XVI FORUM de Ciencia y Técnica segunda Etapa. Título:

XVI FORUM de Ciencia y Técnica segunda Etapa.
Título:
EVALUACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE DIIIE2J COMO
LIGANDO PARA EL AISLAMIENTO DE RECEPTORES CELULARES
DEL VIRUS DEL DENGUE.
Autor: Roberto Rodríguez Labrada*.
Coautores: Vivian Huerta Galindo.#
Alejandro M. Martín Dunn #.
*Centro para la Investigación y Rehabilitación de las Ataxias Hereditarias CIRAH-, Holguín, Cuba. MINSAP,
#
Laboratorio de Antivirales contra el virus Dengue. Unidad de Química
Física. Dirección de Investigaciones biomédicas del Centro de Ingeniería
Genética y Biotecnología-CIGB-, La Habana, Cuba.
Holguin 2006
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RESUMEN:
La fiebre por dengue y el dengue hemorragico constituyen un gran problema de salud en Cuba el
resto de los países tropicales y subtropicales. El desarrollo de estrategias antivirales basadas en
el bloqueo de la interacción virus-célula hospedera se ve imposibiltado por el desconocimiento
de la identidad molecular de los receptores celulares de estos patógenos. El aislamiento,
identificación y caracterización de sus receptores se puede realizar mediante cromatografía de
afinidad, para lo cual resulta imprescindible la selección de los ligandos más apropiados.
Objetivos: Evaluar si la proteína recombinante DIIIE2J reproduce características estructurales y
funcionales de este fragmento en la proteína E de manera que pueda ser empleada como ligando
en estudios de aislamiento y caracterización del receptor celular del virus Dng2. Materiales y
métodos: Preparaciones purificadas de DIIIE2J fueron sometidas a un estudio fisico-químico
mediante cromatografía líquida de alta resolución para comprobar su homogeneidad. Ademas se
realizó un análisis estructural de la misma mediante espectrometría de masas y se comprobó su
estado de agregación a través de cromatografía de exclusión molecular. La caracterización
antigénica se realizó mediante Western Blott, Dot Blott y ELISA empleando anticuerpos de
origen humano y murino. La funcionalidad de la proteína fue analizada mediante un ensayo de
unión a células BHIK-21, seguido por citometría de flujo. Resultados: Las preparaciones
utilizadas de la proteína DIIIE2J poseen una gran homogeneidad y pureza. Esta proteína tiene el
único puente S-S correctamente formado y la Met N-terminal está procesada. En las soluciones
en que se ensayó, la misma se encuentra formando monómeros. DIIIE2J es reconocida por
anticuerpos de ratón y humanos en los 3 formatos inmunoenzimáticos empleados y se une
especificamente a la superficie de la células BHK-21. Conclusiones: La proteína recombinante
DIIIE2J presenta un plegamiento que reproduce características estructurales y funcionales del
dominio III de la proteína E de Dng2 por lo que constituye un ligando atractivo para emplear en
ensayos de aislamiento y caracterización de los receptores celulares del virus en la superficie de
las células.Etapa de aplicación se encuentra el trabajo: La presente investigación se terminó y
se generalizará para caracterizar las proteínas recombinantes homólogas de los restantes 3
serotipos.
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DATOS DE AUTORES Y COAUTORES.
Nombre y Apellidos: Roberto Rodríguez Labrada.
edad: 81051417724, 25 años.
Dirección particular y teléfono: B. Masso, # 180 Puerto Padre, Las Tunas, Cuba..
Centro de trabajo y teléfono: Laboratorio de Neurofisiología Molecular de la Centro para la
Investigación y Rehabilitación de las Ataxias Hereditarias, Holguín, 424090
Profesión o cargo:
•
Licenciado en Microbiología, especialista en Inmunología y Virología.
•
Jefe de Ciencia y Técnica del Centro para la Investigación y la Rehabilitación de la
Ataxia Hereditaria, Holguín, 424090
•
Jefe de Departamento de Neurofisiología Clínica del Centro para la Investigación y la
Rehabilitación de la Ataxia Hereditaria, Holguín, 424090
Organizaciones a las que pertenece: UJC, ANIR, BTJ, CDR, MTT.
Nivel de escolaridad: Universitario
Sindicato: MINSAP y CITMA
Nombre y Apellidos: Vivian Huerta Galindo.
Carné de Identidad y edad: 71020615472 , 35 años.
Dirección particular y teléfono: Edificio 3115 Cubanacan Playa
Centro de trabajo y teléfono: Laboratorio de Antivirales contra el virus Dengue. Unidad de
Química Física. Dirección de Investigaciones biomédicas del Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología. La Habana, Cuba. 2716022 Ext 3150
Profesión o cargo:
•
Licenciada en Bioquímica.
•
Especialista en Química de proteínas, inmunología y virología.
•
Jefa del Laboratorio de Antivirales contra el Dengue en el Centro de Ingeniería Genética
y Biotecnología.
Organizaciones a las que pertenece: PCC, FMC, CTC, ANIR, CDR.
Nivel de escolaridad. Universitario
Sindicato: CITMA.
3
Nombre y Apellidos: Alejandro M. Martín Dunn
Carné de Identidad y edad: 670501010885, 39 años.
Dirección particular y teléfono: Edificio 3115 Cubanacan Playa
Centro de trabajo y teléfono: Laboratorio de Antivirales contra el virus Dengue. Unidad de
Química Física. Dirección de Investigaciones biomédicas del Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología. La Habana, Cuba. 2716022 Ext 3150
Profesión o cargo:
•
Licenciado en Biología.
•
Especialista en Biología Molecular y Bioinformática.
Organizaciones a las que pertenece: PCC, CTC, ANIR, CDR.
Nivel de escolaridad. Universitario
Sindicato: CITMA.
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1. INTRODUCCIÓN
El dengue es una enfermedad febril aguda, causada por el virus del mismo nombre y trasmitida a
los humanos por la picadura de un mosquito infectado, principalmente el Stegomyia aegyti. La
Organización Mundial de la Salud reporta estimados de 50 millones o más casos de infección y
alrededor de 24 000 muertes cada año. Actualmente no se dispone de una vacuna efectiva contra
el virus ni de un tratamiento específico para esta enfermedad.
Teniendo en cuenta que estudios recientes han demostrado una alta correlación entre los niveles
de viremia y la severidad de la enfermedad, el diseño de una droga antiviral efectiva representa
una estrategia muy atractiva para el control de las formas severas de la misma.
Unas de las estrategias más efectivas para bloquear la infección viral es inhibir la entrada de los
viriones a las células hospederas. Sin embargo, el desarrollo de antivirales específicos basados
en esta estrategia se ve limitado por el desconocimiento de la identidad de los receptores
celulares del virus Dengue (Dng), así como de los determinantes estructurales de la interacción
de las proteínas virales con los mismos.
Numerosas evidencias confirman que el dominio III de la proteína de la envoltura (E) del virus
Dng forma parte de la región de interacción de esta proteína con los receptores de la superficie
de las células. Es por esta razón que el aislamiento de proteínas de la membrana celular que
interactúan de forma específica con el dominio III puede conducir a la identificación de los
receptores virales
En nuestro grupo se ha evaluado el empleo de las proteínas recombinantes PD5 y PD2, las que
incluyen los residuos correspondientes al dominio III del virus Dng2 (cepa Jamaica 1409),
fusionados a distintos fragmentos de la lipoamida deshidrogenasa de Neisseria meningitidis
(P64K), como ligandos para el aislamiento de los receptores celulares del virus en experimentos
de cromatografía de afinidad. Los resultados experimentales obtenidos evidenciaron la alta
reactividad de la región correspondiente a la P64K con las preparaciones celulares empleadas.
Con el objetivo de disponer de una variante recombinante del dominio III de Dng2 sin proteína
portadora, se clonó y expresó en E.coli la proteína DIIIE2J, que contiene el dominio III de la
proteína E del virus Dng2 (cepa Jamaica 1409), fusionado a una cola de 6 His. En las
condiciones de expresión establecidas la proteína representa aproximadamente el 20% del
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contenido de proteína total en la bacteria y se alcanza un rendimiento en su purificación de
aproximadamente 60 mg por litro de cultivo.
