemente en la piel y en las mucosas.
De entre las especies de Staphylococcus, las que se asocian con más frecuencia a infecciones son S. aureus
(Coagulasa+), S, epidérmidis (Coagulasa−) y S. saprophyticus (Coagulasa−).
Crecen bien en los medios habituales de laboratorio. Las muestras clínicas en las que se sospecha que pueden
contener Staphylococcus se siembran en un medio general como el Agar Sangre y en un medio líquido como
el Caldo de Tioglicolato o el Caldo de Infusión de Cerebro−Corazón.
S. aureus Colonias de color amarillo anaranjadas
S. epidermidis Colonias blanco grisáceas
S. saprophyticus Colonias grandes, de aspecto brillante y opacas
AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS DE MUESTRAS MUY CONTAMINADAS
Como muestras contaminadas se refiere por ejemplo a heces. Se utilizan medios selectivos:
• Agar Sal y Manitol: S. aureus y saprophyticus acidifican el medio
• Agar Sal lipasa−manitol: S. aureus zona amarilla alrededor de la colonia y una zona opaca por la
precipitación de los lípidos.
• Agar Columbia
• Agar Alcohol−Feniletílico
IDENTIFICACIÓN
− Resiste a la Bacitracina: permite diferenciar entre Staphylococcus y Micrococos.
− Prueba de la Catalasa: permite diferenciar Staphylococcus de Streptococcus.
− Morfología de la colonia
− Fermentación de Carbohidratos
− Coagulasa
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− Hemólisis
− Resistencia a la Novobiocina
− Actividad Fosfatasa
− Desoxirribonucleasa
− Ureasa
Prueba de la Coagulasa
S. aureus es capaz de producir una proteína llamada Coagulasa que es capaz de aglutinar el plasma en
presencia de un factor contenido en el suero. Esta factor reacciona con la coagulasa, activa el fibrinógeno y
produce un coágulo de fibrina. Esta coagulasa se puede encontrar de forma ligada o en forma libre.
El estudio de esta actividad coagulasa se puede llevar a cabo en tubo o en portaobjetos:
En Portaobjetos:
• Poner una gota estéril de agua destilada o solución salina fisiológica sobre el porta.
• Emulsionar suavemente con una suspensión espesa de Staphylococcus o una colonia tomada con un
asa.
• Mezclar suavemente la suspensión de Staphylococcus con el plasma que podamos tomar con un asa.
• Observar la inmediata formación de un precipitado macroscópico.
Prueba Positiva Prueba Negativa
Acentuada aglutinación 5−20 sg No se observan cambios, la
Retardada 20 sg−1min suspensión permanece homogénea
Dudosa > 1min
En el caso de que la aglutinación sea dudosa, será necesario repetirla o realizar la prueba en tubo.
En tubo:
• Poner en un tubo estéril de hemólisis 0,5 mL de plasma de conejo y 0,5 mL de un cultivo en caldo o
placa. En este último caso se tomará un número suficiente de colonias.
• Incubar en un baño a 37ºC durante 4 horas. Observar cada 30 min.
Prueba Positiva Prueba Negativa
Se forma un coágulo o filamentos de fibrina definidas Sin cambios
• Completa: coágulo en todo el tubo
• Parcial
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Prueba de la Hemólisis
S. aureus halo translúcido
S. saprophyticus y S. epidermidis No tienen capacidad hemolítica
Resistencia a la Novobiocina
Solamente S. saprophyticus es resistente. Se utilizan discos
Actividad Fosfatasa
Algunas especies de S. aureus y S. epidermidis producen la Fosfata Alcalina. Esta enzima actúa sobre el
Difosfato de Fenolftaleina y los transforma en Fenolftaleina libre. Esta Fenolftaleina libre, al reaccionar con
un álcali da lugar a un color rojo rosado brillante.
Reactivos:
• Sal Sódica Difosfato de Fenolftaleina al 0,5% en agua destilada. Debe estar esterilizado por filtro de
membrana (0,22 ðm como diámetro del poro)
Medios:
• Caldo Nutritivo: 3 mL de caldo por tubo. Esterilizar y antes de enfriar añadir una gota de reactivo.
• Agar Nutritivo
Método utilizando el caldo nutritivo:
Se inocularán 2 tubos rotulados como A y B con un inóculo denso de un cultivo puro y reciente (18−24
horas).
Incubar a 35ºC durante 6 horas. Transcurrido este tiempo añadir 1 gota de NaOH 10N al 40% al tubo A.
Si no hay viraje, lo desechamos y continuamos la incubación con el tubo B hasta 24 horas.
Método utilizando el agar nutritivo:
Esterilizamos el medio, lo dejamos enfriar y le añadimos 2 mL de fenolftaleina al 5% por cada 98 mL de
medio. Lo mezclamos y plaqueamos.
Sembramos por estría con un inóculo poco denso, procedente de un cultivo puro y reciente e incubamos a
37ºC durante 24 horas.
Para proceder con la lectura es necesario exponer las colonias al vapor de amoniaco. Esto se puede hacer de
dos formas:
• Tras la incubación mantenemos las colonias sobre un frasco abierto
• Agregar 1 mL de amoniaco a la tapa de la placa de petri donde hemos realizado la siembra e
invertimos el cultivo sobre ella.
47
Se considerará resultado positivo si aparece un color rojo rosado brillante
Se considerará resultado negativo si no se observan cambios. Colonias claras o blancas.
Prueba de la Desoxirribonucleasa (DNAasa)
Se utiliza el Agar DNAasa. Sembramos con una estría única de aproximadamente 2 cm de longitud y se
incuba a 37ºC durante 24 horas.
Después de incubar añadimos, inundando la placa, ClH 0,1 N que reacciona con el DNA presente apareciendo
una zona turbia.
A los 5 minutos realizamos la lectura de los resultados:
• Se considera prueba positiva si aparece una zona clara alrededor de la línea de siembra.
• Se considera prueba negativa si aparece turbidez en toda la superficie del medio de cultivo.
En ocasiones este medio lleva indicadores que nos indican si el m.o posee la DNAasa sin necesidad de añadir
el HCl. Estos indicadores pueden ser:
ð Verde de Metilo: prueba positiva halo claro / prueba negativa verde intenso
ð Azul de Toluidina: prueba positiva halo rosa / prueba negativa halo azul
(se puede añadir sobre el propio crecimiento)
Prueba de la Ureasa
Pruebas que ponen de manifiesto la producción de ácido por fermentación de carbohidratos
Utilización de Sistemas Comerciales de identificación: basados en pruebas bioquímicas, enzimáticas...(Ej.
API)
ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
Puesto que Staphylococcus es una bacteria Gram+ tiene una estructura antigénica compleja y muy variada:
• Peptidoglucano: es un polisacárido constituido por N−acetil murámico y N−acetil glucosamina. El
peptidoglucano induce a la producción de Interleuquina I (*) y de Ac opsonizantes (*), además
proporciona una actividad endotóxica.
• Ácidos Teitoicos
• Proteína A: se une a la región Fc (*) de la IgG y activa el complemento (*)
• Factor de aglutinación: coagulasa unida (fijada) fija fibrinógeno
• Polisacárido:
S. aureus cápsula polisacárida que inhibe la fagocitosis
S. epidermidis exopolisacárido (Slime) que permite la adherencia a superficies plásticas, además de contribuir
a la resistencia a la fagocitosis por los polimorfonucleares.
48
ENZIMAS
Coagulasa, Hialuronidasa, ð− Lactamasas, Nucleasas, Lipasas
TOXINAS
Alfa toxina: actúa sobre la membrana de los eritrocitos
Beta toxinas: degrada enfingomielina (*)
Gamma toxina: lisa eritrocitos
Delta toxina: ejerce una acción detergente sobre membranas biológicas
Toxina esfoliativa: produce daños dermatológicos (Síndrome piel escaldada)
Toxinas implicadas en el Síndrome del Shock Séptico
Enterotoxinas: termoestable, resiste la acción de las enzimas del tubo digestivo. Se producen cuando los
Staphylococcus crecen en alimentos ricos en carbohidratos y proteínas.
PATOGENIA
S. aureus: 2−40% son portadores nasales y un 10% son mujeres (vagina)
• Infecciones de la piel: forúnculos, ántrax, celulitis, impétigo...
• Bacteriemias, endocarditis, meningitis, neumonía, osteomielitis...
• Síndrome del Shock Tóxico (fiebre, hipotensión, afectación multisistémica)
• Intoxicaciones alimentarias
S. coagulasa negativos:
• S. epidermidis: bacteriemia, endocarditis infecciosa, peritonitis, osteomielitis, infección del tracto
urinario, infección de catéteres y prótesis...
• S. saprophyticus: infecciones del tracto urinario
S. haemolyticus; S. lugdunensis; S. schleiferi oportunistas
(*)Complemento: es un conjunto de 20 proteínas que dan lugar a un sistema enzimático en cascada en el
plasma. Sus funciones son las siguientes:
• Opsonización
• Quimiotaxis
• Aumento del flujo sanguíneo y permeabilidad capilar en infección (inflamación)
• Lisis celular, bacterias y hongos
El complemento se puede activar por dos vías:
ð Vía Clásica: activada por la unión del Ag al Ac. Esta unión activa los siguientes escalones C1, C2...hasta
49
llegar al C3.
ð Vía Alternativa: activada por los polisacáridos cuando la infección es producida por bacterias Gram+.
Igual que la anterior finaliza en el C3.
A partir de la Fracción C3 se produce la activación de la C3a y C3b. C3a va activando consecutivamente otras
fracciones dando lugar a la inflamación. Por su parte, C3b da lugar a la opsonización, relacionada con la
quimiotaxis.
(*) Estructura de las Ig:
(*) Opsonización: Es el proceso por el cual las bacterias se hacen atractivas a los fagocitos. El germen se une
a la IgG y C3b (proteínas plasmáticas) y de esta forma el microorganismo se hace más fácilmente reconocible
por los fagocitos (se modifica la estructura fisiológica de la bacteria).
(*) Linfoquinas: son proteínas liberadas por los linfocitos TD.
• Factor quimiotáctico
• Factor inhibidor de la migración de los macrófagos
• Factor activador de macrófagos
• Interleuquina I: promueve la activación y multiplicación de los linfocitos B y T. El Ag estimula a la
célula presentadora de Ag y ésta secreta Interleuquina I que activa los linfocitos T (fabrican la
Interleuquina II)
• Interleuquina II Interferol
(*) Esfingomielina: La esfingomielina está constituida por esfingosina (forma parte de los cerebrósidos),
ácido fosfórico, ácidos grasos, colina (transporte de grasas) y se localiza en grandes cantidades en el cerebro y
en el tejido nervioso. Es degradada por las toxinas ð de los Estafilococos.
