UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE AGRONOMIA DEPARTAMENTO DE QUIMICA Y TECNOLOGIA

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE AGRONOMIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA Y TECNOLOGIA
CATEDRA DE BIOQUÍMICA
PRACTICA LABORATORIO Nº 1
PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son macromoléculas de alto peso molecular, constituidas por largas secuencias de
aminoácidos, las cuales poseen propiedades físico-químicos específicos como la capacidad de
ionizarse (propiedad ácido – base), la fuerza iónica, la constante dieléctrica y la temperatura, y son
afectadas por cambios modestos en el entorno donde se encuentre la proteína generando variaciones
en su estructura, estos cambios están directamente relacionados con la solubilidad de la misma.
Estas propiedades son utilizadas como método de separación proteica ya que las proteínas
poseen una composición de aminoácidos característica, la cual determina su comportamiento como
electrolito.
Precipitación isoeléctrica.
La solubilidad de la mayor parte de las proteínas globulares se halla profundamente influida por
el pH del sistema. La figura 1 muestra que la solubilidad de la -lactoglobulina, una proteína de la
leche, es mínima cuando el pH se encuentra entre 5,2 y 5,4. A cada lado de este valor crítico del pH,
la solubilidad experimenta un incremento muy agudo. Casi todas las proteínas globulares muestran
un mínimo de solubilidad, aunque el pH al que ello ocurre varía de una proteína a otra.
PH isoeléctrico
Pepsina
Ovoalbúmina
Seroalbúmina
Ureasa
-Lactoglobulina
1 – Globulina
Hemoglobina
Mioglobina
Ribonucleasa
Quimotripsinògeno
Citocromo c
Lisozima
1,0
4,6
4,9
5,0
5,2
6,6
6,8
7,0
9,6
9,5
10,65
11,0
Figura 1. Efecto del pH sobre la solubilidad
de la -lactoglobulina a 25 ºC.
Solubilidad, mg de Nitrógeno/ml
Tabla 1. Puntos isoeléctricos de algunas proteínas.
3
2
1
4,8
5,0
5,2
pH
5,4
5,6
El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico, definido como
aquel valor de pH al que la molécula no posee carga eléctrica y es incapaz de desplazarse en un
campo eléctrico (tabla 1).
En estas condiciones no existe repulsión electrostática entre moléculas de proteína vecinas y
tienden a coalescer y precipitar. Sin embargo, cuando los valores de pH están por encima o por
debajo del punto isoeléctrico, todas las moléculas de proteína poseen una carga eléctrica neta del
mismo signo. Por dicha razón, se repelen mutuamente, impidiendo la coalescencia de las moléculas
sencillas para formar agregados insolubles. Algunas proteínas son virtualmente insolubles en sus
pH isoeléctricos.
Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH isoeléctrico también diferentes, debido
a que difieren en el contenido de aminoácidos con grupos R ionizables, con frecuencia pueden
separarse unas de otras, mediante precipitación isoeléctrica.
La proteína isoeléctrica precipitada permanece en su conformación nativa, y puede redisolverse
en un medio de pH apropiado y concentración salina adecuada.
Para una proteína determinada, el pH isoeléctrico variará según la composición iónica del medio,
puesto que las proteínas pueden unirse a ciertos aniones o cationes. Cuando una disolución de
proteína se dializa a fondo frente a agua destilada para eliminar todos los iones pequeños distintos
de la H+ y OH-, el pH de la disolución resultante se conoce como pH isoiónico. El pH isoiónico es
constante para cualquier proteína determinada.
Solubilización y precipitación por salado de las proteínas.
La capacidad de las sales neutras para influir en la solubilidad de las proteínas está en función de
su fuerza iònica (fig. 1), que constituye una medida tanto de la concentración como de número de
las cargas eléctricas existentes en los cationes y los aniones aportados por la sal.
