factores que afectan la actividad enzimatica
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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE AGRONOMÍA DEPARTAMENTO DE QUIMÍCA Y TECNOLOGÍA CATEDRA DE BIOQUÍMICA FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La concentración del sustrato. La concentración de la enzima. El pH. La temperatura. Los inhibidores. Los activadores. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO CINÉTICA ENZIMATICA Estudio de las velocidades de reacción catalizadas por enzimas. Rapidez con que varía la concentración de los sustratos. Concentración vs tiempo Velocidad. vs concentración Descripción de los mecanismos de reacción química. Pasos secuenciales para que se lleve a cabo la reacción química. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO Comportamiento gráfico de velocidad en función de la concentración de sustrato Enzima no alostérica S Vo E Características P Vmax 1-.Curva hiperbólica. c b 2-.Comportamiento Asintótico en Vmax. Orden o Orden mixto 3-.Presentan tres comportamientos: Zona a: Aumento de velocidad lineal. a Orden 1 Zona b: Aumento de velocidad no lineal. S Zona c: Velocidad constante (zona de saturación). Comportamiento general La velocidad inicial de reacción aumenta con la concentración de sustrato hasta alcanzar un máximo valor y permanecer constante (saturación). EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO Estudio analítico del comportamiento de la velocidad de reacción en función de la concentración de sustrato Teoría de Michaelis – Mente Mecanismo de reacción K+1 E+S ES Rápida K-1 K2 ES P + E Lenta E+S Reacción Global K+1 K K-1 ES 2 Expresión matemática Vmax S Vo Km S 𝑆 :Concentración de sustrato, M 𝑉𝑜 : Velocidad inicial de reacción, M/s P + E 𝑉max : Velocidad maxima de reacción,M/s 𝐾𝑚 : Constante de Michaelis-Mente, M EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO Definición de los Parámetros cinéticos: Km y Vmax Vo Vmax Velocidad máxima Es la velocidad que se alcanza cuando se ha saturado la enzima con el sustrato. Saturación de la enzima Sustrato ha ocupado los sitios activos de todas las enzimas. (No existe enzima libre). Vmax 2 Km Definición de Km Es la concentración de sustrato en la cual la velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima. S Enzima Sustrato Complejo ES EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO Características de la Constante de Michaelis-Mente A condiciones especificas, su valor depende de la enzima y sustrato. Enzima Sustrato KM Glucosa 0,15 Hexoquinasa Fructosa 1,5 Glutamato deshidrogenasa Glutamato 0,12 NH4+ 57 Tiene unidades de concentración, M Indicativo de la afinidad de la enzima por el sustrato. Afinidad Km Afinidad de la enzima por el sustrato E+S Km 1 Km ES Afinidad de la enzima por el sustrato E+S ES EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO Determinación de Km y Vmax: Gráfico de Lineweaver-Burk Vo Vmax S Km S Linealización: Doble recíprocos 1 K 1 1 m Vo Vmax S Vmax Y = mX 1 + b Vmax m 1 Km Km Vmas Permite determinar con mayor facilidad los parámetros cinéticos. 1 Vmax 1 S EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA Condiciones: 1-.Temperatura y pH constante. 2-. Cantidades saturantes de sustrato. Vo A Mayor conc. De enzima mayor cantidad del complejo ES. V K E A menor conc. De enzima menor cantidad del complejo ES. Enzima Sustrato Complejo ES E EFECTO DEL pH Vo La Enzima se encuentra en su conformación mas activa. pH optimo Es característico de cada enzima Inactivación reversible pH Generalmente el rango esta entre 5 y 9. EFECTO DEL pH Los cambios de pH afectan el estado ionización de los grupos funcionales de las cadenas laterales de la proteína y por lo tanto alteran su conformación, y con ello su sitio activo. A pH optimo: Adecuada distribución de cargas + Sustrato + + - Enzima -+ +-+ Favorecida Complejo ES A pH diferente del optimo: + Sustrato + + + Enzima + + + Complejo ES No Favorecida EFECTO DEL pH Curvas de actividad de la enzima en función al pH Vo Vo Pepsina pH Enzima con centro activo protonado Colinesterasa pH Enzima con centro activo desprotonado EFECTO DE LA TEMPERATURA