GÉNERO : STREPTOCOCCUS
Los Estreptococos son cocos Gram+ (en cultivos viejos pueden perder su carácter Gram+), inmóviles,
Oxidasa y Catalasa − que se observan al microscopio en parejas o en cadenas de diferente longitud. Las
células aisladas tienen forma esférica u ovoide. Cuando se presentan en parejas pueden tener aspecto de
bacilo.
Son m.o anaerobios facultativos, aunque hay cepas que crecen mejor en condiciones microaerofílicas.
Las pruebas de la Catalasa y de la Oxidasa les diferencian de los cocos Gram− de género Neisseria que son
positivos para estas pruebas.
Los Estreptococos son m.o que están ampliamente distribuidos en la naturaleza, algunos de ellos son flora
habitual del hombre y otros se asocian a infecciones bien por acción directa o por fenómenos de
sensibilización.
La clasificación de los Estreptococos resulta compleja por lo cual se recurre a una combinación de factores
morfológicos, bioquímicos y serológicos.
ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
• Ag de la pared: es específico de grupo y se denomina carbohidrato C. Está localizado en la pared
50
celular lo que permite clasificarlos serológicamente en los llamados grupos de Lancefield.
• Proteína M: se trata de un Ag proteico que se encuentra en la pared celular y constituye el principal
factor de virulencia del Strept. pyogenes que es un Estreptococo perteneciente al grupo A.
Esta proteína se encuentra en unas proyecciones similares a las fimbrias que sobresalen de la pared celular. Su
presencia o ausencia condiciona la virulencia de la cepa. En el caso de que en el huésped no existan Ac frente
a esta proteína, las cepas de S. pyogenes con dicha proteína son capaces de resistir la acción fagocítica de los
leucocitos. Además, esta proteína también está implicada en los procesos de adherencia a células epiteliales.
• Otros Ag:
− Proteína T y R: se encuentran en la pared celular.
− Nucleoproteínas
− Cápsula polisacárida (S. pneumoniae)
TOXINAS Y ENZIMAS
• Streptocinasa o Fibrinolisina: la poseen los Strept. ð hemolíticos del grupo A
• Streptodornasa o Desoxirribonucleasa Estreptococica.
• Hialuronidasa
• Toxina eritrogénica: produce lesiones cutáneas propias de la escarlatina.
• Hemolisina: ð hemólisis−completa / ð hemólisis−incompleta
• Estreptolisina (S. pyogenes): tipo 0 / Tipo S
AISLAMIENTO
Medios Generales que contengan sangre o derivados:
• Agar Columbia
• Agar Tripticasa Soja con un 5% de sangre de carnero
• Agar Chocolate
Medios de Enriquecimiento
• Caldo Tripticasa Soja
• Caldo Todd−Hewit
Medios Selectivos
• Agar Columbia suplementado con Colistina−Nalidíxico
• Agar feniletílico
Medios Selectivos de Enriquecimiento
1 Medio de Todd−Hewit modificado. Posee Azida Sódica (inhibe la presencia de Gram−) y Cristal Violeta
51
(inhibe los posibles Stafilococcus de la muestra).
IDENTIFICACIÓN: Pruebas Bioquímicas
ð Sensibilidad a la bacitrocina (Streptococcus del grupo A)
ð VP
ð Hidrólisis del Hipurato: pone de manifiesto si el Estreptococo tiene una enzima que actúa sobre el
Hipurato que es la hipurinasa. Se revela con un reactivo. Esta prueba sirve para Strep. del grupo B, cepas del
grupo D y algunos ð hemolíticos.
ð Tolerancia a la sal: diferenciamos a los Enterococos de los ð hemolíticos A, C, F, G y del S. viridans
porque los Enterococos toleran la sal (alto contenido salino: 6,5).
ð Prueba de la Bilis Esculina: los Strept. del grupo D hidrolizan la esculina en presencia de bilis dando como
productos esculetina y glucosa.
El medio que se usa es el Medio Bilis Esculina que es sólido y se deja enfriar inclinado. La siembra se realiza
a partir de un caldo, depositando dos gotas con una pipeta o un asa. La incubación se hace a 35−37ºC durante
48−72 horas.
Si la prueba resulta positiva se observa un color negro en la mitad o más de la superficie.
Si la prueba resulta negativa no hay ennegrecimiento o aparece en menos de la mitad del medio.
ð Solubilidad en Bilis: esta prueba se usa para diferenciar neumococos de otros Strept. del grupo viridans. La
bilis lisa las células de S. pneumoniae y, por el contrario, no es capaz de solubilizar las células de otros Strept.
de ese grupo viridans.
ð Sensibilidad a la Optoquina: esta prueba nos permite diferenciar entre neumococos, que son sensibles a la
optoquina, y Strept. hemolíticos, que son resistentes. Se realiza de forma similar a la de la bacitrocina.
ð Utilización de Carbohidratos.
ð Prueba de CAMP: sembramos en una placa de Agar Sangre estreptococos de forma perpendicular y sin
tocarse a una siembra de S. aureus. Si el m.o se trata de un Strept. del grupo B se producirá una sustancia
llamada CAMP que en presencia de los Estafilococos producen una zona de lisis en forma de punta,
agrandando la zona de hemólisis.
Ejercicio: Hacemos un urocultivo. Sembramos un agar sangre y un agar MacConkey. Las posibles opciones
son las siguientes:
No hay colonias
Agar sangre Crecen colonias iguales
Crecen colonias distintas
Agar MacConkey Crecimiento
No crecimiento
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PATOLOGÍA
• Ag específico de grupo (c): nos permite la clasificación de los Estreptococos ð−hemolíticos. Es un
carbohidrato.
• Proteína M: la posee el S. pyogenes el grupo A
ð− Hemolíticos (S. pyogenes del grupo A)
Las infecciones producidas por S. pyogenes se pueden clasificar en tres grandes grupos:
• Enfermedades por invasión de tejidos:
− Erisipela: inflamación aguda de la piel con afectación de los vasos linfáticos cutáneos que cursa con fiebre
elevada y escalofríos. El área afectada suele ser la cara y, en ocasiones, el tronco y las extremidades.
− Fiebre puerperal y sepsis: comienza como una infección del útero como consecuencia de un parto o de un
aborto y puede evolucionar desde la infección uterina hasta una peritonitis produciendo en algunos casos
cuadros de septicemia.
• Enfermedades por infección localizada producida por S. pyogenes y sus productos:
• Faringitis: aparece inflamación, fiebre, afectación de los ganglios linfáticos del cuello. Se da un
elevado porcentaje de portadores asintomáticos. El tratamiento es importante para prevenir posibles
complicaciones como la fiebre reumática y la glomerulonefritis.
• Fiebre Escarlatina: se produce en aquellos casos en los que las cepas de S. pyogenes producen una
toxina eritrogénica que afecta a pacientes que no están inmunizados. Se caracteriza por inflamación
de tejidos que pueden llegar a formar abscesos localizados generalmente en las anginas y que pueden
llegar a bloquear el paso del aire. Se observa también un exantema de color rosado que se acompaña
de fiebre.
• Pioderma (impétigo): vesículas rellenas de un líquido purulento son estafilococos en su interior. Los
Estreptococos también pueden producir un impétigo similar al producido por Estafilococo.
• Endocarditis; Meningitis; Otitis y Neumonías.
3 .− Enfermedades por hipersensibilidad tras infección estreptocócica no supurativas:
Fiebre reumática: es una complicación de tipo autoinmune que generalmente se expresa en forma de artritis,
aunque también puede producir afectación cardiaca originando lesiones en las válvulas del corazón. El
elemento desencadenante suele ser una faringitis estreptocócica donde los síntomas aparecen de 1 a 5 semanas
después de que la infección original haya desaparecido. Los mecanismos por los cuales se produce esta fiebre
reumática son:
ð Los Ag bacterianos que se depositan en las articulaciones y el corazón y cuando el organismo produce Ac
contra ellos se originan complejos que podrían ser el origen de la lesión.
ð Los Ag estreptocócicos dan una reacción cruzada con componentes del músculo cardiaco que induce a la
producción de Ac que posteriormente lesionarán el corazón.
− Glomerulonefritis: está originada por cepas de Estreptococos que tienen especial afinidad por el riñón.
NOTA: En las enfermedades postestreptocócicas no supurativas el Estreptococo no se encuentra en la lesión
sino que ésta se origina por unos complejos como consecuencia de la interacción Ag−Ac (reacciones de
53
hipersensibilidad).
Streptococcus agalactiae B ( ð−hemolítico)
Es el agente etiológico más frecuente de sepsis y meningitis neonatal. También puede producir osteomielitis,
infección del tracto urinario, endocarditis y neumonías.
Streptococcus de los grupos C y G
Son habituales en la garganta, tracto gastrointestinal y vagina. Pueden producir faringitis y bacteriemia.
Streptococcus bovis del grupo D: Produce endocarditis y bacteriemias
Streptococcus anginosus: produce abscesos y otras infecciones purulentas
Streptococcus pneumoniae; forma parte de la flora normal de la naso−orofaringe y produce neumonía
bacteriana extrahospitalaria; otitis, sinusitis y peritonitis y es el segundo agente etiológico productor de la
meningitis bacteriana.
Streptococcus del grupo viridans: forma parte del tracto gastrointestinal y respiratorio. Da lugar a
infecciones como m.o oportunista. De este grupo los más importantes son S. mutans y S. sanguis I y II
GENERO : ENTEROCOCOS
Son flora normal fecal del hombre y animales. También pueden localizarse en la cavidad oral y en la vagina.
Las especies que se aíslan con más frecuencia son: E. faecalis y E. faecium.
GENERO : BACILLUS CEREUS
Es un m.o capaz de producir toxoinfecciones alimentarias que están motivadas por la producción de una
enterotoxina. El diagnóstico se suele hacer mediante el aislamiento del germen a partir de los alimentos
sospechosos de estar contaminados o bien a partir de las heces de los pacientes.
En ocasiones, B. cereus, puede comportarse como un patógeno oportunista en pacientes inmunodeprimidos.
BACILOS GRAM+ ESPORULADOS. CLOSTRIDIUM
Generalmente se suelen encontrar tanto en el suelo como en el intestino del hombre y los animales.
