cromatografía líquida: en columna clásica y en capa fina
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA: EN COLUMNA CLÁSICA Y EN CAPA FINA La cromatografía es una técnica que data de primeros de siglo, gracias a los trabajos del botánico ruso Mikhail Tswett. Mediante la misma los componentes de una mezcla se separan según las distintas velocidades con que se desplazan a través de un medio llamado fase estacionaria, cuando son transportados por una fase móvil, líquida o gaseosa. La gran clasificación de las técnicas cromatográficas se basa precisamente en la naturaleza de la fase móvil, pudiéndose considerar dos grandes grupos de técnicas: Cromatografía de líquidos (Fase móvil líquida) Cromatografía de gases (Fase móvil gaseosa) A su vez la cromatografía de líquidos se clasifica según la forma en la que se dispone la fase estacionaria, en Cromatografía Laminar o plana Cromatografía en columna Cromatografía líquida en columna En esta modalidad la fase estacionaria está formada por pequeñas partículas que rellenan un tubo o columna. Este tubo puede ser de vidrio, acero u otro material inerte. Podemos considerar desde el punto de vista cronológico dos tipos de cromatografía líquida en columna, la llamada C.L. en columna, clásica y la C.L. en columna instrumental, también llamada cromatografía líquida de alta resolución o HPLC, en siglas inglesas. La C.L. clásica tiene su origen en los experimentos de Tswett, y se caracteriza por los siguientes aspectos: - La preparación de la fase estacionaria suele ser manual - El flujo de fase móvil es por gravedad - Aplicación manual de la muestra - La separación requiere varias horas - Se recogen fracciones que posteriormente son analizadas por otras técnicas - La eficacia de las separaciones es pequeña Fig. Por estos motivos y aunque sigue teniendo un gran valor histórico y alguna utilidad para casos concretos, actualmente ha sido desplazada casi por completo por la cromatografía líquida instrumental o de alta resolución, que se basa en el empleo de una instrumentación compleja y se caracteriza por una gran eficacia y poder de resolución. Cromatografía Laminar o Plana Es una modalidad de cromatografía líquida caracterizada por el hecho de que la fase estacionaria está dispuesta en forma de plano o lámina, y la fase móvil fluye a través de ella por capilaridad o por gravedad. Se emplean las mismas fases estacionarias que en cromatografía líquida en columna, y se diferencia únicamente de aquella en el hecho de que en cromatografía laminar el analito no abandona el lecho cromatográfico sino que se detiene el proceso cuando la fase móvil llega al extremo del plano o lecho cromatográfico. En cromatografía laminar podemos considerar dos modalidades: Cromatografía sobre papel, en la que la fase estacionaria esta constituida por un papel especial. Hoy día prácticamente ya no se emplea. Cromatografía en capa fina (C.C.F.), caracterizada porque la fase estacionaria está dispuesta en forma de lámina formada por pequeñas partículas extendidas sobre una superficie inerte o soporte de vidrio, aluminio, plástico, ..... Actualmente tiene una gran utilidad y en adelante nos referiremos exclusivamente a esta modalidad. Técnica empleada en cromatografía en capa fina En toda separación llevada a cabo mediante C.C.F. hay que seguir una serie de etapas: 1ª Preparación de la placa cromatográfica 2ª Aplicación de las muestras y los patrones 3ª Desarrollo del cromatograma 4ª Revelado y detección 5ª Análisis cualitativo y cuantitativo (en su caso) - La preparación de la placa cromatográfica pude llevarse a cabo en el laboratorio, para lo cual se prepara una pasta homogénea, mezclando la fase estacionaria con un disolvente como agua o cloroformo, y a continuación se extiende dicha pasta sobre una superficie limpia de vidrio, de forma manual o empleando un extensor. El objetivo es que se forme una lámina delgada – entre 0.15 y 0.25 mm de espesor- y homogénea de fase estacionaria. Una vez seca la placa, a temperatura ambiente o en estufa, está lista para su uso. Actualmente en el comercio se dispone de placas cromatográficas que ya vienen preparadas sobre soportes de aluminio o vidrio, de diferentes tamaños. También se pueden cortar al tamaño deseado. Así mismo hay disponible una gran variedad de fases estacionarias. - Aplicación de las muestras y los patrones. Para ello se traza con un lápiz, sin apretar, una raya a unos pocos centímetros de un extremo de la placa. Sobre dicha raya se sitúan, debidamente espaciadas, las disoluciones de muestras y patrones, con ayuda de un capilar o microjeringa. Cada aplicación debe dar lugar a una manchita de menos de 4 mm de diámetro, para lo cual entre aplicación y aplicación se deja secar la placa. - El desarrollo del cromatograma o elución se lleva a cabo en una cámara de desarrollo, que es un recipiente de vidrio con el fondo plano y en el que con suficiente antelación se ha depositado un pequeño volumen de fase móvil al objeto de que la cámara se sature con los vapores de la misma. - Aunque hay diversos tipos de desarrollo, el más habitual es el simple ascendente que consiste en sumergir la placa en la fase móvil por el extremo en el que se han aplicado las muestras pero cuidando de que el nivel de fase móvil quede por debajo de los puntos de aplicación. Se cierra la cámara herméticamente y se deja en completo reposo mientras la fase móvil asciende lentamente por capilaridad y tiene lugar la elución y separación de los analitos. El proceso termina cuando la fase móvil llega casi al extremo superior de la placa. Se saca la placa, se deja secar y se pasa a la etapa siguiente. - Revelado y detección. Esta etapa tiene por finalidad poner de manifiesto la situación en la que ha quedado en la placa cada uno de los analitos, cuando éstos no son visibles por no presentar color. El proceso de revelado se puede llevar a cabo por métodos químicos, mediante la pulverización de la placa con algún reactivo que reaccione con los analitos y los transforme en un compuesto visible, o bien, por métodos físicos, como cuando se irradia la placa con luz U.V. para detectar la presencia de compuestos fluorescentes. Como agentes químicos de revelado más habituales se emplean el H2SO4, los vapores de Yodo, la ninhidrina –para aminoácidos-... etc. - Análisis Cualitativo y Cuantitativo. Finalmente se procede a la identificación de los analitos por comparación de las distancias recorridas por los mismos con las de los patrones. Para ello se utiliza un parámetro que es el RF o factor de retraso. RF Zs Zf Frente de la fase móvil ZZ Zs Zf El RF es característico de cada analito Para unas determinadas condiciones cromatográficas Línea de aplicación La cuantificación de los analitos puede llevarse a cabo directamente sobre la placa con ayuda de un densitómetro, o bien separando la zona en la que está el analito, eluyéndolo con un disolvente adecuado y cuantificándolo con otra técnica.