Fig. 2. Efecto de una sal neutra (K2SO4) sobre la solubilidad de la Carbonil-hemoglobina
Log de la Solubilidad
0,6
0,4
0,2
Fig. 1.
0,0
Efecto de una sal neutra (K2SO4) sobre l
solubilidad de la carbonil-hemoglobina a s
pH isoeléctico.
- 0,2
1,0
2,0
Fuerza iónoca 
Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las proteínas globulares. A
baja concentración, las sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas, fenómeno que recibe
el nombre de solubilización por salado.
Las sales de los iones divalentes tales como el MgCl2 y el (NH4)2SO4, son mucho más eficaces
en la solubilización de las proteínas que las sales de iones monovalentes tales como el NaCl, el
NH4Cl, y el KCl. El efecto de solubilidad por salado está causado por cambios de la tendencia a la
ionización de los grupos R disociables de la proteína.
Por otra parte, a medida que la fuerza iónica aumenta, la solubilidad de una proteína comienza a
disminuir. A una fuerza iónica lo suficientemente elevada, una proteína puede ser casi
completamente precipitada de su disolución, efecto llamado insolubilización por salado.
La base físico-química de la insolubilización por salado es bastante compleja; uno de los factores
que concurren en ella es que la concentración elevada de la sal puede eliminar el agua de
hidratación de las moléculas de proteína, reduciendo su solubilidad; pero también están implicados
otros factores.
La solubilización y la insolubilización por salado, son procedimientos importantes para la
separación de mezclas de proteínas, ya que las diferentes proteínas varían en su respuesta frente a la
concentración de sales neutras.
Las proteínas precipitadas por salado retienen su conformación nativa y pueden disolverse de
nuevo, normalmente sin experimentar desnaturalización. El sulfato amonio es el preferido para
precipitar las proteínas por salado, debido a su gran solubilidad en agua, lo que permite alcanzar
fuerzas iónicas muy elevadas.
Fraccionamiento con disolventes.
La adición de disolventes orgánicos neutros miscibles con el agua, particularmente etanol o
acetona, disminuye la solubilidad de la mayor parte de las proteínas globulares en el agua, de tal
manera que precipitan en su disolución.
El estudio cuantitativo de este efecto muestra que la solubilidad de una proteína a un pH y fuerza
iónica determinados está en función de la constante dieléctrica del medio. Puesto que el etanol
posee una constante dieléctrica menor que la del agua (Fig. 3), su adición a una disolución acuosa
de proteína incrementa la fuerza de atracción entre las cargas opuestas, disminuyendo de este modo
el grado de ionización de los grupos R de la proteína. Como resultado, las moléculas de proteína
tienden a agregarse y precipitan.
Fig. 3. Efecto de la constante dieléctrica del agua sobre la solubilidad de las proteínas
0,6
Agua
% de Solubilidad
0,8
0,4
0,2
20
40
60
80
Constante Dieléctrica (C.D.)
Fig. 3. Efecto de la constante dieléctrica del
agua en la solubilidad de las proteínas
Las mezclas de proteínas pueden separarse basándose en las diferencias cuantitativas de su
solubilidad en mezclas frías de etanol- agua. Una desventaja de este método es que al poder estos
disolventes desnaturalizar a las proteínas a temperaturas superiores, la temperatura a que se trabaja
debe mantenerse muy baja.
Efecto de la temperatura sobre la solubilidad de las proteínas.