Para ser empleada como ligando es necesario determinar si DIIIE2J reproduce las principales
características estructurales y funcionales del dominio III en el contexto de la proteína E
presente en el virión maduro.
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OBJETIVOS
Objetivo general
o Evaluar si la proteína recombinante DIIIE2J reproduce características estructurales y
funcionales de este fragmento en la proteína E de manera que pueda ser empleada como
ligando en estudios de aislamiento y caracterización del receptor celular del virus Dng2.
Objetivos específicos
1. Realizar una caracterización físico-química de la preparación purificada de DIIIE2J.
2. Determinar si DIIIE2J contiene epitopos de esta región de la proteína E, presentes en la
partícula viral.
3. Demostrar la capacidad de DIIIE2J de interactuar con proteínas de superficie de células
intacta
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DESCRIPCIÓN DE LA TECNOLOGÍA
Diseño experimental
Células
Se emplearon células de la línea procedente de riñón de hámster neonato (BHK-21), donadas por
el Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”, de La Habana, Cuba. Las células se cultivaron
en medio MEM (Gibco, EEUU), suplementado con 5% (v/v) de suero fetal bovino (SFB)
(HyClone, EEUU) a 37oC en atmósfera de 5% de CO2.
Para la realización de los ensayos se sembraron placas de 60 mm (Corning, EEUU) con 1.5 x
106 células las que se incubaron hasta alcanzar la confluencia. Posteriormente las células se
desprendieron mecánicamente, se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 ml y se
centrifugaron a 800 g durante 5 min. Se desechó el sobrenadante y se resuspendieron las células
en la solución tampón 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1% SFB en PBS pH 7.4
(100 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM K2HPO4), para ser lavadas por
centrifugación con las mismas condiciones antes mencionadas. La viabilidad celular se examinó
mediante el método de exclusión de azul de tripán.
Preparaciones virales.
Se utilizaron preparaciones de antígenos virales de los serotipos 1 y 2, obtenidos previamente
por el método de sacarosa-acetona (Clarke y Casals 1958), a partir de homogenados de cerebros
de ratones OF1 lactantes, inoculados intracranealmente con cepas neuroadaptadas de cada uno
de los serotipos. Las preparaciones empleadas como control negativo se obtuvieron siguiendo el
mismo procedimiento a partir de homogenados de cerebros de ratones no inoculados.
Anticuerpos y proteínas.
•
Líquidos ascíticos hiperinmunes generados contra Dng1 (LAH α Dng1) y Dng2 (LAH α
Dng2). Ambas preparaciones se obtuvieron por inmunización de ratones Balb/C con los
antígenos del serotipo correspondiente, obtenidos de la forma expuesta en 3.2. Como
control negativo se empleó una mezcla de sueros de ratones Balb/C no inmunizados.
•
Sueros de personas que fueron infectadas por el virus Dng y padecieron distintos grados
de severidad de la enfermedad. Como control negativo de los ensayos se empleó el suero
8
de una persona sin antecedentes de haber presentado síntomas asociados a una infección
por el virus Dng y que no presenta título antiviral detectable en diferentes ensayos
inmunoenzimáticos establecidos con este fin en el laboratorio.
•
P64K, enzima lipoamida deshidrogenasa de Neisseria meningitidis, obtenida por vía
recombinante en E. coli. Esta proteína fue suministrada por el Departamento de
purificación de la División de Desarrollo Tecnológico del CIGB.
•
PD5, PD10 y PD18, proteínas recombinantes obtenidas por el grupo de Dengue de la
división de Vacunas del CIGB. Estas proteínas contienen el dominio III (residuos 286426) de la proteína E de los virus Dng2 (cepa Jamaica 1409), Dng1 (cepa Jamaica 1636)
y Dng3 (cepa Nicaragua 24), fusionadas a C-terminal de P64K. Las preparaciones
utilizadas fueron suministradas por el Departamento de purificación de la División de
Desarrollo Tecnológico del CIGB.
•
Preparaciones comerciales con más de un 85% de pureza de Albúmina del suero bovino
(BSA), citocromo C, Lactalbúmina e Insulina bovina (Sigma, EEUU).
•
Preparación con más de un 90% de pureza de Estreptoquinasa recombinante,
suministrada por el Departamento de purificación de la División de Desarrollo
Tecnológico del CIGB.
Cuantificación de proteínas.
Se utilizó un estuche de reactivos para la determinación de concentración de proteínas por el
método del ácido bicinconínico (Pierce, EEUU) y se siguieron las instrucciones del fabricante
para los ensayos en placas de 96 pozos. Para obtener la curva de calibración se emplearon
distintas diluciones (0.015–2 mg/mL) de BSA. Los coeficientes de correlación obtenidos para el
ajuste de las ecuaciones lineales oscilaron entre 0.994 y 0.998.
Reducción y carboximetilación de proteínas
Dos partes de una solución de DIIIE2J con una concentración de 0.5 mg/mL, se mezclaron con
una parte de la solución tampón 0.3 M Tris, 6M GnHCl, 1 mM EDTA, pH 8.5. A esta mezcla se
le añadió el volumen necesario de una solución 0.1 M ditiotreitol (DTT) (Sigma, EEUU) para
alcanzar una concentración final en la reacción de 10 mM. La mezcla se incubó en la oscuridad
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durante 2 h a 37oC en baño termostatado. Luego se añadió iodoacetamida (IAA) (Sigma,
EEUU), a partir de una solución 0.2 M de este agente alquilante, para una concentración final de
20 mM y se mantuvo durante 30 minutos en la oscuridad a 25oC. La proteína reducida y
carboximetilada (RCM) se dializó contra la solución tampón 20 mM de acetato de sodio, pH 4.
Reacción de biotinilación de proteínas
A las alícuotas de la proteína DIIIE2J sin modificar y RCM se les ajustó el pH empleando una
solución 0.2 M NaOH hasta alcanzar un valor entre 8-8.2. El reactivo de la biotina activada (Nhydroxysuccinimido-biotin) (Sigma, EEUU) se disolvió en dimetilsulfóxido a una concentración
de 10 mg/mL y se añadió el volumen necesario a la solución de proteínas, para alcanzar una
proporción de 20 moles de biotina por mol de proteína. La reacción se incubó en la oscuridad
toda la noche a 4oC, con agitación suave. Para detener la biotinilación se adicionó solución
tampón 1 M Tris-HCl, pH 8 en una proporción de 20 µL por mg de proteína. Las preparaciones
de proteínas biotiniladas se dializaron contra la solución tampón PBS. El mismo procedimiento
se empleó en la biotinilación de una alícuota de la proteína BSA, para ser empleada como
control negativo en los ensayos.
Análisis en cromatografía líquida de alta resolución-fase reversa (RP-HPLC).
Alícuotas de aproximadamente 45 µg de la preparación de DIIIE2J en estado nativo y 80 µg de
DIIIE2J RCM se aplicaron a una columna de fase reversa C4 4.6x250 mm (J.T.Baker, EEUU).
La corrida cromatográfica se realizó a 37oC empleando un sistema cromatográfico de alta
presión equipado con dos bombas y un controlador. Para la elución de la proteína se aplicó un
gradiente de 10 a 60 % (v/v) de acetonitrilo en 0.1% (v/v) de ácido trifluoroacético a un flujo de
0.8 mL/min. La detección se realizó a 226 nm utilizando un detector de longitud de onda
variable.
1.1 Análisis por espectrometría de masas.
Los espectros de masas se adquirieron en un espectrómetro de masas híbrido con geometría
octogonal
QTOF-2TM
(Micromass,
UK)
equipado
con
fuente
de
ionización
por
10
electronebulización Z-spray. El capilar de entrada se sometió a 3000 V y el voltaje del cono fue
de 35 V. El analizador se calibró usando yoduro de sodio como referencia, en el rango de
masa/carga de 50 a 2000. El software de procesamiento de los espectros de masas empleado fue
el MassLynx versión 3.5 (Micromass, UK).
