UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE AGRONOMIA DEPARTAMENTO DE QUIMICA Y TECNOLOGIA

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE AGRONOMIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA Y TECNOLOGIA
CATEDRA DE BIOQUÍMICA
ETAPA I
PRACTICA DE LABORATORIO Nº3
DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.
INTRODUCCIÓN
Una característica especial de la célula, es la capacidad que tiene para llevar a cabo reacciones
químicas rápidamente a temperatura ambiente. Esto se debe a la presencia de un grupo de
sustancias proteicas llamadas enzimas, que catalizan esas reacciones de tal forma, que la velocidad
de las mismas sea compatible con los procesos bioquímicos esenciales para la vida celular. La
naturaleza proteica de las enzimas les confiere especificidad, es decir que cada enzima por lo
general cataliza una determinada reacción, de allí que sean necesarias miles de ellas para que se
realicen las diferentes reacciones químicas en la célula viva. La actividad de las enzimas es afectada
por factores tales como: concentración del sustrato, pH, temperatura, activadores e inhibidores.
Cuando se determina el efecto de un factor sobre la actividad enzimática, se deben mantener
constante los otros factores.
OBJETIVOS
1. Determinar el efecto de la concentración de H2O2 (Sustrato) sobre la actividad de la enzima
catalasa.
2. Calcular la velocidad máxima de reacción (Vmax) y la constante de Michaelis- Menten
(Km), utilizando la gráfica de Lineaweaver – Burk.
FUNDAMENTO
La catalasa es una enzima que se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza (sangre,
hígado, etc.) cuya función es descomponer el Peróxido de Hidrógeno que se produce en la célula.
La reacción de descomposición es la siguiente:
2H2O2
catalasa
H2O+ O2
La catalasa es una de las enzimas más efectivas conocidas ya que una molécula de ella puede
descomponer 5 millones de moléculas de H2O2 por minuto a 0ºC.
La actividad de las preparaciones de catalasa puede determinarse por dos métodos:
a) Midiendo el volumen de O2 producido por manometría; es decir, midiendo el
incremento de uno de los productos formados.
b) Midiendo la concentración H2O2 descompuesto; es decir, midiendo la desaparición del
sustrato.
En esta práctica se utilizará el método (b). Para determinar la concentración de H2O2
descompuesto por la catalasa, se incubará la enzima con una concentración conocida y en exceso
de H2O2 por un determinado tiempo y a temperatura y pH adecuados.
Transcurrido el tiempo de incubación, la catalasa se inactiva acidificando el medio con H 2SO4.
Luego se titula el H2O2 que no se ha descompuesto por la enzima con una solución standard de
KMnO4. Por otra parte, se titula un blanco (control); es decir, un ensayo en el cual no existe
actividad enzimática y por lo tanto se determina la concentración de H2O2 agregada. La reacción de
permanganometría que ocurre es la siguiente:
2 KMnO4 + 4 H2SO4 + 5 H2O2
2 KHSO4 + 2 MnSO4 + 5 O2 + 8 H2O
En esta reacción, el ión permanganato de color violeta es reducido por acción del H2O2 a ión
manganoso que es incoloro. De allí que el punto final de la titulación con KMnO4 viene dado por la
aparición de un color rosado proveniente de un exceso de KMnO4.
MATERIALES Y REACTIVOS.
 Fiolas de 250 ml