Aunque se les define como Gram+, en los cultivos de más de 48 horas pueden aparecer como Gram−. Una de
las características que presenta este género es la formación de esporas, aunque se producen de manera
diferente dependiendo de la especie de Clostridium.
Patogenicidad
Depende de la liberación de exotoxinas y de la producción de enzimas con un alto poder destructivo.
Clostridium puede dar lugar a diferentes cuadros clínicos:
• Intoxicación alimentaria: Producida por Clostridium perfringens. Es el cuadro clínico más frecuente.
Consiste en la aparición de diarrea y dolor abdominal tras la ingesta de alimentos contaminados,
generalmente carne. Las enterotoxinas que produce este tipo de Clostridium son las responsables de la
infección. Estas toxinas se liberan a partir de las esporas del m.o cuando el alimento permanece a
54
temperatura ambiente después de haber sido conocido. La unión de la enterotoxina a las células
epiteliales del intestino altera el equilibrio osmótico y provoca la diarrea.
El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la detección de C. perfringens en el alimento o bien en las
heces de los pacientes. También se puede hacer la detección directa de la toxina en las muestras fecales.
• Enteriditis necrotizante: Es otro de los cuadros producido por C. perfringens, en este caso del tipo
C. Este Clostridium produce una toxina necrotizante que da lugar a una necrosis del tejido intestinal y
a una diarrea sanguinolenta que se acompaña de vómitos y dolor abdominal.
El diagnóstico es fundamentalmente clínico ya que, el hecho de aislar o cultivar el m.o, no indica
necesariamente que haya infección.
• Gangrena gaseosa: El agente causal que se aísla con más frecuencia es Clostridium perfringens y la
infección se produce a partir de heridas traumáticas o quirúrgicas contaminadas por el m.o. Consiste
en una necrosis muscular y signos de toxicidad sistémica debido a la producción de toxinas
citotóxicas.
El diagnóstico se realiza basándose en las manifestaciones clínicas y por la observación en la tinción de Gram
de bacilos Gram+ de gran tamaño y con los extremos cuadrados, a partir de muestras obtenidas de los tejidos
afectados.
• Botulismo: Producido por Clostridium botulinum.. Este Clostridium es capaz de producir una serie de
neurotoxinas que son las responsables de la enfermedad. Se reconocen 4 formas clínicas producidas
por C. botulinum:
− Intoxicación alimentaria: es la forma más frecuente. Se produce tras la ingestión de alimentos
contaminados, generalmente conservas vegetales. La gravedad de la enfermedad va a depender de la cantidad
de toxina ingerida. Se manifiesta por una serie de síntomas neurológicos que afectan a la visión, hay afonía, ...
− Botulismo de las heridas
− Botulismo del lactante
− Forma indeterminada: se manifiesta generalmente en niños menores de un año y en ellos no se encuentra la
fuente de infección.
El diagnóstico del botulismo es fundamentalmente clínico, aunque se puede demostrar la presencia de la
toxina en sangre y del m.o en heridas, tejidos afectados, alimentos, etc.
ð étanos: Se produce por la potente acción de una neurotoxina elaborada por Clostridium tetani. La
enfermedad consiste en una parálisis generalizada debido al bloqueo por la toxina de las uniones musculares
de las neuronas motoras. El diagnóstico es fundamentalmente clínico.
ð Colitis pseudomembranosa: Producida por las toxinas de tipo A y B que produce el Clostridium difficile.
Esta colitis se trata de un cuadro de diarrea tras un tratamiento con antibióticos de amplio espectro que altera
la flora intestinal y permiten la multiplicación del m.o. En el laboratorio el método más específico es la
detección directa de la toxina en las heces del paciente.
ANTIBIOGRAMA
PRUEVA DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MÉTODO DE DISCO DIFUSIÓN
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GENERALIDADES
OBJETIVO
Describir los procedimientos para la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana mediante el
Método de disco difusión (KiMb − Bauer)
CAMPO DE APLICACIÓN
Comprende la determinación de la susceptibilidad antibiótica mediante el método de disco difusión
(Kim − Bauer) e interpretación de los resultados, de las bacterias que a continuación se señalan
1. Staphylococcus spp
2. Enterococcus spp
3. Pseudomonas aeruginosa
4. Acinetobacter spp
5. Enterobacterias
6. Streptococcus pneumoniae
7. Streptococcus spp
8. Haemophilus spp
9. Vibrio cholerae
Equipos
1.− Potenciometro pH − metros
2.− Incubadoras
3.− Refrigeradores
4.− Autoclave
5.− Cabinas de bioseguridad
6.−Baño maría
7.−Espectrofotómetro o Fotocolorímetro
8 Vortex (digitador para tubos
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Materiales
1.− Vernier o Regla
2.− Termómetros
3.− Pinza punta plana
4.− Placas petri
5.− Erlenmeyer
6.− Hisopos de Algodón
7.− Tubos con Tapa Rosca
8.− Pipetas
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
Medios de cultivo y reactivos necesarios para la prueba
1.− Agar Mueller Hinton
2.− Caldo Mueller Hinton
3.− Agar Mueller Hinton con 5% de sangre de carnero
5.− Discos de sensibilidad antibiótica
6.− Cloruro de sodio al 0.85%
7.− Ácido Sulfúrico (H2SO4)
Haemophilus test medium (HTM)
PREPARACIÓN DEL AGAR MUELLER HINTON
1.− Preparar el medio a partir de la base deshidratada de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
2.− Autoclavar y dejar enfriar en baño de agua hasta que alcance los 45°C − 50°C.
3.− Una vez esterilizado y solidificado, medir el pH del agar . El valor del mismo debe encontrarse entre 7,2 y
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7,4 a temperatura ambiente. Esta medición puede realizarse:
a. Utilizando un electrodo de superficie
b. Macerando el medio en agua destilada y utilizando un electrodo de inmersión
c. Solidificando el agar con el electrodo del potenciometro
4.− Repartir el medio en placas petri (60 ml − 70 ml o 25 ml − 30 ml, para placas de 150 mm o 100 mm de
diámetro interno respectivamente), de manera que el grosor del agar en la placa sea de 4 mm.
5.− Realizar las pruebas de esterilidad para cada lote de Mueller Hinton, incubando una o dos placas de cada
lote a 30°C − 35°C durante 24 horas o más. Estas placas utilizadas deben ser, luego, descartadas.
PREPARACION DEL INOCULO
Método directo de inoculación a partir de colonias aisladas
a. De una placa de cultivo con agar no selectivo e incubada por 18 − 24 h, seleccionar colonias aisladas en
numero de 4 a 5 colonias similares
b.− transferir estas colonias (obtenidas con una asa de kolle por contacto por la parte convexa o superior de las
colonias ) colocarlas en un tubo conteniendo cerca de 5 ml de solución salina caldo adecuado
c. La suspensión debe ser inmediatamente ajustada a la escala 0,5 de Mc. Farland.
INOCULACIÓN DE LAS PLACAS
1.− Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inóculo, sumergir un hisopo estéril en la
suspensión, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima
del nivel del líquido para remover el exceso de inóculo.
2.− Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tres direcciones para
asegurar una distribución uniforme del inóculo (Figura 1). Antes de colocar los discos dejar Secar la placa a
temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.
APLICACIÓN DE LOS DISCOS
1.− Colocar los discos individuales o multidiscos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril
o la punta de una aguja presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo con la
superficie del agar.
2.− Distribuir los discos uniformemente, de modo que estén a una distancia mínima de 25 mm uno del otro (el
diámetro de los discos según las normas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) debe ser de 6 mm).
No deben colocarse más de 12 discos en una placa de 150 mm, ni más de 6 en una placa de 100 mm de
diámetro interno, para evitar la superposición de las zonas de inhibición. Un disco no debe ser removido una
vez que tomó contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibióticos se difunden rápidamente.
INCUBACIÓN
1.− Incubar lar placas en posición invertida a 35°C dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de los
discos.
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2.− Las placas de Haemophilus spp y Streptococcus spp, deben ser incubadas en atmósfera del 5% de CO2.
3.− Después del tiempo recomendado de incubación (185−24 horas a 37°c ) examinar cada placa y medir los
diámetro de los halos de inhibición alrededor de cada disco. En los casos de Staphylococcus spp y
Enterococcus spp el tiempo de incubación debe prolongarse por 24 horas para una mejor detección de la
resistencia a Oxacilina y Vancomicina, respectivamente.
LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADO
1.− Medir los diámetros de las zonas de inhibición completa (incluyendo el diámetro del disco), usando una
regla o calibrador. Se debe mantener iluminada la parte posterior de la placa petri con una luz reflejada
localizada a unos cuantos centímetros sobre un fondo negro. Tener la precaución de observarla placa
siguiendo una vertical directa para evitar una lectura errónea de las marcas de la regla por efecto de
paralelismo. En los medios suplementados con sangre, las zonas son medidas en la parte superior de la
superficie del agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de la hemólisis sino la de inhibición
del crecimiento.
2.− Para Staphylococcus spp o Enterococcus spp, usar luz transmitida, manteniendo la placa arriba de la luz
para examinar un posible ligero crecimiento de cepas resistentes a Oxacilina/ Meticilina o Vancomicina
dentro de los halos aparentes de inhibición. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibición es indicativo
de resistencia a Meticilina (Oxacilina) o Vancomicina.
3.− El punto final debe tomarse como el área que no muestra un crecimiento obvio, visible, que puede ser
detectado mediante observación visual, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeñas que
puedan ser detectadas solo con mucha dificultad en el borde de la zona. Sin embargo las colonias mayores
creciendo dentro de la zona clara deberán ser subcultivadas, reidentificadas y reensayadas. Algunos Proteus
spp, debido a su gran movilidad, pueden presentar un velo de invasióno swarming dentro de las zonas de
inhibición de algunos antibióticos. En estos casos el velo del swarming debe ser ignorado al momento de
medir los halos de inhibición.
4.− Cuando se prueban discos de Cotrimoxazol puede arrastrarse sustancias antagónicas que producen un
crecimiento con aspecto de niebla dentro de la zona del halo de inhibición, en estos casos no considerar en la
lectura un crecimiento del 20% o menos del desarrollo total.
5.− Los diámetros de inhibición son interpretados basándose en las Tablas N° 1 al 9. La sensibilidad de la
cepa bacteriana será reportada como sensible (S), intermedio (I), o resistente (R).
