IA-MBA-PT-021 Serotipificación de Salmonella spp.

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Serotipificación de Salmonella spp.
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Aprobado por: Jefe de Sección
1. Objetivo
Identificar por medio de antisueros específicos las serovariedades de Salmonella spp
2. Alcance
Aplica a las cepas de Salmonella aisladas en la sección de Microbiología de Alimentos y
Microbiología Médica Veterinaria.
3. Responsabilidad y autoridad
Jefe de Sección: velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento.
El Coordinador Técnico de Sección debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en
este procedimiento.
Analista: La identificación del serogrupo de Salmonella spp.
4. Definiciones
No aplica
5. Abreviaturas y/o siglas
Spp: especies
6. Referencias y/o Bibliografía
IA-MBA-PE-021-RE-001 Muestras positivas: Salmonella spp.
IA-MBA-PE-021-RE-002 Prueba de Serotipificación de Salmonella spp
Instructivo Antisueros Salmonella DENKA SEIKEN
Fórmulas antigénicas de serovariedades de Salmonella según esquema Kauffmann-White
Manual de Procedimientos para Serotipificación de Salmonella. Organización Mundial de la Salud
2001
7. Descripción del procedimiento
7.1 Fundamento teórico
El método que se utiliza es el de aglutinación en placas de microtitulo, se basa en una reacción
antígeno –anticuerpo. En una prueba positiva se observa aglutinación macroscópica.
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7.2 Materiales, Equipo, Medios y reactivos
7.2.1 Materiales
Asa bacteriológica
Palillos de madera estériles
Placas de microtitulo esteriles de fondo plano o en u, con tapa
Portaobjetos
Puntas de micropipeta esteriles
7.2.2 Equipo
Calentador
Centrifuga
Incubadora a 35 °C +/- 1°C
Micropipetas
Agitador mecánico (vortex)
Baño María (49 °C± 1°C)
Lámpara de luz blanca
Pipeteador eléctrico
7.2.3 Medios y reactivos
Agar base sangre
Caldo trypticasa-triptosa
Medio GARD
Solución salina 2%
Solución salina 0.85 %
Solución salina formalinizada 1%
Set de inducción
Set de antisueros 1
Set de antisueros 2
Set de antisueros 3
Set de antisueros 4
Set de antisueros 5
Set de antisueros 6
Set de antisueros 7
7.3 Procedimiento
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7.3.1 Rayar placa de agar base sangre con la cepa de Salmonella spp. a serotipificar e incubar a 35 °C ±
2°C por 24 horas.
7.3.2 Agregar a un tubo 0.5 ml de solución salina 2% y preparar suspensión de la cepa siguiendo
instrucciones del fabricante del antisuero (suspensión de antígeno).
7.4 Prueba somática en lámina
7.4.1 Colocar en un portaobjetos 30 µl de solución salina 0.85% y colocar 10 µl de suspensión de
antígeno, con un aplicador estéril homogenizar y realizar movimiento circular al portaobjeto por un
minuto
7.4.2 Si se observa formación de grumos, la cepa es rugosa y puede dar falsos positivos. Subcultive en
AS o ATS, hasta obtener colonias lisas y repita el procedimiento.
Si no hay formación de grumos indica que la cepa es lisa y se puede continuar con la
prueba en el punto 9.3.3
7.4.3 Colocar una gota de antisuero polivalente Grupo O y 10 µl de suspensión de antígeno,
homogenizar con un aplicador estéril realizar movimiento circular al portaobjeto por un minuto
7.4.4 Si se observa la formación de grumos la prueba es positiva para el antisuero polivalente Grupo O,
seguir con el punto 9.3.6
7.4.5 Si no se observan grumos la prueba es negativa para el antisuero polivalente Grupo O y se debe
probar con el antisuero polivalente Grupo O1
7.4.6 Probar con los siguiente 8 antisueros de la misma forma que en el punto 9.3.3 (utilizar set n°1)
O2
O4
O7
GRUPO O
O8 O9 O9,46 O3,10 O1,3,19
7.4.7 Si la prueba es positiva para el antisuero polivalente Grupo O1, probar con los siguientes 7
antisueros, de la misma forma que en el punto 9.3.3 (utilizar set n°1)
GRUPO O1
O11 O13 O6,14 O16 O18 O21 O35
7.4.8 Esta prueba define el grupo somático que pertenece la cepa. Anotar resultados en formulario IAMBA-PE-021-RE-002 Prueba de Serotipificación de Salmonella spp.