H2SO4 2 Mc
 Pipetas graduadas 5-10 ml

KMnO4 0,05 Mc
 Buretas de 50 ml

H2O2 1%
 Soporte Universal

Buffer fosfato pH 7
 Pinza para buretas

Solución Sanguínea 0,1%
PROCEDIMIENTO
a) Numere 10 fiolas de 250 ml y prepárelas como sigue:
Nº 1 – 2
Añada 2ml de H2O2. Agregue 8 ml de agua destilada.
Nº 3 – 4
Añada 4ml de H2O2. Agregue 6 ml de agua destilada.
Nº 5 – 6
Añada 6ml de H2O2. Agregue 4 ml de agua destilada.
Nº 7 – 8
Añada 8ml de H2O2. Agregue 2 ml de agua destilada.
Nº 9 –10
Añada 10ml de H2O2.
b) A cada una de las 10 fiolas agregue 5ml de buffer pH 7. Ahora tendrá 10 fiolas que
contienen 5 concentraciones diferentes de H2O2. Un grupo de 5 fiolas servirá como
control (fiolas impares) y el otro será incubado con la enzima (fiolas pares).
c) Añada a las 5 fiolas control 5 ml de H2SO4 2Mc y agite. Adicionalmente mida 5 tubos
de ensayo 5ml del mismo ácido (H2SO4 2Mc) y guarde para su uso posterior.
d) Añada a las fiolas a incubar (fiolas pares) 10 ml de la enzima. EL TIEMPO DE
INCUBACIÓN DEBE SER CONTROLADO RIGUROSAMENTE A PARTIR DE
QUE CAE LA PRIMERA GOTA DE LA ENZIMA EN LA FIOLA.
e) Cinco (5) minutos después de la adición de la enzima a las fiolas pares, añada 5ml de
H2SO4 2Mc (Medidos previamente en un tubo de ensayo) y agite.
f) Añada 10 ml de la enzima a las fiolas control para completar el volumen
g) Titule las 10 fiolas con KMnO4 0,05 Mc hasta color rosado pálido.
h) Calcule los miligramos de H2O2 degradados.
i) Elabore el gráfico de Lineweaver –Burk.
j) Revise el fundamento teórico y determine los valores de Km y Vmax. Calcule el valor
de Km en mol/lt.
ESTE EXPERIMENTO ESTA RESUMIDO EN EL CUADRO SIGUIENTE:
FIOLA
Nº
H2O2
ml
H2O
ml
BUFFER
ml
H2SO4
Ml
ENZIMA
Ml
TIEMPO
min
H2SO4
ml
1
2
8
5
5
10
-
-
2
2
8
5
-
10
5
5
3
4
6
5
5
10
-
-
4
4
6
5
-
10
5
5
5
6
4
5
5
10
-
-
6
6
4
5
-
10
5
5
7
8
2
5
5
10
-
-
8
8
2
5
-
10
5
5
9
10
-
5
5
10
-
-
10
10
-
5
-
10
5
5
Ejemplos de los cálculos
1) Al concluir la parte experimental usted tendrá 10 valores diferentes de KMnO4
correspondiente a los volúmenes del mismo, empleados para titular 10 fiolas.
Ejemplo:
FIOLA 1 =
23,7 ml de KMnO4
FIOLA 2 =
8,4 ml KMnO4
2) Como se cumple la relación ´
Mc KMnO4 x V KMnO4 = Mc H2O2 x V H2O2
Sabemos que:
Mc KMnO4 x V KMnO4 = mmolc H2O2
Ejemplo:
FIOLA 1 23,7 (ml de KMnO4) X 0,05 (mmolc KMnO4/mL)
FIOLA 2 8,4 (ml KMnO4) X 0,05 (mmolc KMnO4/mL)
FIOLA 1 1,185 mmolc H2O2
FIOLA 2 0,42 mmolc H2O2
De esta manera podemos calcular los Mc de H2O2 existentes en las 10 fiolas.
3) Con los datos siguientes:
PM H2O2 = 34 mg/mmolc
1 mmolc H2O2 = 17 mg H2O2
Calcule los mg de H2O2 existentes en las 10 fiolas.
Ejemplo:
F1
1,185 mmolc H2O2 x 17 mg/ mmolc = 20,145 mg H2O2
F2
0,42 mmolc H2O2 x 17 mg/ mmolc = 7,14 mg H2O2
4) Como la actividad de las preparaciones de catalasa será determinada por medición
del H2O2 degradado tenemos que:
*mg H2O2 totales – **mg H2O2 remanentes – mg H2O2 degradados
*Fiolas controles donde no hubo actividad enzimática ** Fiolas pares donde hubo actividad enzimática
Ejemplo:
20,145 mg H2O2 - 7,14 mg H2O2 = 13,01 mg H2O2 degradados
Al finalizar este cálculo tendremos 5 valores correspondientes a los mg de H2O2 degradados para
cada concentración.
5) En una tabla ” resumen” deberá reflejar los siguientes datos:
(S)
1/S
V
1/V
Correspondiendo a S los mg de H2O2 totales de las 5 fiolas controles.
Ejemplo:
F1 = 20,145 mg
1/ (S): Inverso de la concentración de sustrato.
Entonces,
F1 1/ (S) = 1 / 20,145
1/ (S) = 0,049
V: Velocidad de la reacción, es decir, la descomposición del H2O2 en 5 minutos.
Ejemplo para las fiolas 1 y 2
13,01 mg de H2O2 / 5 min = 2,602 mg de H2O2 descompuestos por minuto.
1/V: al inverso a la velocidad de reacción
Ejemplo para las 1 y 2
1/V = 1/ 2,602
1/V = 0,384
6) Elabore con los datos anteriores el gráfico correspondiente, 1/ (S) en la abscisa y 1/
V en la ordenada.
7) Determine los valores de Km y Vmax
8) Transforme el valor de Km en mol/l , sí el volumen= 30 ml
OBSERVACIÓN: Las fiolas con mayor concentración de H2O2 se tornan rosadas al principio de la
titulación. Debe titularse despacio, gota a gota y agitando bien. Luego, la reacción es bastante
rápida. Esto se debe a que la reacción es auto catalizado.
Fecha
UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE AGRONOMIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA Y TECNOLOGIA
CATEDRA DE BIOQUÍMICA
Sección
PRACTICA DE LABORATORIO Nº2
DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE
LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.
NOMBRE
CÉDULA
1.- En el cuadro siguiente, presente los resultados de las titulaciones realizadas con KMnO4 y
posteriormente calcule la concentración del sustrato (S) y la velocidad de reacción (V) en cada
experimento.
FIOLA
H2O2
ml
H2O
Ml
KMnO4
ml
H2O2
meq
(S)
mg
H2O2
1/( S )
V
mg/min
1/V
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3.- a) Elabore con los datos anteriores el gráfico de Lineaweaver – Burk.
b) Determine los valores de Km y Vmax
c) Transforme el valor de Km en mol/l.
Post Laboratorio N°2
a) ¿Por qué es necesario que el volumen total sea igual en todas las fiolas?
b) ¿Qué finalidad tiene el buffer utilizado en la práctica?
c) ¿Cuándo se estudia el efecto de un factor sobre la actividad enzimática? ¿Qué se
debe hacer con los otros factores?
d) ¿Qué finalidad tiene el uso del H2O2 en el experimento?
e) ¿A qué se debe el color rosado, en el punto final de la titulación?
f) Deduzca la relación de la Lineaweaver- Burk partiendo de la ecuación MichaelisMenten.
g) Mencione otros métodos utilizados para determinar la actividad enzimática