Análisis en cromatografía de exclusión molecular.
Alícuotas de 100 µL de DIIIE2J y de las proteínas patrones (BSA, citocromo C, Lactalbúmina,
Insulina bovina y Estreptoquinasa recombinante) disueltas a una concentración de 1mg/ml se
aplicaron a una columna Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con tampón PBS pH 7.4. Todas las
corridas se realizaron a 25oC y un flujo de 0.5 mL/min empleando un sistema cromatográfico de
alta presión (Merck-Hitachi, Alemania). La detección se realizó a 226 nm y los cromatogramas
se registraron empleando el programa EZChrom Elite (Merck-Hitachi, Alemania).
Electroforesis de proteínas (SDS-PAGE)
Se utilizaron geles de poliacrilamida al 15%, según las condiciones estándar de Laemmli
(Laemmli 1970). Las muestras de la proteína DIIIE2J se diluyeron 1:1 (v/v) en tampón muestra:
1% SDS, 0.3 M Tris-HCl, pH 6.8 y se calentaron durante 2 min a 95oC. Para el análisis en
condiciones reductoras se siguió el mismo procedimiento pero adicionando 2 mM βmercaptoetanol al tampón de muestra.
Se utilizó una cámara Mini-PROTEAN II (BioRad, EUA), se fijó la corriente a 30 mA por gel,
controlado por una fuente de corriente EPS 600 (Pharmacia Biotech, Suecia). La solución
tampón empleada para la corrida electroforética fue 0.25 M Tris-HCl, 1.92 M glicina, pH 8.3 y
1% SDS.
Detección de proteínas en geles de poliacrilamida por tinción con azul de coomasie.
La tinción se llevó a cabo sumergiendo los geles durante 30 min en una solución 0.25% (p/v) de
azul de coomasie (Sigma, EUA) en etanol: ácido acético: agua (5:1:5), a 25oC con agitación.
Para la destinción se realizaron tres incubaciones de 1 h en etanol: ácido acético: agua (5:1:5),
preparado antes de usar.
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Western blotting
Las proteínas separadas electroforéticamente como se describe en 3.9 se transfirieron del gel a
membranas de nitrocelulosa Hybond-ECL de 0.45 µm (Amersham, Reino Unido) en un equipo
de transferencia sumergida Mini Trans-Blot Cell (BioRad, EEUU), según Towbin y cols
(Towbin y cols 1979). Posterior a la transferencia, las membranas se bloquearon con leche
descremada (Oxoid, Inglaterra) al 5% (p/v) en PBS conteniendo Tween-20 (Riedel-de Haden,
Alemania) al 0.1% (v/v) (PBST) por incubación durante 1 h a 25°C, con agitación. Luego se
lavaron las membranas 3 veces, durante 10 minutos, agitando con abundante PBST.
Seguidamente se incubaron toda la noche en agitación a 4°C con el anticuerpo correspondiente
diluido en PBST, 5% de leche descremada. Luego se repitieron los lavados de la misma forma
antes descrita y se incubó 1 h a 25°C, con el conjugado correspondiente; anti-IgG murinoperoxidasa (Amersham, Reino Unido) en el caso en que se emplearon anticuerpos de ratón y
anti-IgG humano-peroxidasa (Sigma, EEUU), en el caso de los anticuerpos de origen humano.
Seguidamente se volvieron a lavar las membranas y se incubaron en 3,3 diaminobenzidina
(Sigma, EEUU) y H2O2, ambos al 0,1 % en PBS hasta la aparición del color que indica la
reactividad. Finalmente las membranas se lavaron con un exceso de PBST.
Dot blotting
El ensayo con señales en forma de cuadrados se realizó en una cámara del tipo MINIPROTEAN II MULTI SCREEN (BioRad, EEUU). Las proteínas DIIIE2J nativa, RCM y BSA
como control negativo se aplicaron sobre una membrana de nitrocelulosa del tipo expuesto en
3.11 durante 1h a 25oC. Además se transfirieron a la membrana cantidades fijas de PD5 como
control positivo y preparaciones negativas y positivas del antígeno viral de Dng2 referido en 3.2.
La membrana se bloqueó durante toda la noche, con agitación a 4oC en PBST, conteniendo leche
descremada al 5%. Luego se lavó mediante el mismo procedimiento descrito en 3.11. Para la
incubación con las diferentes preparaciones de anticuerpos diluidas en PBST, leche descremada
al 5% durante 2h a 25oC se empleó nuevamente la cámara referida pero colocando la membrana
con una rotación de 90oC respecto a la orientación de recubrimiento.
Posteriormente se repitieron los lavados de la misma forma y se incubó con un conjugado antiIgG murino-peroxidasa (Amersham, Reino Unido) para el sistema murino y anti-IgG humanoperoxidasa (Sigma, EEUU), para el sistema humano, durante 1h a 25oC. Luego de lavar
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nuevamente la membrana, se realizó la detección con el sistema ECL Western Blotting Analysis
System (Amersham, Reino Unido), sensibilizando un filme CP-G PLUS (AGFA, Bélgica) en un
casete de autorradiografía FBXC 810 (FisherBiotech, EEUU). Finalmente se reveló el filme en
un procesador automático de filmes autorradiográficos del tipo Hyperprocessor (Amersham,
Reino Unido).
Para el ensayo con señales en forma de círculos se empleó una cámara del tipo BIO-DOTTM
APPARATUS (BioRad, EEUU), en la que se sensibilizó una membrana de nitrocelulosa del tipo
antes mencionado con diluciones seriadas de las proteínas DIIIE2J en estado nativo y RCM, así
como cantidades equimolares de PD5, PD10 y P64K. Además se aplicaron a la membrana
cantidades fijas de los controles virales empleados en el otro formato de Dot-blotting. Después
de bloquear la membrana durante 1h a 25oC y lavarla 3 veces como se explicó en 3.11, se incubó
durante toda la noche con agitación a 4oC con los LAH α Dng1 y α Dng2, ambos disueltos 1/100
en PBST, conteniendo leche descremada al 5%. Posteriormente se lavó la membrana y se incubó
en agitación con un conjugado proteína A-peroxidasa (Sigma, EEUU) a una dilución 1/2000, a
25oC por 1h. Después de lavar la membrana por última vez se realizó la detección siguiendo el
mismo procedimiento expuesto en 3.11.
Ensayos inmunoenzimáticos en fase sólida (ELISA)
1.1.1
ELISA indirecto
Se utilizaron placas de 96 pozos (Costar, catálogo 3590 High Binding, EEUU), que se
recubrieron con las proteínas DIIIE2J, PD5, PD10, PD18, P64K y BSA a una concentración de
10 µg/mL en un volumen de 0.05 mL/pozo en tampón 0.015 M Na2CO3, 0.028 M NaHCO3,
pH 9.6, por 1 h a 37oC. Luego se bloquearon durante 1 h a 37°C utilizando 0.1 mL/pozo de una
solución de BSA al 1% en el mismo tampón del recubrimiento.
Después del bloqueo, las placas se lavaron tres veces con una solución de PBST.
Posteriormente, se incubaron durante toda la noche a 4oC con las diluciones de los diferentes
sueros humanos y los LAH α Dng 2 y α Dng1, todos diluidos en PBST, conteniendo 1% (p/v) de
BSA.
Luego de lavar nuevamente, se procedió a la detección de los anticuerpos unidos al antígeno de
recubrimiento, utilizando un conjugado anti IgG de humano-fosfatasa (Sigma, EEUU) para el
sistema humano y anti IgG de ratón-peroxidasa (Amersham, Reino unido) para el sistema
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murino. Ambos conjugados se emplearon en una dilución 1/8000, 50 µL/pozo y se incubaron
1 h a 25oC.