INTERPRETACION DEL ANTIBIOGRAMA
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
2. MEDIOS DE TRANSPORTE
INTRODUCCION
La correcta recolección de una muestra para su cultivo es posiblemente la etapa mas importante en el
aislamiento de microorganismos responsables de enfermedades infecciosas : sin embargo, los especimenes
bacteriológicos recolectados en hospitales u obtenidos en condiciones ordinarias están sujetos con frecuencia
a considerables demoras antes de que puedan ser inoculados en los medios de cultivo adecuados.
En un medio hospitalario se recomienda un límite de 2 horas entre la recolección de las muestras y su
procesamiento en el laboratorio bacteriológico.
59
En otras circunstancias el tiempo es mayor y el espécimen puede Acercarse causando la muerte de los
microorganismos patógenos o puede permitir que organismos contaminantes como índice de reproducción
mas rápido, cubran el desarrollo de los microorganismos cuando se produce una demora importante entre la
recolección y el cultivo definido.
Los medios de transporte mas frecuentemente utilizados son:
• Cary y blair
• Stuart
• Base de glicerina − solución fisiológica amortiguada
• Ames
Principios y usos
a) MEDIOS DE TRANSPORTE SEGÚN CARY Y BLAIR
Presentado por cary S.G y blair E.B Contiene fosfato disodico como estabilizador de ph, tioglicolato de sodio
como agente reductor para mejorar la recuperación de bacterias anaerobias la pequeña cantidad de agar y el
cloruro de calcio proveen una consistencia semisólida para impedir la oxigenacion y derramamiento durante el
transporte.
Usado para recuperar salmonellas, síguelas, hasta 22 días y yersinia hasta más de 1 mes de muestras fecales.
Nota: una vez depositada la muestra no guardar en la incubadora o refrigeradora, mantener a temperatura
ambiente.
b) MEDIOS DE TRANSPORTE SEGÚN STUART
Stuart R.D.torach S.R y patrulla T.M. propusieron un medio que resulta eficaz en la preservación de la
viabilidad de agentes patógenos de materiales clínicos impidiendo la deshidratación de secreciones como la
oxidación y autodestrucción enzimatica de los gérmenes presentes.
La formula del medio consta de una solución buffer con exclusión de hidratos de carbono, peptona y otros
nutrientes. El tioglicolato de sodio de añade como agente reductor y el agar con el cloruro de calcio provee la
consistencia sólido.
c) MEDIOS DE TRANSPORTE BASE GLICERINA
SOLUCION FISIOLOGICA AMORTIGUADA
Descrita por taegue y clurman y modificada por sachs. Contiene sustancias estabilizadoras de ph, sin
wmbargo el glicerofosfato permite la multiplicación de microorganismos que pueden producir cierta acidez .
toxico para los gérmenes patógenos que se evidencia prontamente gracias al viraje del indicador rojo de fenol
que lleva el medio en su composición.
Usado para el transporte de especimenes fecales, aislamiento de microorganismos entericos.
Nota: las muestras deben ser enviadas directamente al laboratorio bacteriológico.
Composición y preparación
• Medios De Transporte De Cary Y Blair
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Composición
• Fosfato Disodico 1.1g.
• Cloruro De Sodio . 5.0g
• Tioglicolato De Sodio 1.5g.
• Agar 5.0g.
• Agua Destilada 991.0 Ml.
• Cloruro De Calcio (1%) 9.0 Ml.
• Solución Acuosa
pH 8.4
Preparación
• agregar los componentes excepto el cloruro de calcio a un frasco químicamente llimpio.
• calentra agitando frecuentemente hasta que la solución se muestre limpia (clarifique)
• dejar enfriar hasta 50°C.
• Agregar 9 ml. De solución acuosa de cloruro de calcio al 1%
• ajustar el pH a 8.4
Distribuir 7 ml. En tubos de 13 x 100 mm. Previamente enjuagados y esterilizados.
Calentar a vapor fluente 100°C por 15 minutos.
El medio de transporte a un pH 8.4 es usado para el aislamiento de vidrio cholerae a partir de muestras de
heces (hisopado rectal)
Si se debe usar para entero bacterias llevar a ph 7.0 = 0.2
B) Medio De Transporte Según Stuart
Composición
• Cloruro de sodio 3.0g.
• Cloruro de potasio 0.2g.
• Hidrofosfato Disodico Anhidro 1.15g.
• Fosfato Sodico Y Dihidrogeno Anhidro. 0.2g.
• Thioglicolato De Sodio 1.0g.
• Agar 4.0g.
• Agua Destilada Csp . 1000 Ml.
• Cloruro De Calcio (1%) . 10 Ml.
• Solución Acuosa Recién Preparada
• Cloruro De Magnesio (1%)
• Solución Acuosa Recién Preparada 10 Ml.
• Carbón Neutro . 10.0g.
pH 7.3
Preparación
• Agregar el agar con el agua destilada y calentar hasta su competa disolución.
• Agregar el resto de los componentes sólidos excepto el carbón neutro
61
• retirar del calor
• Añada el cloruro de calcio y el cloruro de magnesio
• medir el ph.
• Agregar el carbón neutro.
Distribuir en tubos con tapa rosca de 13 x 100 mm. En volúmenes de 5 a 6 ml. Agitando frecuentemente para
mantener la suspensión del carbon.
Esterilizar a 121 °C por 20 minutos
Antes de que se solidifique, invertir los tubos para distribuir el carbon de manera uniforme.
Guardar en refrigerador.
C) Medio De Transporte Base Glicerina − Solución Fisiológica Amortiguada
Composición
• Cloruro de sodio .. 4.2g.
• Bihidrofosfato potasico anhidro 1.0g
• Fosfato de potasio y dihidrogeno anhidro 3.1g
• Rojo de fenol . 0.003g.
• Agua destilada .. 700.0 ml.
• Glicerol .. 300.0 ml.
pH 7.2
Preparación
• Calentar todos los ingredientes excepto el rojo de fenol y el glicerol
• Agregar el indicador rojo de fenol y homogenizar uniformemente
• Agregar el glicerol
• medir el ph 7.2
Distribuir 7 ml. En tubos rosca de 13 x 100 mm. Y esterilizar a 116°C por 10 minutos.
Si el medio se encuentra amarillo antes de su uso es por que esta contaminado.
MEDIOS DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO Y TRANSPORTE
1. CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO
INTRODUCCION
Los caldos de enriquecimiento se usan para acrecentar el desarrollo de ciertas especies bacterianas .
Inhibiendo o retardando el crecimiento de los microorganismos superfluos. Son utilizados con frecuencia para
el aislamiento de salmonella, siguella, vibrio cholerae de muestras fecales y también de otros materiales
contaminados como aguas residuales.
Los caldos de enriquecimiento actúan sobre la base del principio de que la flora enterica normal es mantenida
en la fase de retardo del desarrollo , mientras que las especies de shiguella y salmmonella son desinhibidas y
entran en una fase logarítmica normal de crecimiento .
62
Así en materiales fecales de portadores de salmonella donde la echerichia coli se encuentra 109/g. se puede
recatar salmonellas cuyo numero de microorganismos pueden ser tan solo 200/gramo de heces.
Toda muestra recolectada deberá ser procesada dentro de un periodo limite de 2 horas, en los casos que las
muestras no puedan ser sembradas o remitidas al laboratorio en este tiempo se requiere de un medio de
transporte.
PRINCIPIOS Y USOS
A) Caldo Selenito
El selenito de sodio retarda el desarrollo de echerichia coli y de otros coniformes, incluyendo muchas cepas de
shiguella.
Se recomienda para el aislamiento de salmonella de muestras de heces, orina o aguas residuales con
abundantes concentración de bacterias mixtas.
Incubación aproximada hasta 24 horas a 37°C resiembra en medios de cultivo selectivo.
B) Caldo Tetraionato
El tetraionto es sintetizado a partir de tiosulfato en el momento que se añade el yodo. El ttetraionato junto con
el tiosulfato excedente inhibe a coniformes y otras bacterias acompañantes.
En cambio todas las bacterias reductoras de tetraionato como salmonella y proteus pueden multiplicarse mas o
menos sin obstáculo . el ácido proveniente de la reducción del tetraionato es neutralizado por el carbonato
calcico.
Las sales biliares inhiben a todos los microorganismos que no necesariamente viven en el intestino.
La adición de verde brillante (0.01 0/00) sirve para inhibir la flora gram positiva.
Incubación aproximada de 18 − 24 horas a 37°C
Resiembra en medio de cultivo selectivo.
C) Caldo Gram Negativo (Gn)
La triptosa sirve como base nutritiva ,el citrato y el desoxicolato actúan inhibiendo el crecimiento de
microorganismos gram positivos, el manitol favorece el crecimiento de salmonella y shiguella. El caldo GN es
menos inhibidor del desarrollo de cepas mas exigente de shiguella .
Incubación aproximada entre 6 horas a temperatura ambiente. Resembrar.
D) Agua Peptonada Alcalina (Apw)
La peptona de carne sirve de fuente nutritiva y el ph alcalino inhibe o retarda el desarrollo de enterobacterias .
Se recomienda para el aislamiento de especies de vibrio de muestras fecales de aguas residuales u otros
alimentos con abundancia en concentración de bacterias mixtas.
Incubación aproximada de 4 − 6 horas a 37°C resiembra de la superficie del medio en agar TCBS.
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E) Caldo De Enriquecimiento Para Estreptococos
Es utilizado para el enriquecimiento selectivo de estreptococos a partir de diversos materiales objeto de
investigación .
La azida y el sulfito inhiben la flora gram negativa acompañante, los gérmenes grampositivos ya son
considerablemente inhibidos por la pequeña concentración de cristal violeta , en tanto que los estreptococos
no resultan aun perjudicados por este motivo.
Composición y Preparación
a) Caldo selenito
composición
• Peptona . 5.0 g
• Lactosa . 4.0 g.
• selenito de sodio . 4.0 g.
• fosfato de sodio . 10.0 g.
• agua destilada CSP. 1000.0g.
ph 7.0 = 0.1
Preparación
• Pesar 33g.para 1000 ml. De agua destilada
• Disolver al calor suave a 60°C.
• Repartir en tubos estériles aproximadamente 10− 15 ml.
No se esteriliza en autoclave , el caldo preparado es claro y ligeramente amarillo o rojizo , si se presenta un
sedimento de color rojo ladrillo de selenio precipitado , el medio de cultivo no es utilizable.
Si se quiere almacenar debe de esterilizarse por filtración, conservar en el refrigerador cubierto y no expuesto
a la luz.
