espectroscopía de absorción uv aplicada al

Prácticas de Laboratorio para un Curso de
Biología Estructural
Autor: Dr. Mario R. Ermácora
Bioquímica de Macromoléculas
ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN UV APLICADA AL
ESTUDIO DE LA CONFORMACIÓN DE PROTEÍNAS
Objetivos
Estudiar cambios conformacionales proteicos de la Anhidrasa Carbónica Humana
inducidos por desnaturalizantes, utilizando técnicas espectroscópicas de absorción UV.
Simular el espectro de la proteína desnaturalizada a partir de soluciones de compuestos
modelo.
Introducción
El espectro UV de las proteínas
El alumno, antes de la realización del trabajo práctico, debería repasar los fundamentos
de la espectroscopía de absorción UV, ya que los mismos no serán tratados en esta
guía.
Los cromóforos más útiles presentes en las proteínas corresponden a los residuos
aromáticos (absorben a 260-290 nm). Otros grupos (por ejemplo el enlace peptídico)
absorben intensamente a 200-220 nm pero son menos utilizados porque las mediciones
a longitudes de onda tan corta son técnicamente complicadas.
En una primera aproximación, el espectro UV de una solución proteica es la sumatoria
de los espectros de los residuos que constituyen la cadena polipeptídica. En la práctica,
el entorno fisicoquímico de cada residuo afecta sus propiedades espectroscópicas. Por
lo tanto se observan variaciones pequeñas pero significativas en el espectro de la
proteína comparado con el espectro calculado a partir de la suma teórica de los
constituyentes en un medio acuoso. Esas diferencias son muy útiles porque permiten
detectar cambios en el microentorno de los residuos aromáticos debidos a transiciones
conformacionales.
Características de un espectro UV de proteínas
Como modelos utilizaremos los espectros de N-Ac-Trp (NATA), N-Ac-Tyr (NAYA) y
una solución del aminoácido fenilalnina. Nos limitaremos fundamentalmente a la
región del espectro donde absorben los residuos de tirosina, triptofano y fenilalanina
despreciando las propiedades espectrales de cistina y otros aminoácidos con
coeficientes de extinción molar pequeños en esta región.
Estos espectros permitirán simular el espectro UV entre 270 y 320 nm para cualquier
proteína de composición aminoacídica conocida en condiciones de máxima exposición
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de residuos en solución acuosa. Para simular dicho espectro solo se necesita sumar para
cada condición los espectros de triptofano, tirosina y fenilalanina en la proporción
deseada.
Uno de las primeras tareas de este trabajo práctico será familiarizarse con los máximos
y puntos de inflexión atribuibles a los residuos considerados y en condiciones de
máxima exposición.
El espectro real de una proteína será en general muy semejante al calculado aplicando
el procedimiento descripto más arriba. Las diferencias observadas serán atribuibles a
los efectos conformacionales determinados por la estructura proteica. Estos efectos
resultan basicamente del ocultamiento de los residuos aromáticos en el corazón
hidrofóbico de la proteína, lo que por supuesto altera los espectros y tambien a efectos
de interacciones específicas, como puentes de hidrógeno, salinos, cercanía orientada de
nubes electrónicas, interacciones aromáticas específicas, etc.
El propósito de este trabajo práctico será determinar primero y discutir después los
espectros de absorción de la anhidrasa carbónica humana en su estado nativo y en su
estado desnaturalizado (considerando que los fragmentos peptídicos resultantes de la
digestion total de la proteína con proteinasa K carecen de estructura).
Espectros de absorción de orden enésimo
Como veremos más adelante al examinar los espectro correspondientes a los péptidos,
los picos de absorción de la tirosina y el triptofano en la región de interés no están bien
resueltos y existe una considerable superposición entre ellos. Como se deben
interpretar diferencias bastante sutiles, normalmente se recurre a la derivación
numérica de los datos del espectro de orden cero. Por razones que se expondrán
enseguida esta técnica facilita la asignación de los máximos y el cálculo del
corrimiento de los mismos bajo distintas condiciones experimentales.
Veamos cómo se calcula numéricamente el espectro derivada. Es preciso recordar que
siempre vamos a trabajar con pares discretos de valores x,y donde la variable
dependiente y se observa a intervalos regulares de x. y corresponde a la absorbancia de
la solución y la llamaremos A. La variable x representa valores de longitud de onda y la
llamaremos lambda ().