Seguidamente se realizaron los últimos lavados y se reveló con 50 µL/pozo del sustrato 4nitrofenilfosfato (Boehringer Mannheim, Gmbh) en solución tampón 0.05 M de bicarbonato de
sodio y 0.01 M de cloruro de magnesio, pH 9.6 para los sueros humanos y con el reactivo
cromógeno o-fenildiamina (Sigma, EUA) en solución tampón 0.1 M citrato de sodio, pH 5.0 con
H2O2 al 0.1% para los LAH. A los 30 min se detuvo la reacción con 0.02 mL de 1 M NaOH por
pozo en el caso de los sueros humanos y 2.5 M H2SO4 en el de los LAH. Finalmente se
determinó la densidad óptica (D.O) a 405 nm y 495 nm respectivamente en un lector de placas
Sensident (Merck, Alemania).
ELISA de captura de virus.
Las placas de 96 pozos antes mencionadas se recubrieron con 50 µL/pozo de la fracción γglobulina de un suero humano de alto título antiviral a una concentración de 5 µg/ml, en tampón
carbonato-bicarbonato durante 1 h a 37oC. Los sitios libres se bloquearon con leche descremada
al 5% en PBST por 1 h a 37oC. Luego se lavaron las placas y se incubaron con las preparaciones
virales de Dng1, Dng2 y el control negativo en una dilución 1/100 en PBST durante toda la
noche a 4°C. Las placas se lavaron nuevamente y se incubaron con los LAH durante 2 h a 37oC.
Las diluciones empleadas de cada LAH fueron 1/2000 para los pozos con el virus homólogo y
1/1000 para el virus heterólogo. Los pasos posteriores se llevaron a cabo siguiendo el mismo
procedimiento descrito para los LAH en 3.13.1.
Ensayo de unión a células.
Las células BHK-21 se incubaron durante 1h a 4°C con diferentes diluciones de las proteínas
DIIIE2J biotinilada y BSA biotinilada como control negativo, en la solución tampón 10 mM
HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1% SFB en PBS pH 7. Posteriormente se lavaron las
células en la misma solución tampón por centrifugación a 800 g durante 5 min. Luego se
incubaron con un conjugado estreptavidina-fluoresceína (Amersham, EEUU) a una dilución
1/500 durante 1 h a 4°C. Seguidamente se lavaron las células de la misma forma antes descrita y
se resuspendieron en 2 mL de PBS para ser analizadas en un citómetro de flujo (Partec Pas-III,
Gmbh) a una longitud de onda de exitación y emisión de 532 y 520 nm respectivamente. El
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análisis de los resultados se realizó empleando el programa computacional WinMDI2.8 (J.
Trotter 1993-1998; [email protected]).
15
RESULTADOS
La proteína DIIIE2J se obtuvo mediante la clonación en E.coli del fragmento del gen que
codifica para los residuos Met289 a Gly400 de la proteína E del virus Dng2 (Cepa Jamaica 1409,
AC M15075). En el anexo 4 se resume de forma esquemática el proceso de expresión y
purificación desarrollado anteriormente en el laboratorio para la obtención de preparaciones
purificadas de esta proteína. En las condiciones de expresión establecidas, DIIIE2J se obtiene en
la fracción insoluble del lisado celular. Después de su solubilización empleando 4 M de GnHCl,
la proteína se somete a un proceso de renaturalización por dilución para propiciar la correcta
formación del puente disulfuro entre sus dos residuos de Cys. La purificación se realiza en
columna de afinidad con iones metálicos inmovilizados (Ni-NTA, Qiagen, Alemania)
equilibrada en tampón PBS pH 7.4, 20 mM Imidazol, 0.3 M NaCl. La fracción de proteína que
eluye al aplicar a la columna un tampón similar pero conteniendo 100 mM Imidazol constituye
la preparación purificada que empleamos en nuestro trabajo.
1.2 Caracterización físico-química de DIIIE2J
Las preparaciones de DIIIE2J utilizadas en los
ensayos muestran una banda mayoritaria en
SDS-PAGE que migra con una masa aparente
correspondiente con la masa esperada para la
proteína, siendo evidente el alto grado de pureza
alcanzado con el proceso de purificación
establecido (Figura 1).
En esta misma figura se aprecia que las bandas
correspondientes
a
DIIIE2J
aplicada
en
condiciones reductoras (carril 2) y la proteína
RCM
(carril
electroforética
3)
muestran
ligeramente
una
menor
migración
que
en
condiciones no reductoras (Carril 1). Este
fenómeno se observa con bastante frecuencia al
realizar la comparación de especies reducidas y
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no reducidas de proteínas que incluyen entre sus principales elementos estructurales puentes
disulfuro. Esto puede estar dado por el hecho de que la presencia del puente disulfuro confiere a
estas proteínas una estructura más compacta que la variante reducida y por consiguiente
experimentan una mayor migración en el gel.
El análisis de la pureza de las preparaciones de DIIIE2J mediante SDS-PAGE excluye la
presencia de contaminantes de peso molecular diferente a DIIIE2J, pero no discrimina entre esta
proteína y otros contaminantes de peso molecular similar. Con este fin se realizó un análisis en
RP-HPLC. Esta técnica cromatográfica permite la separación de las proteínas basándose en sus
diferencias en hidrofobicidad. Para proteínas de masa molecular similar a DIIIE2J esta técnica
permite obtener una alta resolución que puede llegar a la separación de especies de la propia
proteína que presentan diferentes modificaciones como por ejemplo la pérdida de un aminoácido
en uno de sus extremos o la oxidación de un residuo de Met (Moya y cols. 2002).
Alícuotas de DIIIE2J sin modificar y RCM se analizaron en una columna de fase reversa C4. En
ambos cromatogramas se obtuvo un único pico confirmando el elevado grado de homogeneidad
de estas preparaciones (Figura 2).
Los picos de DIIIE2J nativa y RCM colectados por RP-HPLC se analizaron por espectrometría
de masas con el objetivo de obtener la masa molecular de la proteína con una mayor exactitud y
verificar la formación del puente disulfuro. En la figura 3A se muestra la secuencia
aminoacídica de DIIIE2J, obtenida a partir de la secuencia del gen clonado y se señalan los 2
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residuos de Cys que deben estar formando entre sí el único puente disulfuro de la proteína.
Además, se representa la cola de 6 His que presenta la misma fusionada al C-terminal.
B
A
MAMDKLQLKG MSYSMCTGKF KIVKEIAETQ HGTIVIRVQY EGDGSPCKIP
Masa promedio
1
Met :
13644.87 Da
FEIMDLEKRH VLGRLITVNP IVTEKDSPVN IEAEPPFGDS YIIIGVEPGQ
Masa promedio
Ala
2:
13513.68 Da
LKLNWFKKGS SIGLEHHHHH H
Masa promedio RCM: 13629.8 Da
C
DIIIE2J nativo
13515.00
13515.00
Intensidad relativa (%)
DIIIE2J +DTT +IAA
DIIIE2J + IAA
13555.00
13631.00
13571.00
13671.00
13514.00
12586.00
12000
12000
13000
13000
14000
14000
12000
12000
13000 1300014000
14000
12000
13000
13687.00
14000
masa (Da)
Figura 10
3 . Determinación de la masa molecular y la formación del puente disulfuro de DIIIE2J
por espectrometría de masas. A) Secuencia aminoacídica obtenida a partir de la secuencia del
segmento de ADN clonado. B) Masa promedio esperada a partir de la secuencia aminoacídica de la
proteína con la Met N-terminal no procesada (Met1) y procesada (Ala2). RCM: masa promedio
2
esperada de la proteína comenzando en Ala .y con incorporación de IAA en cada residuo de Cys. C)
Espectros de masa deconvolucionados de DIIIE2J. Nativo: proteína no modificada colectada por RPHPLC. +IAA: proteína incubada 30 min a 25°C con IAA +DTT +IAA: proteína incubada 2h a 37°C con
DTT y posteriormente con IAA a 25°C por 30 min.