B) Caldo Tetraionato
composición
− Proteosa peptona . 5.0g.
− Sales biliares . 1.0g.
− Carbonato de calcio . 10.0 g.
− Tiosulfato de sodio . 30.0g.
− Agua destilada . 1000.0 ml.
Ph 7.0 = 0.1
Procedimiento
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• Pesar 46g.para 1000 ml. De agua destilada esteril.no calentar el medio.
• Repartir en tubos estériles 10 ml. Aproximadamente y dejar en reposo unos días antes de su uso.
• No esterilizar en autoclave
• Antes de su empleo agregar 0.2 ml. De solución yodada (6g. de cristales de yodo) mas 5g. de yoduro de
potasio en 20 ml. De agua destilada) en cada tubo.
El caldo así preparado debe ser usado el mismo dia.
C).Caldo Gram. Negativo (GN)
Composición
• Triptosa 20.0g.
• Glucosa 1.0 g.
• Manitol 2.0g
• Fosfato dipotasico . 1.5g.
• Cloruro sodico . 5.0g.
• Citrato sodico . 5.0g.
• Desoxicolato sodico . 0.5
• Agua destilada .1000.0ml.
ph 7.0 = 0.2
preparación
• Pesar 39 g. para 1000 ml. De agua destilada
• Disolver al calor
• Distribuya aproximadamente 10 ml. En cada tubo a 60°C.
• El caldo distribuido es claro y amarillento.
Autoclavar a 116°C x 15 minutos.
D) Agua Peptona Alcalina (APW)
Composición
• Peptona de carne 10.0g.
• Cloruro de sodio 10.0g.
• Agua destilada csp 980 ml.
Ph 8.8 = 0.1
Preparación
• Disolver los componentes en agua destilada a 60°C.
• Distribuir en tubos aproximadamente 5−7ml.
• autoclavar A 121°C X15 minutos
el APW eees liogeramente amarillo.
Para muestras de aguas residuales preparar APW 10 veces concentrado.
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E) Caldo De Enriquecimiento De Estreptococos
Composición
• Peptona De Caseina . 14.4g.
• Peptona De Harina De Soja . 5.0g.
• Clna 4.0g.
• Glucosa 5.0g
• Citratop De Sodico 1.0g.
• Cisterna 0.2g.
• Sulfito Sodicpo 0.2g.
• Azida Sindica . 0.2g.
• Violeta Cristal 0.0002g.
Preparación
Disolver los ingredientes a 1000 ml. De agua destilada, distribuir en tubos y esterilizar a 121°C x 15 minutos.
Es utilizado para el enriquecimiento selectivo de estreptococos apartir de diversos materiales, objeto de
investigación.
PREPARACIÓN DE MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
I. Medios Selectivos
Los medios selectivos son aquellos que poseen como parte de sus componentes una variedad de inhibidores en
concentraciones adecuadas que impide el crecimiento de bacterias superfluas.
Por ejemplo. Se emplean para el aislamiento de enterobacterias de importancia médica (Salmonella, Shigella y
otras) a partir de muestras con una flora acompañante diversa. Adicionalmente los medios selectivos llevan
indicadores que evidencian el metabolismo bacteriano facilitando la identificación preliminar del
microorganismo.
1. Agar Mac Conkey
(Gramos / litro)
− Peptona de caseína 17.0
− Peptona de carne 3.0
− Lactosa 10.0
− Sales biliares 1.5
− Cloruro de Sodio 5.0
− Rojo Neutro 0.03
− Cristal violeta . 0.01
− Agar − Agar . 13.5
66
Ph 7.1= 0.1
Este medio se emplea para el aislamiento de Salmonella, Shigella y bacterias coniformes a partir de muestras
clínicas y aguas residuales.
Las sales biliares y el cristal violeta actúan como agentes inhibidores de bacterias Gram. Positivas y de
algunos entericos exigentes. El rojo neutro es el indicador de Ph, que permite determinar los ácidos
producidos de la degradación de la lactosa.
Preparación:
1.− Pesar 50gr del producto deshidratado.
2.− Disolver en un litro de agua destilada. Remojar durante 15 minutos.
3.− Hervir la solución hasta su completa disolución.
4.− Autoclavar a 121°C por 15 minutos
5.− Enfriar a 50°C
6.− Repartir en placas estériles. Aproximadamente 20ml.
2. Agar Salmonella − Shigella (s.s.)
(Gramos / litro)
− Extracto de carne 5.0
− Peptona especial 5.0
− Lactosa 10.0
− Bilis de buey, disecado . .. 8.5
− Citrato de Sodio .... 10.0
− Tiosulfato de Sodio 8.5
− Hierro (III) citrato 1.0
− Verde brillante .... 0.003
− Rojo neutro . 0.025
− Agar − Agar 12.0
ph 7.2 = 0.1
Preparación:
1.− Pesar 60gr del producto deshidratado
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2.− Disolver en un litro de agua destilada.
3.− Dejar remojar por quince minutos.
4.− Someter al calor, agitando frecuentemente hasta ebullición y disolución total.
5.− Enfriar a 50°C
6.− Repartir en placas petri estériles aproximadamente 20 ml.
7.− El medio no necesita ser autoclavado.
3. Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Xld)
(Gramos/ litro)
− Xilosa 3.5
− Lisina 5.0
− Lactosa 7.5
− Sacarosa 5.0
− Cloruro de sodio 5.0
− Extracto de levadura . 3.0
− Desoxicolato de sodio 2.5
− Tiosulfato de sodio 6.8
− Amonio y hierro (III) 0.8
− Rojo de fenol . 0.08
− Agar − Agra . 13.5
ph.7.4
Este medio de utiliza principalmente para el aislamiento y diferenciación de bacterias enterópatógenos,
especialmente salmonella, shigella, y arizona.
El agar XLD permite las siguientes reacciones de diferenciación:
• Degradación de la xilosa, lactosa y sacarosa a ácido (viraje amarillo del indicador de ph rojo de
fenol).
• La descarboxilacion de la lisina a cadaverina(color rojo púrpura alrededor de la colonia).
• El tiosulfato sirve como indicador de la formación de sulfuro de hidrogeno(colonias con precipitado
negro)
El viraje puede variar desde el amarillo hasta el rojo durante el curso de una incubación prolongada.
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Preparación:
1.− Pesar 55gr del producto deshidratado.
2.− Disolver en un litro de agua destilada.
3.− Dejar remojar por 15 minutos.
4.− Calentar rápidamente hasta ebullición por unos segundos.
5.− Enfriar rápidamente en agua fría a unos 50°C.
6.− Repartir en placas petri estériles aproximadamente 20 ml.
El medio en estado sólido tiene un color rojizo.
4. Agar Emb (Eosina − Azul De Metileno)
(Gramos/ litro)
− Peptona 10.0
− Hidrogeno fosfato dipotasico 2.0
− Lactosa 5.0
− Sacarosa 5.0
− Eosina amarillenta 0.4
− Azul de metileno 0.07
− Agar 13.5
ph7.1 = 0.1
Los gérmenes Gram positivos son inhibidos en su crecimiento gracias a la presencia de los colorantes: Eosina
y azul de Metileno.
El contenido en lactosa y sacarosa hacen posible la distinción de Salmonella, shigella lactosa negativa y
sacarosa negativa, frente a otra flora acompañante lactosa negativa pero sacarosa positiva como citrobacter.
Proteus vulgaris, Aeromonas hydrophila.
La E. coli se observara con un brillo metálico positivo sobre un crecimiento de colonias de color violeta.
Salmonella y Shigella no presentaran brillo metálico y sus colonias se observara transparentes.
Preparación:
1.− Pesar 36gr
2.− Disolver en un litro de agua destilada. Dejar remojar por 15 minutos.
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3.− Hervir hasta su completa disolución.
4.− Autoclavar a 121°C por 15 minutos.
5.− Enfriar a 50°C
6.− Repartir en placas petri estériles aproximadamente 20 ml.
5. TCBS (Agar Tiosulfato − Citrato− Sales Biliares − Sacarosa)
(gramos/ litros)
− Peptona de caseína .. 5.0
− Peptona de caren .. 5.0
− Extracto de levadura .. 5.0
− Citrato de sodio .. 10.0
− Tiosulfato de sodio .. 10.0
− Bilis de buey, disecada . 5.0
− Colato de sodio . 3.0
− Sacarosa . 20.0
− Citrato de hierro (III) . 1.0
− Agar . 14.0
− Azul de timol .. 0.04
− Azul de bromotimol .. 0.04
ph 8.8 = 0.1
Este medio se emplea preferentemente para el aislamiento de Vibrio Cholerae.
Las elevadas concentraciones de tiosulfaro y citrato, asi como el medio fuertemente alcalino. Inhiben
notablemente a als enterobacterias. Solo algunas cepas sacarosa positivas pueden desarrollar entre ellos
proteus y yersinia.
La bilis de buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos.
El indicador mixto azul de timol − azul de bromotimol presentan viraje al amarillo por la formación de ácido.
Las colonias de V. cholerae sacarosa positiva se observaran de color amarillo. Mientras que para el V.
parahaemolyticus sacarosa negativas serán verdes azulado.
Preparación:
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1.− Pesar 88gr del producto deshidratado.
2.− Disolver en un litro de agua destilada, remojar durante 15 minutos.
3.− Hervir hasta su completa disolución.
4.− No esterilizar en autoclave
5.− Enfriar hasta 50°C .
6.− Repartir en placas petri estériles, aproximadamente 20 ml.
6. Agar Hipertonico Según Chapman
(Gramos/litro)
− Peptona 10.0
− Extracto de carne 1.0
− Cloruro de sodio 75.0
− D(−) manitol 103.0
− Agar 12.0
− Rojo de fenol 0.025
ph 7.4 = 0.1
Debido a la concentración extremadamente alta de sal, permite solamente el crecimiento de microorganismo
tolerantes a ella, entre los que se encuentra el genero Staphylacoccus.
La degradación del manitol con formación de ácido esta notablemente correlacionada con la patogenicidad del
germen.
El metabolismo del manitol se evidenciara por la viracion a amarillo del indicador rojo de fenol.
Preparación:
1.− Pesar 108gr por litro del producto deshidratado.
2.− Disolver en un litro de agua destilada, remojar durante 15 minutos.
3.− Hervir hasta su completa disolución.
4.− Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.
5.− Enfriar a 50°C .
6.− Repartir en placas petri estériles aproximadamente 20 ml.