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7.4.9
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Si no hay aglutinación con los antisueros polivalentes O y O1 repita los pasos 9.3.3 y 9.3.4
con antisuero Vi. Si la reacción es negativa puede que la cepa no sea Salmonella o que
pertenezca a un serogrupo que no esté incluido en los antisueros polivalentes O y O 1 usados
en la prueba. Si la reacción es positiva con el Vi seguir los siguientes pasos:
En un tubo colocar 0.2 ml de la suspensión de la cepa para grupo y adicionarle 2 ml de solución
salina fisiológica y calentar a 121°C por 15 minutos o a 100°C por 1 hora.
Luego centrifugar el tubo a 900 gravedades por 20 minutos y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 0.2 ml de solución salina fisiológica. Repita los pasos 9.3.3 y
9.3.4.Si la prueba es positiva, la cepa puede ser S. Typhi, S. Paratyphi C o S. Dublin.
7.5 Prueba flagelar
7.5.1 Inocular un tubo de caldo trypticasa-triptosa de 5 ml con la cepa rayada en el agar base sangre e
incubar a 35 °C ± 2°C por 24 horas. Separar 0.5 ml en un tubo estéril y Guardar a 4 °C por si es
necesario hacer inducción de fase.
7.5.2 A los 4,5 ml de caldo trypticasa triptosa restantes agregar 4,5 ml de solución salina formalinizada
1% , dejar a temperatura ambiente de 1 a 24 horas (suspensión antígeno H)
7.5.3 Colocar en un pocillo de una placa de microtitulación 100 µl de suspensión antígeno H y agregar 50
µl de solución salina 0,85 % (control negativo)
7.5.4 Colocar en pocillos individuales de una placa de microtitulación 100 µl de suspensión antígeno H y
agregar 30 µl de cada antisuero más 20 µl de solución salina 0.85 % (set 2, set 3, set 5, set 6).
Se debe probar los antisuero flagelares de la fase 1 de acuerdo grupo sómatico obtenido; estos
antígenos de fase 1 corresponden a la tercera columna del esquema de Kauffmann-White.
Registrar en IA-MBA-PE-021-RE-002.
7.5.5 Incubar a 49 °C± 1°C por 1 hora.
7.5.6 Revisar aglutinación en placa, para esto utilizar lámpara luz blanca. La visualización de pequeños
grumos indica una prueba de positiva. Anotar resultados en formulario IA-MBA-PE-021-RE-002.
7.5.7 En el pocillo de control negativo no debe observarse ninguna aglutinación; si la hay indica que la
cepa es rugosa y se invalida la prueba. Si no hay aglutinación se puede continuar con el punto
9.4.8.
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7.5.8 De acuerdo al antígeno de fase 1 comprobado se delimita un grupo de posibles cepas ; a
continuación se deben determinar los antígenos de fase 2 , estos corresponden a la cuarta
columna del esquema de Kauffmann-White.
7.5.9 Colocar en una placa de microtitulación 100 µl de suspensión antígeno H y agregar 30 µl de cada
antisuero de fase 2 más 20 µl de solución salina 0.85 %, que corresponden a la cuarta columna
del esquema Kauffmann-White. Registrar en IA-MBA-PE-021-RE-002
Antígenos Fase 2
H-1 H-2 H-5 H-6 H-7 H-Z6 H -en
H-x
H-w
H-Z15
7.5.10 Utilizar lámpara para revisar aglutinación. Si se observan pequeños grumos (prueba positiva),
reportar en formulario IA-MBA-PE-021-RE-002.
7.5.11 Si no se observan grumos (prueba negativa) realizar inducción de fase.
7.6 Inducción de fase
7.6.1 Fundir tubos de medio GARD y dejar enfriar a 50°C aproximadamente.
7.6.2 Agregar 200 µl de antisuero de inducción correspondiente al antígeno de fase 1 determinado, agitar
y verter en placa de petri (5cm diámetro X 1,5 cm alto)
7.6.3 Dejar que se solidifique, rotular placa y secar por aproximadamente 20 min en cámara de flujo
laminar.
7.6.4 Inocular, de forma superficial, una asada del caldo tripticasa-triptosa para inducción de fase del
punto 9.4.1 en el centro de la placa. La superficie del medio no debe de estar muy húmeda, ni
tampoco reseca.
7.6.5 Incubar en cámara húmeda a 35 °C ± 2°C por 18 a 24 horas o hasta observar migración del
crecimiento ( 1 a 3 días ) en la superficie de la placa a partir del inóculo inicial.
7.6.6 Del crecimiento bacteriano de la periferia de la placa inocular un tubo de caldo trypticasa-triptosa de
5 ml e incubar a 35 °C ± 2°C por 24 horas.
7.6.7 Realizar de nuevo la prueba flagelar de antígenos de fase 2.
7.6.8 Anotar resultados en formulario IA-MBA-PE-021-RE-002 y revisar el esquema Kauffmann-White
para determinar el serotipo de Salmonella analizada.
8 Anexos
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