Como se puede apreciar en la figura 10C la especie mayoritaria de la preparación de DIIIE2J
posee una masa molecular de 13515.00 Da, este valor se diferencia en 1.32 Da de la masa
promedio esperada para la proteína comenzando en la Ala 2 (Figura 3B), lo que indica que
DIIIE2J posee la Met N-terminal homogéneamente procesada. Este resultado concuerda con las
evidencias obtenidas por Hirel y cols. en 1989, que indican que en E. coli la presencia de Ala en
la segunda posición permite el procesamiento enzimático de la Met N-terminal con gran
eficiencia.
Para evidenciar la presencia del puente disulfuro, una alícuota de la proteína purificada por RPHPLC se separó en 2 fracciones de igual volumen, y se sometió a la alquilación con IAA
posterior a su reducción empleando DTT y sin haber recibido el tratamiento con este agente
reductor. La IAA es un agente alquilante que reacciona con gran eficiencia con los grupos
sulfihidrilos libres de los residuos de Cys de las proteínas, en condiciones de pH básico. En
nuestro experimento, si el puente disulfuro de la proteína no está formado la incubación con
18
IAA sin previo tratamiento con DTT debe dar lugar a una masa correspondiente a la proteína
RCM (13629.8 Da), por la incorporación de 2 moléculas de IAA por molécula de DIIIE2J.
Al analizar ambas preparaciones por espectrometría de masas, se observó que solo en el caso de
la alícuota que había sido sometida a las reacciones con DTT y IAA ocurrió la incorporación del
agente alquilante, lo que se evidencia por el valor de masa obtenido de 13629.8 Da que se
diferencia solo en 1.2 Da del esperado para la proteína RCM. Esto indica entonces que la
fracción sometida solo a la reacción de alquilación no posee grupos sulfihidrilos libres
evidenciando que las dos Cys presentes se encuentran enlazadas formando el puente disulfuro
característico del dominio III
Resultados de nuestro laboratorio obtenidos durante el establecimiento de las condiciones de
renaturalización y purificación evidencian cierta tendencia de DIIIE2J a formar agregados que
se eliminan durante la cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (anexo 1). Como se
discutió anteriormente, en el contexto de la envoltura viral el dominio III expone solo una parte
de su superficie y el resto se encuentra involucrado en interacciones con los dominios restantes.
Por esta razón, su expresión como una proteína recombinante conlleva la exposición de regiones
que pudieran estar involucradas en la formación de estas especies agregadas.
Para comprobar si DIIIE2J se encuentra en forma de monómero, se realizó un análisis por
cromatografía de exclusión molecular, empleando las mismas condiciones de pH y fuerza iónica
que la solución tampón en que se almacenan y se emplean las preparaciones de la proteína.
A
80
19.47
B
5.0
BSA (64 kDa)
4.8
Masa molecular
calculada: 13.2 KDa
40
20
log PM
Abs 226 nm (mV)
60
SK (47 kDa)
4.5
4.3
Lact (14.4 kDa)
CitC (12.5 kDa)
4.0
Ins (6 kDa)
3.8
3.5
10
0
15
20
25
Tiempo de retencion (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo de retención (min)
Figura 11.
4 Análisis de DIIIE2J mediante cromatografía de exclusión molecular. (A) Cromatograma
obtenido por la aplicación de una alícuota de 100 µg de DIIIE2J en una columna Superdex 75 HR 10/30
equilibrada con tampón PBS pH 7.4 a un flujo de 0.5 mL/min. La columna fue previamente calibrada con
varias proteínas de peso molecular conocido y se obtuvo la curva patrón que se muestra en (B). Ins:
insulina bovina, CitC: citocromo C, lact: Lactalbúmina., SK: esteptoquinasa recombinante, BSA:
albúmina de suero bovino.
19
La figura 4A muestra el cromatograma obtenido en este experimento. En la misma se puede
apreciar que la especie mayoritaria de la preparación empleada eluyó con un tiempo de retención
de 19.47 min, el que corresponde según la curva patrón empleada (Figura 4B) a una proteína de
peso molecular de 13.2 kDa. Este valor concuerda con la masa de DIIIE2J medida por
espectrometría de masas (13.5 kDa), lo que significa que la misma se encuentra como un
monómero en la preparación empleada en nuestros experimentos.
1.3 Caracterización antigénica DIIIE2J
Estudios realizados con anticuerpos monoclonales revelan que gran parte de los epitopos del
dominio III de la proteína E son topográficos o sea, dependen del correcto plegamiento del
mismo así como de la formación del puente disulfuro entre los dos residuos de Cys
(Trirawatanapong y cols. 1992, Roehrig y cols. 1998, 2004). Esto hecho convierte el
reconocimiento de DIIIE2J por anticuerpos generados contra el virus en una herramienta de
particular importancia para evidenciar la presencia en el dominio III recombinante de elementos
estructurales existentes en el contexto de las partículas virales completas.
Con este objetivo se realizaron ensayos de Western blotting, Dot blotting y ELISA, empleando
anticuerpos policlonales de origen murino y humano.
Para el análisis en Western blotting, la
proteína purificada se aplicó a un gel de
SDS-PAGE
al
15%
en
condiciones
reductoras y no reductoras. Después de ser
transferida a membrana de nitrocelulosa, se
evaluó su reconocimiento por los LAH α
Dng2 y α Dng1, así como por un suero
humano de alto título, determinado en un
ELISA anti-viral (SH0021). Como control
negativo en el ensayo se empleó el suero
SH0020
caracterizado
anterioridad
en
también
nuestro
con
laboratorio
empleando un ELISA α-viral.
20
En todos los casos DIIIE2J mostró reactividad con los anticuerpos excepto con el suero SH0020
(Figura 5). En esta misma figura se aprecia que el LAH α Dng2 detecta una segunda banda con
una movilidad consistente con la de un dímero de DIIIE2J (aproximadamente 26 kDa). Sin
embargo, esta reactividad solo se evidencia cuando la corrida electroforética se realiza bajo
condiciones no reductoras, lo que podría sugerir que en su formación están implicadas
interacciones por puentes disulfuro entre dos monómeros de DIIIE2J.
El hecho que esta especie dimérica no se haya observado en el análisis por SDS-PAGE sugiere
que la misma se encuentra en cantidades muy bajas que no son detectables por el nivel de
sensibilidad de la tinción con azul de coomasie. La presencia de la especie dimérica en
preparaciones de dominio III recombinante de Dng y otros flavivirus ha sido informada con
anterioridad en la literatura (Ludolfs y cols. 2002, Jaiswal y cols. 2004, Chu y cols. 2005)
evidenciándose la obtención de esta fracción con distintos niveles de abundancia en los
diferentes trabajos publicados. La baja representatividad de los dímeros en nuestra preparación
evidencia que el proceso de renaturalización
empleado logró favorecer con efectividad la
formación
de
los
puentes
disulfuro
intramoleculares.
En el ensayo de Dot blotting las membranas
de
nitrocelulosa se sensibilizaron con cantidades
equimolares de DIIIE2J y BSA. Se emplearon
varias diluciones de ambas proteínas y
cantidades fijas de los controles de virus y
PD5. Luego se evaluó el reconocimiento de
estos antígenos por los LAH generados contra
el
serotipo 2 y el serotipo 1 a una dilución
previamente determinada (1/400). Se empleó
como control negativo un suero de ratón no
inmune a Dng en la misma dilución. Para el
estudio con los anticuerpos de origen humano
se
usaron 5 sueros todos a una dilución
predeterminada de 1/200, entre los que se
incluyó el SH0020, empleado como control
negativo.
21
La figura 6 muestra el reconocimiento de DIIIE2J por ambos LAH y por sueros humanos,
observándose que la misma no presenta reactividad con las preparaciones de anticuerpos
empleadas como control negativo.