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7. AGAR DCLS(Agar desoxicolato − citrato− lactosa − sacarosa)
(Gramos / litro)
• Peptona de carne . 5.5
• Extracto de carne 5.0
• Lactosa .10.5
• Sacarosa 10.5
• Citrato de sodio 2 − hidratado 6.0
• Tiosulfato de sodica . 4.0
• Desoxicolato de sodio .. 3.0
• Citrato de amoniio y hierro III. 1.0
• Rojo neutro . 0.02
• Agar 13.0
Ph 7.5 = 0.1
Agar selectivo para el aislamiento y diferenciación de enterobacterias patógenas.
La presencia de desoxicolato y citrato inhiben a la flora gram positiva, la degradación de la lactosa y sacarosa
se manifiesta por el viraje del indicador rojo neutro al rojo.
Las colonias de salmonella y shiguela se conservaran incoloras con le centro negruzco.
Preparación:
1.− Pesar 57gr. Por litro de producto deshidratado
2.− Disolver en un litro de agua destilada , remojar durante 15 minutos .
3.− Hervir hasta su completa disolución
4.− No esterilizar en autoclave
5.− Enfriar a 50°C.
6.− Repartir en placas petri estériles. Aproximadamente 20 ml.
8. Agar Enterico De Hektoen
Composición :
• Peptona Proteosa .. 12g.
• Sales Biliares .. 9g.
• Extracto de Levadura 3g.
• Lactosa 12g.
• Salicina 2g.
• Sacarosa . 12g.
• Cl Na 5g.
• Tiosulfato de sodio 5g.
• Citrato ferrico de amonio .. 1.5g.
• Agar .. 14 g.
72
• Fuccina acida .. 0.1g.
• Azul de bromotinol .. 0.065g.
• Agua destilada . 1000 ml.
Preparación:
Preparar una suspensión con 70 g. de medio deshidratado, si se usa el producto comercial en 1000 ml. De
agua destilada, calentar hasta el punto de ebullición y continuar hasta que el medio se disuelva, no poner en
autoclave.
Enfriar hasta 50°C. y volcar en placas petri.
Este medio resulta útil para el aislamiento y diferenciación de bacterias patógenas entericas gram negativas.
Las coliformes generalmente aparecen de color salmon o anaranjado , mientras que salmonella y siguella
muestran un color verde azulado.
9. Agar Selectivo Para Campylobacter
Composicion:
• Peptona proteica 21g.
• Electrolitos 5g.
• Almidón soluble 1g.
• Agar 13g.
• Agua destilada 1000 ml.
Ph 7.3 0.1
Preparación:
Disolver y autoclavar a 121°C por 15 min. Dejar enfriar a 40° C − 50° C. incorporar de 50− 70 ml. De sangre
desfibrinada y un frasco de suplemento selectivo por cada 200ml. De medio de cultivo, verter en placas
estériles.
Suplemento :
− vancomicina . 2.0 mg.
− polimixina . 500mg.
− trimethoprim ....... 1.0 mg.
Disolver el liofilizado en 2 ml. De agua destilada estéril, este medio es usado para el aislamiento de
campylobactter a partir de material clínico así como el procedente de alimentos contaminados.
Es un medio rico en nutrientes y los antibióticos añadidos como suplemento selectivo inhiben
considerablemente la flora acompañante.
II. MEDIOS DIFERENCIALES
Todas las bacterias requieren después de su aislamiento primario ka identificación de especie ,para ello es
necesario determinar características metabólicas adicionales, empleando medios diferenciales , con los cuales
73
poseen dentro de sus ingredientes carbohidratos ,aminoácidos y otros sustratos que van a ser utilizados por el
microorganismo ,siendo interpretados posteriormente por el profesional calificado correspondiente del
laboratorio de microbiología.
Existen muchos tipos de medios diferenciales, en la practica se preparan algunos de estos.
1. Agar Hierro Tres Azucares
(Tsi = Triple Sugar Iron)
(Gramos/ litro)
− Extracto de carne 3.0
− Extracto de levadura . 3.0
− Peptona de caseina .. 15.0
− Peptona de carne 5.0
− Lactosa 10.0
− Sacarosa 10.0
− Glucosa 1.0
− Citrato ammoniio ferrico.... 0.5
− Cloruro de sodio 5.0
− Tiosulfato de sodio . 0.5
− Rojo de fenol 0.024
− Agar− agar . 12.0
ph 7.4 = 0.1
• Este medio de diferenciación bioquímica, se utiliza para identificar alas bacterias gran negativas por
géneros y especies.
• La degradación del carbohidrato con formación de ácido se comprueba por el viraje del indicador rojo
de fenol a amarillo y una alcalinización por un viraje hacia rojo oscuro .
• La degradación de la glucosa a ácido produce cambio de color solo en la zona columnar del medio ,
pues debido a su baja concentración con la escasa cantidad de ácido producido en la superficie
inclinada del agar se evapora rápidamente .
• Si , en cambio son degradadas la lactosa y sacarosa , que se encuentren en mayor proporción . se
observa un viraje de color amarillo en todo el tubo .
• El Tiosulfato de sodio se reduce por acción de algunas bacterias a sulfuro de hidrogeno. el cual
reacciona con la sal ferrica produciendo H2S , un precipitado negro .
La formación de grietas o cavidades en el medio , indican la formación de gas (Co2) por la degradación del
azúcar .
74
Preparación :
1. Suspender 65 gr del producto deshidratado en un litro de agua destilada o desmineralizada .
2. Remojar durante 15 minutos
3. Hervir hasta la completa disolución
4. Distribuir en tubos 13*100 aproximadamente de 3 a4 ml .
5. Esterilizar al autoclave a 121°C por 15 minutos.
6. Después de la esterilización. Colocar los tubos en posición inclinada, procurando que la zona columnar y la
superficie (pico flauta) tengan la misma longitud. Aproximadamente 3 cm
El color del medio de diferenciación es rojo naranja.
2. Agar Citrato Según Simmons
(Gramos/litro)
• Amonio dihidrogefosfato 1.0
• Hidrogenofosfato dipotasico ... 1.0
• Citrato de sodio 2.0
• Cloruro de sodio 5.0
• Sulfato de magnesio 0.2
• Azul de bromotimol 0.08
• Agar − agar . 12.0
• PH 6.9 = 0.1
El medio se emplea para la diferenciación bioquímica de bacterias . la degradación del citrato produce una
alcalización del medio que se reconoce por el viraje de color verde a azul oscuro del indicador de pH del azúl
de bromotimol .
Preparación:
• Suspender 65gr del producto deshidratado en un litro de agua destilada o desmineralizada.
• Remojar durante 15 minutos .
• Calentar hasta la ebullición , agitando con frecuencia hasta la completa disolución .
• Esterilizar al autoclave a 121°C por 15 minutos .
• Distribuir en tubos de 13 x 100 aproximadamente de 3 a 4 ml.
3. AGAR UREA Según CHRISTENSEN ( Basal)
(Gramos /litro)
• Peptona especial 1.0
• Glucosa .1.0
• Cloruro de sodio ... 5.0
• Dihidrogenofosfato potasico.. 2.0
• Rojo de fenol .0.012
• Agar − agar .12.0
75
pH 6.8 = 0.1
Solución de Urea
• Urea 40.0
• Agua destilada1 litro
Esta solución se esteriliza por filtración.
• Este medio se utiliza para la diferenciación de microorganismos es hidrolizada a dióxido de carbono y
amoniaco.
• El amoniaco produce alcalinización del medio, lo cual se demuestra por el viraje del rojo del fenol de
amarillo a rosado intenso .
Preparación:
• Disolver 21 gr del producto deshidratado en 950 ml de agua destilada o desmineralizada .
• Remojar durante 15 minutos .
• Hervir hasta la disolución total .
• Autoclave a 121°C por 15 minutos .
• Antes de su uso añadir 50 ml de la solución de urea al 40% al medio del cultivo fundido y enfriado hasta
uno 55°C bajo condiciones estériles . mezclando homogéneamente .
• Distribuir en tubos de 13 x 100 aproximadamente de 3 a4 ml solidificando en plano inclinado.
• Caldo Peptonado (Prueba De Indol)
(Gramos/litro)
• Peptona 20.0
• Cloruro de sodio .10.0
• Agua destilada 1000.0 ml
El medio es empleado para la diferenciación de muchas especies de bacterias que degradan el triptofano por
acción de la enzima triptofanasa .
El producto metabólico detectado al agregar el reactivo de kovac o de Ehrlich es el Indol.
Preparación:
• Disolver los ingredientes por calentamiento. hasta la clasificación del medio .
• Enfriar a 50°C
• Autoclavar a 15 lb de presión por 15 minutos.
• Repartir el medio en tubos estériles de 13 x 100 aproximadamente de 3 a 4 ml.
Para la interpretación del producto metabólico producido por el microorganismo se requiere del siguiente
reactivo :
Reactivo de Kovac
• Alcohol amilico .150.0 ml
• p − dimetil aminobenzaldehido ..10.0 g.
• Ácido clorhídrico 50.0 ml.
76
• CALDO MR− VP(rojo de metilo − voges proskauer)
Composición :
• Peptona especial 7.0
• Glucosa .5.0
• Fosfato dipotasico.5.0
ph 6.9= 0.1
Con este medio se realizan dos tipos de pruebas bioquímicas : rojo de metilo y voges proskauer ; dichas
pruebas sirven para poder identificar a diversos microorganismos.
Preparación:
• Disolver 17g. del producto deshidratado en un litro de agua destilada.
• Disolver por ligero calentamiento.
• Distribuir en tubos de 13 x 100 aproximadamente 5ml.
• Esterilizar al autoclave a 121°C X 15 minutos.
• Reactivo Rojo de Metilo
• Rojo de metilo 0.1g.
• Alcohol etilico 300.0ml.
la prueba de rojo de metilo sirve para identificar la formación de acidos fuertes a partir de glucosa.
• Reactivo de Voges − Proskauer
− Alfa naftol . 5.0g.
− Alcohol etilico absoluto 100.0ml.
− Hidroxido de potasio . 40.0g.
− Agua destilada . 100.0ml.
la prueba de Voges − Proskaeur sirve para identificar la formación de acetoina a partir de glucosa.