Temperatura optima V e l o c i d a d Temperatura (°C) EFECTO DE LOS INHIBIDORES Definición Son sustancias que hace disminuir la actividad enzimática o detenerla, a través de interacciones con el centro activo u otros centros específicos (alostéricos). clasifican Irreversible Reversibles E I EI Se unen covalentemente con la enzima. Se unen no covalentemente con la enzima. E I EI Modificación química de la enzima Competitivo No Competitivo Acompetitivo EFECTO DE LOS INHIBIDORES Inhibición Reversible Competitiva. El inhibidor y el sustrato compite por el sitio activo en la enzima. Representación gráfica de la inhibición competitiva. El complejo EI es inactivo, y reduce el número de centros activos útiles . Tiene estructura química similar al sustrato Reduce la conc. De enzima libre Inhibición Competitiva. EFECTO DE LOS INHIBIDORES COMPETITIDAD DEL SUSTRATO Y EL INHIBIDOR POR EL SITIO ACTIVO DE LA ENZIMA Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente EXCLUYENTES; el complejo EI no es productivo. EFECTO DE LOS INHIBIDORES Inhibición Reversible Competitiva. Grafico de Lineweaver-Burk Grafico de Michaelis-Mente Vo 1 Vmax Vmax La inhibición es superada para concentraciones saturantes de sustrato. 1 Vmax Km S.I Km C.I Sin inhibidor. Con inhibidor. S 1 K mS . I 1 K mC . I El inhibidor aumenta el valor de Km, pero no modifica el valor de Vmax 1 S EFECTO DE LOS INHIBIDORES Inhibición Reversible No Competitiva. El inhibidor se puede unir a con la enzima libre o con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo con la acción de ambos. El inhibidor se une en un sitio diferente del centro activo . El complejo EI reduce la velocidad de unión del sustrato Reduce la velocidad para liberar el producto. EFECTO DE LOS INHIBIDORES Inhibición Reversible No Competitiva. Grafico de Lineweaver-Burk Grafico de Michaelis-Mente Vo 1 Vmax S.I Vmax Vmax C.I 1 Vmax C . I 1 Vmax S . I Km S.I = Km C.I Sin inhibidor. Con inhibidor. S 1 Km El inhibidor Dismuniye el valor de Vmax, pero no modifica el valor de Km. 1 S EFECTO DE LOS INHIBIDORES Inhibición Reversible Acompetitiva. El inhibidor no afecta ni a la enzima ni al sustrato, solo se combina con el complejo ES para formar el complejo ESI. El complejo ESI es totalmente inactivo EFECTO DE LOS INHIBIDORES Inhibición Reversible Acompetitiva. Grafico de Michaelis-Mente Vo Grafico de Lineweaver-Burk 1 Vmax S.I Vmax 1 Vmax C.I Vmax C . I 1 Vmax S . I Km C.I Km S.I Sin inhibidor. Con inhibidor. S 1 K mC . I 1 K mS . I El inhibidor afecta tanto el valor de Vmax como el de Km. 1 S Resumen. EFECTO DE LOS INHIBIDORES IR COMPETITIVO IR NO COMPETITIVO IR ACOMPETITIVO EJEMPLO DE IDENTIFICACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS Y NATURALEZA DEL INHIBIDOR Se siguió la cinética de una reacción catalizada por una enzima X sin inhibidor y con inhibidor, los resultado siguen a continuación: Concentración de Sustrato Velocidad Inicial (mM/min) a-. Determine Vmax y Km en la reacción sin inhibidor Sin inhibidor Con Inhibidor 2 10 8 3,5 12 10 4,3 18 12 Vmax 5,3 24 18 2 6,4 24 24 7,8 24 a 24 Vmax S.I = 24 mM/min = 12 Km S.I = 3,5 M b-. Cual es la naturaleza del inhibidor Vmax C.I = 24 mM/min Vmax 2 = 12 Km C.I = 4,3 M Como no varía Vmax y además Km C.I es mayor que Km S.I, entonces estamos en presencia de un inhibidor competitivo EFECTO DE LOS ACTIVADORES Son moléculas pequeñas, generalmente iones inorgánicos, que son requeridos o al menos estimulan, la actividad catalítica de una enzima. Mecanismo de acción Interacción obligatoria con la enzima libre E+ A EA + S EA EA Conformación optima de la enzima EAS EA + P Interacción obligatoria con el sustrato libre S+ A SA + E PA SA Verdadero sustrato ESA E + PA P + A La presencia de los activadores son indispensable para la actividad enzimática. Bajas concentraciones de los activadores disminuye la cantidad de EA o SA y por lo tanto se reduce la cantidad de producto. EFECTO DE LOS ACTIVADORES Enzimas Activador Enzima-activador Menor concentración de A Menor cantidad de enzimas óptimamente activas Enzimas Activador Mayorconcentración de A Mayor cantidad de enzimas óptimamente activas GRACIAS! ! !