En el ensayo que dió lugar a los resultados presentados en la figura 6 se analizó paralelamente
una membrana sensibilizada de la misma forma pero empleando una preparación de DIIIE2J
RCM y se evaluó el reconocimiento por los mismos sueros. El resultado de este experimento
reveló una ausencia de reactividad de DIIIE2J con los sueros (Resultados no mostrados). Este
hallazgo constituye un dato de gran interés ya que aun cuando varias evidencias acumuladas en
la literatura indican que el puente disulfuro que estabiliza al dominio III juega un papel muy
importante en el mantenimiento de los epitopos de anticuerpos monoclonales neutralizantes al
virus (Trirawatanapong y cols. 1992, Roehrig y cols. 1998, 2004), no existen datos publicados
acerca del impacto del mismo en el reconocimiento de preparaciones policlonales.
Resultados publicados por Simmons y cols. (a) en 1998 sugieren que el empleo de una proteína
portadora podría resultar de importancia para la estabilidad del plegamiento de las moléculas de
dominio III obtenidas por vía recombinante y como consecuencia mejorar su reconocimiento por
los anticuerpos generados contra el virus. Sin embargo, estos resultados contrastan con datos
obtenidos en estudios de la estabilidad de la estructura en solución empleando dominio III
recombinante que indican que el mismo puede recuperar su plegamiento después de la
incubación en 4M GnHCl (Yu y cols. 2004).
Con el objetivo de obtener confirmación adicional acerca de los efectos de la eliminación del
puente disulfuro en el reconocimiento de sueros policlonales al dominio III se realizó un ensayo
de Dot blotting comparando el reconocimiento de DIIIE2J sin modificar con la RCM. Para
nuestro estudio disponíamos además de la proteína PD5, una variante recombinante que incluye
el dominio III del virus Dng 2 fusionado a la proteína P64K. Esta proteína ha sido evaluada
como candidato vacunal y es capaz de generar respuesta inmune protectora al reto viral en
modelos de infección de ratones y monos (Hermida y cols. 2004 a) lo que evidencia que esta
proteína presenta epitopos claves de esta región del virus.
En este experimento se sensibilizaron las membranas de nitrocelulosa con cantidades
equimolares de las proteínas DIIIE2J nativa y RCM, así como de PD5. Las proteínas P64K y
PD10 se emplearon como control negativo y como control de la reactividad del LAH α Dng1
respectivamente.
22
Como se observa en la figura 7 las proteínas DIIIE2J sin modificar y PD5 muestran una
reactividad similar con cada uno de los LAH, lo que sugiere que aún sin estar en el contexto de
una proteína portadora DIIIE2J se ensambla correctamente y presenta epitopos que son
reconocidos por los anticuerpos generados contra partículas virales. Por otro lado, como se había
determinado anteriormente, ocurre una pérdida muy significativa del reconocimiento por los
sueros empleados a DIIIE2J RCM.
Figura 714 Comparación del
reconocimiento de las proteínas
DIIIE2J y PD5 por los LAH α
Dng2 y α Dng1. Las membranas
fueron
sensibilizadas
con
cantidades equimolares de los
antígenos
e
incubadas
primeramente con los LAH (1/100)
y luego con un conjugado proteína
A-peroxidasa (1/2000). C+: control
positivo de virus, C-: control
negativo de virus.
Teniendo en cuenta la importancia del reconocimiento de los sueros humanos a la proteína
recombinante se decidió ampliar el número de sueros evaluados. Con este fin se empleó un
ensayo de ELISA que brinda mayores posibilidades para la comparación cuantitativa de la
magnitud de la respuesta.
1.6
Tabla 2.
1 Titulación de los LAH
por ELISA de captura de virus
contra Dng2 y Dng1 1
LAH
Dng 1
Dng 2
1.4
LAH ant i Dng1
1.2
LAH ant i Dng2
1
C- LAH anti Dng1
0.8
C- LAH anti Dng2
0.6
0.4
∝Dng 1
64 000
8000
∝Dng 2
2000
16 000
0.2
0
Dilució n del LA H -1
1
Inverso de la dilución del LAH para la que
el valor del cociente de la D.O de la
reactividad con los virus y la D.O de la
reactividad con una preparación negativa
de virus es 2 o más.
Figura 18
5. Reconocimiento de la proteína DIIIE2J por
LAH ∝Dng1 y ∝Dng2 en ELISA indirecto. Las placas
recubiertas con la proteína DIIIE2J se bloquearon y luego
se incubaron con diluciones seriadas de los LAH. Para la
detccion de las Igs unidas se empleo un conjugado antiIgG murino-peroxidasa (1/8000) y se reveló con
H2O2/OPD. C- LAH anti Dng 1 y C- LAH anti Dng 2
representan la reactividad de cada LAH con el control
negativo (BSA).
23
Los ensayos de ELISA se realizaron recubriendo placas de 96 pozos con las proteínas
recombinantes y BSA como control negativo. Las placas recubiertas se incubaron con diluciones
seriadas de los distintos sueros y el título se obtuvo como la mayor dilución para la que el
cociente de las densidades ópticas (D.O) de la reactividad de DIIIE2J y BSA fue mayor que 2.
La figura 815 muestra el reconocimiento en ELISA de DIIIE2J por los LAH αDng2 y αDng1,
cuyos títulos contra las preparaciones de cada serotipo viral se muestran en la tabla 2. En cada
caso se observa una reactividad diferencial de los anticuerpos con la proteína en comparación
con el control negativo, alcanzándose títulos de 1/6400 para el LAH α Dng2 y 1/3200 del LAH
α Dng1.
Los resultados del ensayo de ELISA indirecto con el panel de sueros humanos se resumen en la
tabla 2. En la misma se muestra además el título antiviral de cada suero contra una mezcla de
antígenos de los 4 serotipos. DIIIE2J es detectada por los anticuerpos presentes en el suero de 18
personas que fueron infectadas por el virus en diferentes momentos de circulación del mismo en
nuestro país y padecieron distintos grados de severidad de la enfermedad, según los datos
colectados en la encuesta realizada en el momento de la extracción de la sangre.
Tabla 2.
ELISA.
Reactividad de un panel de sueros humanos con DIIIE2J en
Título
Suero
Título
Suero
Título
Título
α-viral -1
α-DIIIE2J-1
α-viral -1
α-DIIIE2J-1
SH001
12800
800
SH0047
6400
400
SH012
6400
400
SH0060
1600
400
SH015
800
400
SH0062
6400
3200
SH0021
5120000
3200
SH0066
6400
800
SH0031
1000
400
SH0067
6400
400
SH0032
1000
400
SH0073
6400
800
SH0037
3200
400
SH0075
12800
400
SH0041
6400000
6400
SH0076
102400
3200
SH0045
6400
1600
SH0079
6400
400
Como se puede observar, no se aprecia una relación entre el título α-virus y la respuesta αdominio III en estos sueros. Tal es el caso del suero SH0021 que presenta un título α-viral en el
24
orden de 1/5120000 y un título α-DIIIE2J de 1/3200 mientras que los sueros SH0062 y SH0076
con títulos α-virus de 1/6400 y 1/102400 presentan el mismo título contra DIIIE2J. Esto pudiera
explicarse a partir de los resultados publicados que indican que las moléculas recombinantes que
incluyen el dominio III de la proteína E permiten una mayor especificidad en la detección de los
anticuerpos generados contra los diferentes serotipos del virus a diferencia de las preparaciones
virales empleadas comúnmente en los ensayos de ELISA para la determinación de respuesta αviral (Ludolfs y cols. 2002). También pudieran influir otros factores menos estudiados acerca de
la respuesta inmune de las personas infectadas por el virus. Un ejemplo de esto es la prevalencia
de los anticuerpos α-dominio III en el tiempo ya que otra diferencia en los sueros evaluados
reside en el período transcurrido entre la infección y la toma de la muestra de suero. Estas
consideraciones no afectan la respuesta que se buscaba en nuestros experimentos.