• Agar Lisina Hierro
(Gramos / litro)
• Peptona de gelatina . 20.0
• Extrcto de levadura .. 10.0
• Glucosa 1.0
• L− lisina 10.0
• Citrato ferrico de amonio . 0.5
• Tiosulfato de sodio . 0.04
• Purpura de bromocresol . 0.02
• Agar − Agar . 13.5
Ph 6.7= 0.1
77
Este medio se emplea para la diferenciación bioquímica de los bacilos entericos y microorganismos afines en
el cual Podemos observar la decarboxilacion de la lisina,la diseminación y producción de hidrogeno sulfurado.
El Agar lisina − hierro tiene incorporado el indicador de ph purpura de bromocresol.oscilando el rango de ph
entre 5.2 (amarillo) y 6.8 (purpura). Las bacterias que decarboxilan la lisina , elevan el ph del medio debido a
la producción de amina tornándose el medio de color purpura el en fondo del tubo es color amarillo producto
de la acidez de la glucosa.
En la diseminación de la Lisina , la acción sobre el aminoácido producirá un complejo desconocido que
alcanzara el medio formándose un complejo anaranjado que al combinarse con el indicador da un color rojo
en el tubo.
La producción del hidrogeno sulfurado se detecta debido al tiosulfato de sodio y mediante el indicador que es
el citrato ferrico de amonio, se produce un precipitado negro insoluble (H2S).
Preparación:
1.− Disolver 33 g del producto deshidratado en un litro de agua destilada.
2.− Dejar embeber por 15 minutos.
3.− Disolver por calentamiento agitando con frecuencia.
4.− Distribuir en tubos de 13 por 100 y autoclavaza a 15 Ib de presión por 15 minutos.
5.− Enfriar en plano inclinado.
7. Agar Esculina
(Gramos/litros)
− Esculina .. 1g
− Citrato ferrico .. 0.5g
− Agua peptonada 1000 ml.
− Agar 20 g
Disolver la esculina,la sal de fierro y el agar en el agua peptonada. Esterilizar a 115°C por 10 minutos.
8. Leche Tornasolada
− Leche desnatada en polvo 100g
− Tornasol 5g
− Agua destilada 1000ml
colocar en autoclave durante 10 minutos a 10 Ibs.
El color rosado del tornasol indica una reacción ácida provocada por la fermentación de la lactosa.un color
78
purpura o azul (alcalina) indica que no hay fermentación de la lactosa. El color blanco (reducción) resulta
cuando el tornasol sirve como aceptor electrónico y es reducido a su leucobase. La coagulación es causada por
la precipitación de la caseina por el ácido producido a partir de la lactosa.
También puede provocar la coagulación por la conversión de la caseina en paracaseina por la enzima renina.
La peptonizacion (disolución del coagulo) indica la digestión del cuajo o proteinas de la leche por las enzimas
proteoliticas.
9. Medio De Gelatina Diluido
Composición:
− Gelatina .. 4g
− Agua destilada .. 1000ml
Distribuir en tubos, colocar en autoclave a 121°C durante 5 minutos.
10. Medios De Gelatina
Composición:
− Gelatina .. 12g
− Caldo BHI .. 1000ml
calentar en baño maría hasta disolver completamente la gelatina. Ajustar al ph a 7.0
Colocar en tubos y autoclavar a 121°C por 15 minutos.
ANEXOS
ANEXO A :
METABOLISMO BACTERIANO SIEMBRA, LECTURA E INTERPRETACION DE PRUEBAS
DIFERENCIALES
Introducción
La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de las características de las
colonias y morfología con tinción gram u otras coloraciones. Sin embargo la caracterización final de un
aislamiento bacteriano desconocido. Para identificarlo a nivel de genero y especie habitualmente se lleva a
cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y sirvan como marcadores de
identificación.
En el laboratorio estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando un apequeña porción de la colonia
bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos e indicadores
químicos que permiten detectar cambios del ph o la presencia de subproductos específicos.
La identificación de muchas bacterias fermentadoras y no fermentadoras se ha visto facilitada por el uso de
sistemas instrumentales autorizados ,por medio de las cuales los microorganismos se identifique con los
79
códigos numéricos computarizados. Estos sistemas permiten tener resultados en el menor tiempo posible y
son de menor costo. Entre estos se conocen API. Enterotube oxi/ferm.micro− Id, mintek, etc. Existe también
otros sistemas de identificación como Microscan, Sceptor, autobac IDX, Automicrobic ( AMS), etc.
ACCIÓN SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO
Por definición la fermentación es un proceso metabólico de oxido reducción que ocurre en un medio ambiente
anaeróbico, y en lugar de oxigeno un substrato orgánico sirve como aceptor final de hidrogeno ( electrones.
Este termino de fermentación es utilizado comúnmente para referirse a la utilización de hidratos de carbono
por las bacterias. Esta pueden utilizar desde polisacáridos como el almidón, la celulosa hasta monosacáridos
como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.
Las bacterias de diferencias por los hidratos de carbono que utilizan los tipos y cantidades de ácidos mixtos
producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible por el cambio de color en el
medio de cultivo de fermentación, la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.
Materiales:
• Método de cultivo semisólido con lactosa e indicador de PH ( rojo fenol)
• Medio de cultivo semisólido con glucosa indicador de PH ( rojo de fenol)
Procedimiento:
• Seleccionar en la placa con medio sólido una colonia totalmente aislada, la cual ha desarrollado a 37° C por
18−24horas.
• Con ayuda del asa d siembra en punta tomar una pequeña porción de la colonia seleccionada y transferir a
cada uno de los tubos por el método de siembra por puntura.
• Rotula los tubos con el numero de la cepa bacteriana y la fecha.
• Incubar el material en la estufa a 37° C 18−24 horas.
Nota: No olvidar de esterizar el asa de siembra antes y después de casa siembra.
Interpretación
• Cuando la bacteria a degradado el hidrato de carbono se produce un cambio de color en el medio de cultivo,
inicialmente anaranjado− amarillo y luego a amarillo debido a la presencia de productos metabolicos y los
cuales se detectan por la inclusión del indicador de PH rojo fenol, cuyo rango de viraje esta entre 6.8 (
amarillo) y 8.4 ( rojo).
• Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar un subproducto metabólico a CO2 e H+ ( ejemplo el
ácido formico) se observara la presencia de gas,en forma de burbujas.
• Si se utilizan medios líquidos deberá colocarse dentro del tubo, tubos de durharn invertidos. Temiendo
estos la ventaja de detectar cantidades muy pequeñas de gas.
PRODUCCIÓN DE ACIDOS Y ACETIL − CARBINOL
Prueba De Rojo De Metilo (RM)
La prueba de rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característica valiosa para
identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes ( lácticos, acético, formico) a partir de glucosa.
Estas bacterias que primariamente siguen la vida de fermentación de ácidos mixtos frecuentemente produce
suficiente ácido después de una incubación prolongada como para mantener el PH por debajo de 4.4 ( el punto
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ácido limite del indicador de rojo de metilo) superando el sistema amortiguador del ph del medio.
Prueba De Voges Proskauer ( VP)
El ácido peruvico un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de la glucosa es
metabolizado por algunos microorganismos produciendo el acetil−meti−carbonil (acetona) un subproducto
neutro de la via 2.3− butilenglicol.
La prueba se basa en la conversión del acetil−metil−carbonil en diacetil a través de la acción de KOH y
oxigeno atmosférico. El diacetilo es convertido en un concepto rojo bajo acción catalítica de alfa naftol y
Cratina.
Materiales:
• Cepa bacteriana control MR positivo y negativo
• Cepa bacteriana control positivo y negativo
• Reactivo de rojo de metilo
• Reactivo de voges−porskauer.
Procedimiento:
• Por la técnica de inoculación sembrar independientemente la cepa control MR positivos y negativos en el
medio rotular los tubos e incubar durante 48− 72 horas 37 ° C
• Proceder del mismo modo con las capas VP controles incubar 18−24 horas.
Interpretación
• Para la prueba el rojo de metilo.añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre cuyo rano de
virajes esta entre PH 4.4 ( rojo) y 6.0 ( amarillo), la prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la
negativa de color amarillo naranja,
• Para la prueba de Voges − ProsKauer, agregar al cultivo 0. 6 ml (12gotas) de alfa naftol y 0.2ml (4gotas) de
KOH. Agitar el tubo por 1minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es importante añadir los
reactivos.
Una prueba positiva color rojo localizado en la mitad superior o en todo tubo es observada dentro de los
primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora los cultivos pueden presentar un color
cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva.
En la perte negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
PRINCIPIOS BIOQUIMICOS DE LAS REACCIONES EN TSI (triple sugar iron)
Este medio fue diseñado para la diferenciación de bacilos de Gram. negativos, basándose en la capacidad
potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrogeno (H2S).
el medio contiene tres azucares: glucosa,lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente. Para
detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de Ph que es el rojo fenol cuyo rango de viraje
esta entre Ph 8.4(rojo) y ph6.8(amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos gram negativos ante los carbohidratos presentes en este medio
pueden ser fundamentalmente tres:
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1.− Fermentación de glucosa únicamente
2.− Fermentación de glucosa + galactosa + sacarosa o glucosa + ambos.
3.− No fermentación de carbohidratos.
Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta como
pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que
al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfato ferroso (FeS)
Material
− Tubo con medio TSI en plano inclinado.
Procedimiento
1.− Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estire la superficie
del pico de flauta.
2.−Rotular e incubar a 37°C por 18 − 24 horas.
Interpretación
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.
1. Producto de h2s ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentación de la glucosa únicamente(rojo/ amarillo). Esto se debe a la glucosa(que se encuentra en baja
concentración con respecto a los otros azucares), ha sido utilizada y la cantidad de ácido producido no es
suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilización de la peptonas: además los
ácidos pueden se utilizados.
Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no esta
en contacto con el oxigeno, solo hay fermentación y en medio permanece ácido
3. fermentación doble o triple de carbohidratos: (amarillo/ amarillo). La fermentación de la glucosa y alguno
(o ambos) de los otros 2 azucares produce gran cantidad de acidos; por lo que el tubo permanece amarillo.
4. no fermentación de carbohidratos: (rojo/ anaranjado). Se presenta únicamente utilización oxidativa de
peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. producción de gas: formación de burbujas (CO2 e H +) GRIETAS O desplazamiento del medio.
PRUEBAS DE OXIDACION − FERMENTACION (OF según Hugh y Lefson)
El termino de no fermentacion se refiere aun grupo de bacterias gram negativas aerobias, no esporuladas; que
son incapaces de utilizar hidratos de carbono como fuente de energía que los degradan por la vía oxidativa de
la glucosa son sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio mas sensible, como el de Hugh
y Heifson (medio QF9).