Se trabaja con intervalos lo suficientemente pequeños de  como para que lo calculado
se aproxime al concepto de derivada teórica. Por esta razón es importante contar con
pares de datos espaciados cada 0.1 nm o menos como punto de partida. Típicamente
esto lleva a manejar un conjunto de 1000 pares de datos para un espectro entre 240 y
340 nm.
Si bien hay otras maneras de cálculo es importante, a fines ilustrativos considerar el
procedimiento primitivo de derivación: dy/dx=yx. O, en el caso de un espectro
A/.
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Si desarrollamos este concepto tenemos que para una longitud de onda dada:
1.1
A=Cm  l
Donde  es el coeficiente de extinción molar, Cm es la concentración molar del
compuesto en la solución y l es el paso de la celda de medición.
Así surge inmediatamente que:
1.2
A/= (Cm 2 l – Cm 1 l) / (2-1) = Cm l (2 -1) / (2-1)
Como se puede ver de la última ecuación surgen dos cosas importantes. Primero la
amplitud de un espectro de derivada es una función lineal de la concentración. En esto
es igual que el espectro de orden cero. A diferencia del espectro de orden cero depende
también del intervalo l escogido y de la diferencia 2 -1.  depende de las
condiciones escogidas por el experimentador y en cierto sentido también a limitaciones
del instrumental. 2 - 1 debería, en condiciones ideales, ser una constante como lo es .
En la práctica es más difícil de determinar que 1. porque está más infuenciada por
factores tales como la capacidad de resolución espectral del instrumento.
Si suponemos  una constante fijada por el experimentador entonces queda en
evidencia el aspecto fundamental que diferencia a los espectros de orden cero de los de
derivada. El valor  depende de la forma de las bandas de absorción y no sólo de la
intensidad de las mismas. La derivatización muestra más claramente las diferencias
entre bandas de absorción porque incorpora la información de la forma de los picos a la
amplitud del espectro.
La derivada primera de una curva se hace cero en los máximos y mínimos de la función
original. Los puntos de inflexión de la función original corresponden a máximos y
mínimos en la primer derivada. Como se dijo, el valor absoluto de la función derivada
es mayor cuanto más abrupto es el cambio de la función original. En el caso de los
espectros de absorción que pueden considerarse como una suma de n gausianas, cuanto
más estrecha es la banda de absorción mayor será el valor absoluto de la función
derivada. Este fenómeno trae aparejado dos aspectos, uno positivo y uno negativo. El
positivo es que los componentes más agudos serán enfatizados mediante la derivación
y esto ayuda a localizar los picos de los cromóforos de interés. Componentes anchos
del espectro, típicos de interferentes heterogéneos, dispersión de luz por material
particulados, algunos grupos prostéticos, etc. pierden peso respecto a los componentes
más específicos. El aspecto negativo es que el "ruido," típico de toda determinación
experimental suele ser de alta frecuencia con respecto a la longitud de onda y como
todo componente de alta frecuencia será enfatizado por la derivación.
El problema del "ruido" y su efecto negativo respecto a la técnica de derivación puede
ser disminuído mediante una cuidadosa selección de las condiciones experimentales
(mejorando los espectros de orden cero mediante la promediación de varios de ellos) y
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mediante un tratamiento previo de los datos que reconoce y remueve el ruido con
mínima distorsión de la señal genuina.
La derivación sucesiva tiene ventajas adicionales por cuanto permite el incremento de
la señal de interés en cada ciclo. Sin embargo, en la práctica solo es posible avanzar
unos cuantos ciclos de derivación sin que aparezcan artefactos debidos a la
amplificación de señales espúreas (ruido). La derivada segunda de un espectro de
absorción es lo suficientemente poderosa como para discernir todos los detalles de
interés que podrían estár semiocultos en un espectro de orden cero. Por lo tanto la
derivada segunda se usa corrientemente. La derivada cuarta, si el ruido de los espectros
originales permite usarla, tiene la ventaja adicional de la coincidencia de máximos y
mínimos con los del espectro de orden cero (el máximo en un espectro de orden cero
aparece como un máximo en el espectro de orden 4).
Aspectos instrumentales
En el trabajo práctico se utilizará un espectrofotómetro Shimadzu UV160. Este es
probablemente el equipo más sencillo que puede usarse para un trabajo práctico como
el presente. Veamos porqué.
a) Se necesita un equipo capaz de realizar un barrido espectral y obtener datos digitales
suceptibles de ser manipulados posteriormente por una computadora.
b) Los datos deben ser precisos, con poco ruido, reproducibles y además deben ser
significativos cuando son obtenidos a intervalos de 0.1 nm.