Dentro de una fluctuación limitada entre los 0 y los 40º C aproximadamente, la mayor
parte de la solubilidad de las proteínas globulares aumenta al aumentar la temperatura,
aunque existen algunas excepciones, como ocurre con los electrólitos sencillos. Por encima
de los 40 y los 50ºC, la mayor parte de las proteínas aumentan en inestabilidad y
comienzan a desnaturalizarse, como puede observarse en la figura 4. Los procedimientos de
fraccionamiento de proteínas se realizan por norma general a 0ºC o a temperaturas de
refrigerador, ya que la mayor parte de las proteínas son estables a bajas temperaturas; sin
embargo, existen excepciones. Algunas proteínas son más estables y su solubilidad es
máxima a temperatura ambiente o a la temperatura de su entorno celular normal
Figura 4. Efecto de la Temperatura en la solubilidad de las proteínas
%
de Solubilidad
0,8
0,6
Fig. 4. Efecto de la temperatura en la
solubilidad de las proteínas
0,4
0,2
20
OBJETIVOS



40
60
80
Temperatura (º C)
Determinar el efecto del pH, temperatura, constante dieléctrica y fuerza iónica sobre la
solubilidad de las proteínas.
Demostrar las propiedades ácido-base de las proteínas
Determinar la zona de pH isoeléctrico de una proteína mediante ele efecto combinado de pH y
temperatura.
MATERIALES Y REACTIVOS
 Tubos de ensayo
 Ácido Sulfúrico (H2SO4) 1Mc
 Gradilla
 Hidróxido de Sodio (NaOH) al 1 %




 Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 (10%)
 Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 (50%)
 Etanol
Solución de Albumina
Buretas
Cilindro graduado de 10ml
Agua destilada
EXPERIMENTO Nº 1.
DETERMINACION DEL pHI POR TERMOCOAGULACION
Debe colocarse simultáneamente los 3 tubos a 70 ºC por 40 seg (medio neutro, medio ácido,
medio alcalino).
a) Medio neutro
En un tubo de ensayo agregar 3 ml de albúmina y colocarlo a 70 ºC por 40 segundos Observe y
tome nota.
b) Medio Ácido
En un tubo de ensayo agregar 3 ml de albúmina y 3 gotas de Ac. Sulfúrico (1Mc) colocar a 70
ºC por 40 seg., Observe y tome nota.
c) Medio Alcalino
En un tubo de ensayo agregar 3 ml de albúmina y 5 gotas de NaOH al 1%, colocar a 70 ºC por
40 seg., Observe y tome nota.
Preparar un patrón con 3ml de albúmina para hacer la comparación de los resultados obtenidos.
EXPERIMENTO Nº 2.
FACTORES QUE AFECTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEINAS.
Procedimiento
a) Solubilidad e Insolubilidad por salado (fuerza iónica)
En dos (2) tubos de ensayo agregar 3 ml de albúmina a cada uno. Luego adicionar 2 ml
de Sulfato de amonio al 10% a uno de los tubos y al otro 2ml de sulfato de amonio al
50%. Observe y tome nota.
b) Efecto del disolvente sobre la solubilidad.
b.1.- Con solvente orgánico (etanol)
En un tubo de ensayo agregar 3 ml de albúmina y 2 ml de etanol. Observe y tome
nota.
b.2.- Con agua
En un tubo de ensayo agregar 3 ml de albúmina y 2 ml de agua destilada. Observe
y tome nota
c) Efecto de la temperatura
En un tubo de ensayo agregar 3 ml de albúmina y colocar en calentamiento a 70ºC por 1
minuto observe y tome nota
Preparar un patrón con 3 ml albúmina para hacer la comparación de los resultados obtenidos.
UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
Fecha
FACULTAD DE AGRONOMIA
Sección
DEPARTAMENTO DE QUIMICA Y TECNOLOGIA
CATEDRA DE BIOQUÍMICA
FORMATO PARA REGISTRO DE RESULTADOS DEL LABORATORIO Nº 1
NOMBRE
CÉDULA
PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS
EXPERIMENTO Nº 1
Determinación de la zona de pHI por Termo coagulación
Tratamiento
Ácido
Neutro
Alcalino
En qué rango de pH se encuentra el pHI de la albúmina
Resultado
EXPERIMENTO Nº 2.
Otros factores que afectan la solubilidad de las proteínas
Tratamiento
Sulfato de amonio 10%
Sulfato de amonio 50%
Etanol
Agua
Temperatura
Resultado