82
Principio
El medio QF se Hugh y Lefson difiere de los medios convencionales de fermentación de carbohidratos en que
la concentración de :
1. Las proteínas han sido disminuidas del 1% al 0.2 %.
2. Los hidratos de carbono esta aumentada del 0.5% al 1%.
3. el agar esta disminuido 1.5% a 0.2 % por lo cual su consistencia es semisólida.
La menor concentración de proteínas reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar las
pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo.
La mayor concentración de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción de ácido.
La consistencia semisólida permite que los ácidos formados en la superficie difundan por todo el medio
facilitando la observación del viraje del indicador de pH.
Este medio también permite determinar la movilidad de las bacterias.
Materiales
− Cepa control OF positiva y negativa.
− Tubos con medio OF.
− Parafina liquida estéril.
Procedimiento
Se requieren dos tubos para la prueba OF.
1. Inocular con el asa de siembra en punta. Hasta llegar casi al fondo del tubo.
2. Cubrir un tubo de cada par con una capa de 1cm con la parafina liquida estéril, dejando el otro tubo abierto
al aire.
3. Rotular los tubos e incubar ambos tubos a 37°C durante 48 horas o más.
Interpretación
La producción de ácido se detecta en el medio por la aparición de color amarillo.
En el caso de organismos oxidativos la producción de color se puede notar primero cerca de la superficie del
medio.
Para las especies de desarrollo muy lento puede requerirse de una incubación de tres días o mas para detectar
reacciones positivas, como por ejemplo Moraxella spp.
ACCION SOBRE LAS PROTEINAS
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Producción de sulfato de hidrogeno (H2S)
Esta es una prueba bioquímica importante para la identificación bacteriana. Algunas bacterias poseen sistemas
enzimáticos productos de sulfato de hidrogeno.
La producción de H2S puede detectarse en medios aptos que aseguren el crecimiento de la bacteria en estudio
y que tengan:
♦ Una fuente de azufre, como los aminoácidos cisterna y metionina o el tiosulfato de sodio.
♦ Un indicador incluido en el medio o tiras de papel embebidas con este. El citrato ferrico, e
sulfato ferroso, el citrato de hierro o amonio, hierro peatonizado y el acetato de plomo son los
mas comúnmente usados.
Materiales
− Cepa control H2S positivo y negativo.
− Tubo con agar y peptona en plano inclinado, contenido el indicador subacetato de plomo.
Procedimientos
1. Por la técnica de puntura y estría sembrar separadamente en el medio la cepa control H2S positiva y
negativa.
2. Rotular el tubo e incubar a 37°C por 18 − 24 horas.
Interpretación
La secuencia que lleva a la producción de H2S es la siguiente :
1. Liberación del sulfato de cisterna o tiosulfato por acción enzimatica bacteriana.
2. Acople del sulfuro (S−2) con un ron hidrogenado (H+) para formar H2S.
3. Detección de H2S por hierro o plomo para producir sulfuros con metales pesados insolubles que se
observan como un precipicio negro insoluble.
Si se usa Tiras de papel este precipitado aparecerá en el extremo del mismo.
El ennegrecimiento se ve primero en medios, donde la formación de ácidos es máxima, es decir, a lo largo de
la línea de inoculación en la profundidad del agar inclinado o en el centro de colonias que creen en superficies
de agar.
PRODUCCION DE INDOL
Las bacterias que posen la enzima triftofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido triptofano,
produciendo indol, un benzil, pirrol, ácido piruvico y amoniaco (NH3). El indol puede detectarse en un medio
rico en triftofano, observando la aparición de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de
papel),luego de agregar una solución que contiene demitilaminobezaldehido.
En la practica puede emplearse medios combinados como el SIM (sulfato − indolmotilidad) NIO(motilidad −
indol− ornitina)indol−nitrato o medio solo para detectar el indol.
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Materiales
− Cepa control indol positivo y negativo
− Medio liquido peptonado
− Reactivo de Kovac (alcohol amilico + HCL concentrado + p −dimetillaminbezaldehido).
Procedimiento
1. Sembrar las cepas control indol + y por la técnica de inoculación en el medio de caldo peptonado.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18 − 24 horas.
3. Agregar unas gotas del reactivo de K ovac. Dejando resbalar por la pared.
Interpretación
La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos después de
haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y construye una prueba positiva. Las
bacterias que a pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo este
aparecerá sin cambio alguno siendo esa una prueba negativa.
UTILIZACION DEL CITRATO
Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae, las
cuales pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de los carbohidratos utilizando el citrato de
sodio como única fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo; por lo tanto, cualquier medio que se
emplee para determinar esta característica no debe contener proteínas ni carbohidratos.
El citrato de sodio es una sal de acido citrico compuesto orgánico simple que construye unos de los
metabolismos del ciclo de Krebs.
Principio
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formación
de subproductos de alcalinos.
El medio(citrato de simmos) incluye citrato de sodio, un anion como única fuente de carbono y fosfato de
amonio como única fuente de nitrogeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con
producción de amoniaco(NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en hidróxido de amonio
(NH4OH), detectándolo con el indicador de ph incorporando el azul de bromotidol cuyo rango de viraje esta
entre Ph 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
Materiales
− Cepa el control citrato negativo y positivo.
− Medio de citrato de Simmos en plano inclinado.
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Procedimiento
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnica de estría en cada tubo la cepa citrato + y −.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18 − 24 horas.
Interpretación
Prueba Positiva: color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio inclinado.
Prueba Negativa: no hay cambio de color ni crecimiento.
La prueba es también positiva si existe un desarrollo visible de colonias a lo largo de la estría de la siembra,
esto es posible debido a que para que el desarrollo del organismo sea visible debe encontrarse en fase
logarítmica, lo cual es posible solo si el carbono y nitrógeno han sido asimilados. Para la confirmación de la
prueba el cultivo deberá incubarse 24 horas mas en que aparecerá el color azul.
La aparición del color amarillo en al zona de la siembra se interpreta como negativo y es producto en un
medio inoculo denso.
PRODUCCION DE UREASA.
Una prueba importante usada para la identificación de especies.
Muchas especies de bacterias producen la enzima ureasa que hidroliza la urea según la siguiente reacción
bioquímica:
o
NH2 −C−NH2 + 2HOH CO2 + H2O + 2NH . (NH4)2CO2
UREASA
El amoniaco reacciona en solución para dar carbonato de amonio produciendo una alcalinización y un
aumento de ph del medio.
Materiales
− Cepa patrón ureasa negativa y positiva
− Medio de urea según Christensen.
Procedimiento
1. Por la técnica de estría, sembrar la cepa positiva y negativa, no inocular el fondo.
2. Rotular e incubar durante 18 − 24 horas a 37°C .
Interpretación
Prueba Positiva: color rosado en la superficie o en todo el tubo.
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Prueba Negativa: el medio permanece del color original.
Los microorganismos que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 o 2 horas:
las especies menos activas pueden requerir 3 o mas días.
PRUBA DE CATALASA
La catalasa es un tipo de enzima que poseen las bacterias aerobias y facultativa anaerobias.
El peroxido de hidrogeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los
carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el peroxido de hidrogeno en agua y oxigeno de acuerdo a la siguiente reacción:
2H2O2 . 2H2O + O2
la prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativo) de los
estafilococos (catalasa positiva).
Medios Y Reactivos
• Peroxido de hidrogeno (H2O) al 3%: se prepara a partir del H2O2 al 30% diluyendo con agua destilada .
este reactivo es muy inestable que cuando se expone a la luz se descompone fácilmente debe almacenarse
en refrigeración y en botella ámbar y chequearse justo antes de su uso con los controles positivos.
• Medios de cultivo: cualquier medio sólido no inhibitorio y sin sangre ya que los eritrocitos poseen actividad
de catalasa , por lo que su presencia puede dar resultados falsos positivos.
Prueba en Lámina
a) Con el agua asa bacteriológica en punta o un aplicador estéril, picar el centro de una colonia bien aislada y
transferir el inoculo a un porta objeto limpio.
b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
d) Descartar la lamina en un recipiente con desinfectante.
Prueba en Placa o Tubo con Agar
a) Añadir unas gotas del reactivo al 3% directamente sobre las superficie donde hay crecimiento.
b) Observar si se forma burbujas de inmediato.
Precauciones
• El orden de la prueba en lamina no debe invertirse cuando se use asa de platino. Ya que puede resultar falso
positivo. El alambre de Nichrone no interfiere en el resultado de la prueba.
• La prueba debe realizarse en cultivos de 18 − 24 horas: cultivos mas viejos pueden perder su actividad de
catalasa dando una reacción falsa negativa.
• El H2O es extremadamente cáustico por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que ocurra inundar
el área afectada con el alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO DEBE USARSE AGUA.
87
Interpretación
Prueba Cualitativa: la aparición rápida y prolongada de burbujas de gas o efervescencia son indicativas de
catalasa + algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2 , dando pocas
burbujas diminutas durante 20 − 30, esta son catalasas positivas.
CITOCROMO OXIDASA
Los citocromos son hemoproteinas que contienen hierro y actúan como el ultimo eslabón de la cadena
respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H−) al oxigeno.
Conformación de agua, el sistema citócromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios
facultativos permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados.
Principio
En bacteriología se puede terminar su presencia , al hacer reaccionar una población bacteriana con un sustrato
oxidable como el dimetil o tetrametil − p− fenillendiamina o discos o tiras de oxidasa y el resultado observado
es la aparición de color que va de rosado al púrpura.
Material
• Cepa control, citocromo oxidasa positiva y negativa, sembrada en placa de agar nutritivo.
• Reactivo de oxidasa.
Procedimiento
La prueba se lleva a cabo por dos métodos:
Técnica Directa
En placas, en las cuales se añade directamente 2 o 3 gotas del reactivo a las colonias bacterianas aisladas.
Técnica Indirecta
En discos o tiras de papel embebidos con el reactivo y se extiende un asada de la colonia sospechosa.
Interpretación
Las colonias bacteriana son actividad citoicromo oxidasa desarrolla en segundos un intenso color azul en el
sitio de inoculación.
La reacción debe observarse UNICAMENTE en la colonia y no alrededor de esta.
ANEXO B:
Muestra de
Heces frescas
Agar verde brillante
88
Cary Blair
(mx por hisopado rectal)
caldo Selenito
tetrationato o tioglicolato
Xld Agar
MAC Conkey
Salmonella Shigella
pruebas bioquímicas
Antibiograma
89