La reactividad de esta proteína con los sueros de origen humano es de gran relevancia ya que
estos anticuerpos son parte de la respuesta inmune del blanco natural del virus, la que participa
tanto en el control de la infección en el organismo como en la patogénesis, en los casos que se
propicia el fenómeno de ADA. Además, a diferencia de las preparaciones de virus obtenidas en
cerebro de ratones neonatos, las partículas virales inoculadas por un mosquito poseen gran
homogeneidad y las características antigénicas dadas por su hospedero natural.
9
25
SH001
1
0,9
6
5
0,8
DIIIE2J
P D5
P D10
P D18
P 64K
B SA
0,7
0,6
0,5
0,4
4
3
2
0,3
0,2
1
0 ,1
0
0
50
10 0
20 0
4 00
8 00
16 0 0
3 20 0
50
6 40 0
100
200
0,45
400
800
1600
3200
6400
Dilució n del suero -1
D ilució n del suero -1
SH002
0,4
3
2.5
0,35
2
0,3
0,25
1.5
0,2
1
0,15
0,1
0.5
0,05
0
0
50
10 0
2 00
4 00
8 00
D ilució n del
16 00
3 20 0
6 40 0
50
100
suero -1
200
400
800
1600
3200
6400
Dilució n del suero -1
SH0012
0,7
3.5
3
0,6
2.5
0,5
0,4
2
0,3
1.5
0,2
1
0,1
0.5
0
0
50
100
2 00
40 0
8 00
Dilució n del
16 00
32 00
6 40 0
50
100
suero -1
200
400
800
Dilució n del suero
SH0015
1,6
1600
3200
6400
-1
4
3.5
1,4
1,2
3
1
2.5
0 ,8
2
0 ,6
1.5
0 ,4
1
0 ,2
0.5
0
0
50
100
2 00
4 00
8 00
16 00
32 00
64 00
50
100
D ilució n del suero -1
200
400
800
Dilució n del suero
SH0021
1,2
1600
3200
6400
-1
6
5
1
0 ,8
4
0 ,6
3
0 ,4
2
0 ,2
1
0
0
50
100
200
40 0
80 0
Dilució n del suero -1
16 00
32 00
64 0 0
50
100
200
400
800
1600
3200
6400
Dilució n del suero -1
9 . Diferencias en la reactividad de DIIIE2J y las proteínas de fusión a P64K con sueros
Figura 16
humanos en ELISA indirecto. La línea discontinua representa el valor de corte para la determinación del
título anti DIIIE2J. Rel +/-: cociente de los valores de D.O cada proteína recombinante con su control
negativo. Como control negativo para la proteína DIIIE2J se tomó BSA y para las proteínas PD5, PD10 y
PD18 se tomó P64K.
26
El ensayo tipo ELISA también se empleó para comparar el reconocimiento por los sueros
humanos a DIIIE2J en relación con la respuesta obtenida para las proteínas de fusión a P64K
(PD5, PD10 y PD18). Los títulos contra las proteínas de fusión a P64K se obtuvieron tomando a
la proteína P64K como control negativo y siguiendo el mismo procedimiento antes explicado.
Al analizar los resultados que se muestran en la figura 16 de la variación de la D.O con la
dilución se puede observar que la proteína P64K posee niveles considerables de reactividad con
los sueros empleados en el ensayo. Este hecho se refleja en la ausencia de títulos contra las
proteínas de fusión en la mayoría de estos, según el valor de corte empleado (D.O positivo/ D.O
negativo>2) mientras que es posible detectar una reactividad diferencial de DIIIE2J con su
control negativo. Este resultado puede considerarse con valor predictivo acerca de lo que puede
ser el comportamiento de las proteínas de fusión al ser empleadas como ligandos en la búsqueda
de interacciones específicas con el dominio III y evidencia la ventaja de emplear DIIIE2J en este
tipo de estudios.
1.4 Caracterización funcional de DIIIE2J
El ensayos de unión de DIIIE2J a células de la línea BHK-21 se realizó por incubación de
DIIIE2J biotinilada con las células intactas a 4oC con el objetivo de minimizar la internalización.
La proteína unida se detectó empleando un conjugado de estreptavidina-peroxidasa y
cuantificando el incremento en la fluorescencia de las poblaciones celulares mediante la técnica
de citometría de flujo.
Para calcular la proporción de células marcadas en cada ensayo se determinaron valores de
corte (se ilustra para el ensayo en células BHK-21 en los cuadrantes de la figura 10) que
indicaban la posición de más del 99% de las células en las preparaciones empleadas como
control en el experimento (control de células no tratadas, control del conjugado) y se determinó
el porciento de células cuya intensidad de la fluorescencia superó el valor de corte por
incubación con las proteínas biotiniladas.
Las células BHK-21 son susceptibles a la infección productiva del virus Dng (Malewicz y
Jenkin 1979, Kurane y cols. 1990, Mentor y Kurane 1997, Lin Y. W. 2002). Estas constituyen
unos de los sistemas más empleados en los ensayos de neutralización viral por reducción del
número de placas (Morens y cols. 1985.
DIIIE2J mostró una unión diferencial a la superficie celular (Figuras 10 ), lo que se evidencia
con el desplazamiento de las células hacia valores de mayor intensidad de la fluorescencia (FL1)
27
con el incremento de la concentración de proteína, alcanzándose un máximo de 33% del total de
eventos registrados. Como no se pudieron ensayar concentraciones de la proteína superiores a
9.6x10-6 mol/L no fue posible determinar la concentración de saturación.
10 4
Control de conjugado
0
4095
10 0
10 0
10 3
BSA 9.6 x 10-6 mol/L
FL1
10 2
10 1
10 1
10 1
FL1
10 2
FL1
10 2
10 3
10 3
Control de células
0
4095
10 0
10 4
10 4
A
0
4095
FSC
10 4
FSC
DIIIE2J 9.6 x 10-6 mol/L
FSC
B
BSA
D IIIE 2 J
10 3
35
10 1
FL1
10 2
células marcadas (%)
30
25
20
15
10
5
D IIIE 2 J
BSA
10 0
0
c o ntro l
c é lula s
0
4095
c o ntro l
c o njuga do
9 .6 x1 0 -6
mo l/L
4 .8 x1 0 -6
m o l/L
2 .4 x1 0 -6
m o l/L
FSC
10 Unión de DIIIE2J a la superficie de las células BHK-21 determinada por citometría
Figura 18.
de flujo. Las células se incubaron 1h a 4˚C con diluciones seriadas de DIIIE2J biotinilada. Luego
fueron incubadas con el conjugado estreptavidina-fluoresceína 1/500 durante 1h a 4˚C.
Posteriormente se analizaron las muestras en un citómetro de flujo con una longitud de onda de
excitación y de emisión de 532 y 520 nm respectivamente A) Intensidad de la fluorescencia de las
células en 4 puntos del ensayo. FL1: Intensidad de la fluorescencia, FSC: Parámetro de dispersión
directamente proporcional al tamaño de las células. Porciento de células marcadas en cada punto del
ensayo. Se tomaron como positivo las células cuya intensidad de la fluorescencia fuese superior a
101.
28
DISCUSIÓN GENERAL
El dominio III de la proteína E del virus Dng es un barril ß de aproximadamente 100
aminoácidos que contiene numerosos epitopos topográficos y serotipo-específicos, reconocidos
por anticuerpos neutralizantes. Sus características estructurales unidas a numerosas evidencias
experimentales indican que el mismo participa en la interacción de la proteína E con los
receptores del virus en la superficie de las células.
En los trabajos dirigidos a caracterizar la interacción de este dominio con moléculas de la
superficie celular se han obtenido valores de Kd aparente de 30µM (Halstead y cols. 2005)
mientras que la interacción del virus con sus receptores celulares tiene valores de Kd en el rango
entre 98-171 pM (Thaisomboonsuk y cols. 2005). Las diferencias en afinidad sugieren que en
esta interacción puede ser importante la disposición del dominio III en el virión maduro
presentando múltiples copias alrededor de un eje de simetría lo cual favorece una unión
multipuntual. Lo anterior no excluye la posibilidad de que en la interacción con los receptores
celulares participen otras regiones de la proteína E que contribuyan a lograr una unión de mayor
afinidad.