Si bién muchos equipos comerciales traen hoy incorporados algoritmos y
procedimientos para obtener espectros de derivada es necesario analizar en cada caso
los parámetros de derivación para obtener los mejores resultados. Generalmente los
procesos "default" no son apropiados para todos los casos. En el trabajo práctico se
discutirá como estos parámetros son optimizados para el estudio de espectros de
proteínas.
Procedimiento experimental
Luego de prepar las soluciones que se indican en la sección “Reactivos” se procederá a
obtener diez espectros para cada tubo (ver “Datos a colectar”). El espectrofotómetro se
programará para que recoja los datos automáticamente y los guarde en una serie de
archivos ASCII. La nomenclatura de los archivos debe ser cuidadosa para facilitar el
tratamiento posterior de los datos.
El espectrofotómetro se inicializará con los parámetros "slow" para la velocidad de
barrido y 340–240 para el intervalo de barrido. Automáticamente el equipo colectará
datos cada 0.1 nm.
Una vez obtenidos los datos se promediarán los espectros en una planilla de cálculo.
Uno de ellos se promediará "manualmente" como ejemplo y los siguientes se
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procesarán con un "macro" escrito a tal efecto. Se selecciona el grupo de datos
correspondientes a una serie y se copian dentro del programa “TeachText”. El archivo
generado se guarda dentro de la carpeta adecuada en formato texto, con la extensión
“Files”. El mismo procedimiento se sigue para el blanco correspondiente a esa serie de
datos. Los archivos con la extensión Files se abren dentro del programa “Consolidar
1.2” y el resultado se guarda con la extension “Con”, que indica que la serie ha sido
promediada. Una vez obtenidos los promedios para cada serie y su blanco, se ejecuta el
programa “SpecDif 1.2”, que restará el blanco a la solución de proteína que
corresponda; dicho archivo llevará la extension “Dif”. Los archivo así generados se
abren dentro del programa “Kaleidagraph” y se grafican los datos para examinar la
forma general del espectro (y corregir por ligth scattering si fuera necesario). Los datos
correspondientes a distintas series de una misma muestra, se promedian dentro de este
programa y se corrigen llevando el valor de absorbancia (correspondiente a la longitud
de onda seleccionada) al valor determinado en la literatura para su coeficiente de
extinción molar.
Una vez obtenidos los promedios totales , se guardan en formato texto con la extensión
“KGH” para indicar que ya han sido procesados en Kaleidagraph. Más tarde, se abren
en “TeachText” para eliminar los caracteres que el programa anterior hubiere agregado.
Los archivos obtenidos serán el "input" para el programa Derivada 1.3, otro utilitario
en C que calculará los espectros suavizados, la derivada cuarta del los mismos y
localizará los máximos y mínimos de interés.
A continuación, y usando los espectros de NATA, NAYA y fenilalanina, se simulará el
espectro teórico de la anhidrasa carbónica en base a su composición en esos
aminoácidos.
Finalmente se usará la capacidad gráfica de la planilla de cálculo para representar los
espectros obtenidos y se construiran las Figuras que corresponda como informe del
trabajo práctico. Con el "set" completo de figuras se procederá a discutir los resultados
obtenidos.
Los detalles acerca de los programas utilizados serán explicados por el instructor.
Datos
Anhidrasa Carbónica
NATA
NAYA
Fenilalanina:
 (280): 54800
 (280): 5390
 (275): 1390
 (257.4): 284.57
Reactivos
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Anhidrasa Carbónica nativa: en buffer Tris-SO4=
Anhidrasa Carbónica digerida con proteinasa K: Relación 1:10 (mg/mg) proteina
proteasa
Blanco de proteólisis: la misma cantidad de proteasa que se utilizó para la digestion en
buffer.
Proteinasa K: 10 mg/ml en agua. Se prepara en el momento.
NATA: 0.045 mg /ml (0.185mM) en agua.
NAYA: 0.159 mg /ml (0.719 mM) en agua.
Sc. fenilalanina: 0.515 mg /ml en agua.
Datos a colectar:
Solucion de Fenilalanina
Sc. De NATA
Sc. De NAYA
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