Diferentes variantes recombinantes del dominio III han sido evaluadas como antígenos para
emplear en sistemas de diagnóstico de la infección por dengue (Simmons y cols. 1998b, Ludolfs
y cols. 2002, Beasley y cols. 2004, Holbrook y cols. 2004), como candidatos vacunales
(Simmons y cols. 1998 a, Simmons y cols. 2001, Hermida y cols. 2004 a, b) y en estudios
dirigidos a comprender las diferencias entre los flavivirus basados en las particularidades
estructurales de sus proteínas(Bhardwaj y cols. 2001, Hung y cols. 2004, Jaiswal y cols. 2004,
Chu y cols. 2005).
En nuestro grupo se han evaluado con anterioridad las proteínas PD5 y PD2 que contienen el
dominio III de la proteína de la envoltura fusionado a diferentes fragmentos de la P64K como
ligandos para el aislamiento de los receptores celulares del virus. Como resultado, se aislaron
diferentes proteínas como potenciales receptores para el virus. Sin embargo, estos trabajos
también evidenciaron que el fragmento correspondiente a la P64K constituye una fuente de
interacciones independientes al dominio III lo que contribuye a aumentar la complejidad de los
trabajos dirigidos a caracterizar las interacciones del mismo con las proteínas aisladas.
La proteína DIIIE2J incluye los residuos correspondientes al dominio III de la proteína E del
virus Dng 2, cepa Jamaica 1409. Con anterioridad al presente trabajo se establecieron
29
condiciones para la obtención de una preparación purificada con rendimientos de 60 mg de
proteína por litro de cultivo (anexo 1) Estos resultados hacen atractivo el empleo de esta proteína
no solo en experimentos de caracterización de la interacción con las proteínas aisladas sino
también como ligando en futuros ensayos de cromatografía de afinidad empleando nuevas
preparaciones celulares. Para ser empleada con estos fines es necesario obtener la proteína con
altos niveles de pureza y con un plegamiento que reproduzca los principales elementos
estructurales de esa región en la partícula viral.
Los análisis realizados por electroforesis en SDS-PAGE (Figura 1) y RP-HPLC (Figura 2)
indican que las preparaciones obtenidas como resultado del proceso de purificación de DIIIE2J
presentan un alto grado de pureza y homogeneidad. El análisis por espectrometría de masas nos
permitió además confirmar la formación del puente disulfuro característico de este dominio de la
proteína E (Figura 3).
Los experimentos realizados con LAH y sueros humanos contribuyeron a obtener evidencias de
que DIIIE2J contiene epitopos presentes en el virus maduro (Figuras 5-9 y tabla 3). Teniendo
que la mayor parte de la respuesta generada contra el virus implica epitopos dependientes de
conformación, este resultado además indica que DIIIE2J presenta un plegamiento correcto. Las
evidencias obtenidas acerca del gran impacto que tiene la reducción del puente disulfuro para el
reconocimiento de la respuesta policlonal generada contra el virus constituyen un elemento
adicional a favor del plegamiento de la proteína recombinante (Figura 7).
Un tercer requerimiento para la evaluación de proteínas recombinantes como ligandos de
cromatografía de afinidad es que retengan la capacidad de interacción con moléculas de la
superficie celular. DIIIE2J mostró interacción específica con la superficie de las células BHK-21
(Figuras 11). Este resultado concuerda con resultados publicados en la literatura (Hung y cols
2004).
30
CONCLUSIONES
ƒ
La proteína recombinante DIIIE2J presenta un plegamiento que reproduce características
estructurales y funcionales del dominio III de la proteína E de Dng2 por lo que constituye un
ligando atractivo para emplear en ensayos de aislamiento y caracterización de los receptores
celulares del virus en la superficie de las células.
ƒ
El empleo de DIIIE2J en ensayos de aislamiento y caracterización de los receptores virales
debe conducir a resultados de mayor especificidad que la proteína recombinante PD5 y, en el
establecimiento de las interacciones del dominio III de la proteína E del virus Dng2.
ƒ
El dominio III de la proteína E forma parte de la región de interacción del virus Dng2 con
los receptores celulares en la superficie de
las células BHK-21.
31
RECOMENDACIONES
ƒ
Evaluar la capacidad de DIIIE2J de bloquear unión de virus Dng a la superficie de las
células blanco así como la infección viral.
ƒ
Evaluar la capacidad neutralizante a los cuatro serotipos virales de los sueros humanos
empleados en este trabajo con el objetivo de alcanzar una mayor comprensión de la relación
existente entre los resultados de la determinación de los títulos α-virus y α-DIIIE2J
obtenidos por ELISA.
32
IMPACTO CIENTÍFICO TÉCNICO
ƒ
En este trabajo se realiza la caracterización de la primera proteína recombinante obtenida en
Cuba, que posee los aminoácidos correspondientes al Dominio III de la proteína de la
Envoltura del complejo viral Dengue, sin necesidad de alguna proteína portadora.
ƒ
Los resultados de este estudio han arrojado que la proteína recombinante DIIIE2J reune las
principales características fisico-químicas, antigénicas y funcionales para ser empleada como
ligando en experimentos de cromatografía de afinidad, con el objetivo de aislar los posibles
receptores celulares del complejo viral Dengue en las células susceptibles a su infección. Lo
que facilitaría la identificación de estos receptores.
ƒ
La identificación de los receptores del complejo viral Dengue en las células hospederas
posee una vital importancia en el diseño y obtención de drogas antivirales que impidan la
unión y entrada de las partículas virales a las células.
ƒ
La proteína caracterizada puede ser empleada como control en experimentos
inmunoenzimáticos, tales como ELISA, Western Blotting y Dot Blotting, debido a su
elevada reactividad y especificidad con anticuepos generados contra el Dominio III de la
proteína viral del serotipo 2.
ƒ
El empleo de DIIIE2J en ensayos de aislamiento y caracterización de los receptores virales,
así como en estudios inmunoenzimáticos debe conducir a resultados de mayor especificidad
que la proteína recombinante PD5.
ƒ
En este estudio se emplearon medios y técnicas sofisticadas, de un elevado poder de
detección (Espectrometría de masas, Cromatografía de líquida de alta resolución, Citometría
de Flujo), que garantizaron la seguridad de los resultados.
ƒ
Este estudio generó la salida de una tesis de grado, tiene una publicación en prensa y será
parte de una patente.
33
ANÁLISIS SOCIOECONOMICO
•
Con la realización de este estudio se obtiene un importante impacto para el tratamiento
del dengue clásico o la fiebre hemorrágica del dengue, pues constituye un paso muy
importante para el diseño y obtención de drogas antivirales efectivas contra este
complejo viral que afecta a numerosos países tropicales, incluyendo a Cuba.
•
Como resultado de este trabajo se sentaron las bases para la obtención y caracterización
en nuestro propio laboratorio de las proteínas homólogas a DIIIE2J en los serotipos 1, 3
y 4.
•
Con la caracterización de DIIIE2J se evita obtener procedentes del extranjero diferentes
proteínas recombinantes para ser empleadas en la búsqueda de receptores celulares del
virus dengue.
34
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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37
1.5 Anexo # 1. Resumen del proceso de purificación de la proteína DIIIE2J.
CULTIVO
3 h 37˚C
INDUCCIÓN
0.4M IPTG1
2.5 h 37˚C
OBTENCIÓN DE LA
BIOMASA
Ruptura en
prensa francesa
SOLUBILIZACIÓN
DE LOS CUERPOS
DE INCLUSIÓN
4M GnHCl
RENATURALIZACIÓN
DE LA PROTEÍNA
Dilución de la proteína
hasta 0.05 mg/mL 18 h
4˚C
CROMATOGRAFÍA DE
AFINIDAD EN COLUMNA
DE Ni-NTA
ELUCIÓN
0.1 M Imidazol.
LOTES DE TRABAJO
1- Isopropiltiogalactósido.
38