Marcapasos neuronales En el presente trabajo se realizan simulaciones con Matlab que permiten modelar el estudio realizado por Naohiro Koshiya y Jeffery C. Smith (Nature 400 pp 360-363,(1999)) sobre la actividad neuronal en el complejo de PreBötzinger. En particular se modela el acoplamiento entre neuronas marcapasos y neuronas “seguidoras” (ambas generadoras del ritmo respiratorio) capaces de realizar bursting, acoplados entre si a través de sinapsis excitatorias que sincronizan su actividad. Introducción Las neuronas se comunican mediante disparos y transmisiones de los potenciales de acción. Comúnmente, los potenciales de acción son periódicos como respuesta a una corriente aplicada de suficiente magnitud. Por ejemplo, en los modelos de Hodgkin-Huxley (H-H) y FitzHugh-Nagumo, una corriente constante aplicada puede causar repetitivos disparos de los potenciales de acción. Muchos tipos de células exhiben un comportamiento más complejo, caracterizado por breves explosiones de actividad oscilatoria entremezclada con períodos de reposo en donde el potencial de membrana cambia lentamente. Este comportamiento es llamado bursting [1]. En las membranas de las células excitables, los iones más importantes que intervienen en las despolarizaciones de dicha membrana son el Na+ y el K+. Sin embargo, en ciertas células el Ca2+ interviene, modificando el curso de la despolarización, manteniéndola por períodos más prolongados (como en las fibras cardíacas) o bien produciendo sucesivos disparos en una misma despolarización de la membrana (bursting). El modelo de Hodgkin y Huxley (H-H) es el resultado de una rica combinación de experimentación y análisis teórico. Los datos fisiológicos en los que Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel fundamentaron su teoría fueron recolectados durante un breve intervalo de tiempo en 1949. Por este trabajo Hodgkin y Huxley obtuvieron el premio Nobel de fisiología en 1963, y abrieron un gran horizonte de investigación en el que todavía se trabaja intensamente. Si bien el modelo H-H tiene limitaciones, ha contribuido de manera fundamental a la modelación matemática en neurobiología. La dinámica de las corrientes iónicas a través de estos canales y del voltaje a través de la membrana es modelada por un sistema de cuatro ecuaciones diferenciales no lineales. Una fuerte limitación de este modelo es que no permite dar cuenta del importante fenómeno de bursting de potenciales de acción, que requieren tomar en cuenta elementos adicionales [2]. Existen en el reino animal células capaces de disparar potenciales de acción en forma intrínseca con una frecuencia determinada. A este tipo de comportamiento neuronal se lo denomina marcapasos. Si bien estas células presentan conexiones nerviosas con el Sistema Nervioso Central (SNC) el ritmo y el automatismo de los disparos de los potenciales de acción no dependen directamente del SNC: muchas veces el SNC actúa coordinando y sincronizando la frecuencia de disparos generada en el propio marcapasos. 1 Los marcapasos se observan habitualmente en aquellas células que deben realizar constante (o por largo período) y repetidamente alguna actividad, generalmente, actividad cinética (e.g. las fibras cardíacas contrayéndose, neuronas en el vuelo de las langostas)[3]. En el trabajo publicado por Naohiro Koshiya y Jeffery C. Smith, “Neuronal pacemaker for breathing visualized in vitro” [4] se estudia la actividad neuronal en el complejo de Pre- Bötzinger a partir de la cual se supone que se generan los movimientos respiratorios en los mamíferos. Se intenta mostrar que el ritmo respiratorio es generado por una red de marcapasos neuronales, capaces de realizar bursting, acoplados entre si a través de sinapsis excitatorias que sincronizan su actividad. Además proponen que las neuronas inspiratorias, que no poseen propiedades intrínsecas de marcapasos pero que también forman parte del complejo de Pre- Bötzinger, son neuronas “seguidoras” que transmiten el impulso rítmico a las neuronas motoras y premotoras. 1.Un canal de K+ activado por Ca2+ cuya conductancia es un función creciente de c = [Ca2+] de la forma c g K ,Ca g K ,Ca Kd c + 2.Un canal de K voltaje dependiente modelado en la misma forma que el de HH con g K g K n4 donde n obedece la misma ecuación diferencial que el modelo de H-H excepto que el voltaje está desplazado una cantidad V* 3.Un canal de Ca2+ voltaje dependiente de conductancia gCa gCa m3h donde otra vez m y h satisfacen ecuaciones diferenciales tipo H-H pero con el voltaje desplazado en V´ y la corriente de Na+ es reemplazada por la corriente de Ca2+. Combinando esta corriente iónicas con las corrientes usuales de pérdidas obtenemos Cm En nuestro trabajo intentamos reproducir en forma cualitativa algunos de los resultados obtenidos por los autores del paper antes mencionado. Nos centraremos en el modelado de la sincronización de las neuronas marcapasos y de una marcapasos con una seguidora. Modelado Partimos del modelo matemático propuesto por Chay y Keizer (1983) [5]. Las corrientes iónicas de éste modelo son: Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel dV g K ,Ca g K V VK 2 g Ca V vCa g L V VL dt donde Cm es la capacitancia de la membrana. Por último, para completar el modelo se agrega la ecuación que regula el Ca2+ intracelular dc f k1 I Ca k c c dt donde la corriente de Ca2+ está dada por ICa gCa m3h(V VCa ) 2 con k1 y k2 constantes. En nuestro trabajo modelamos cada una de las neuronas capaces de realizar bursting haciendo una simplificación al modelo antes mencionado, ignorando las dinámicas de m y h, por lo tanto utilizamos las siguientes ecuaciones diferenciales no lineales: dn n (V ) n (V ) n dt Cm g c dV I Ca (V ) g K n 4 K ,Ca V Vk g L V VL dt Kd c Figura 1. Potencial de acción en función del tiempo de una neurona realizando bursting. dc f (k1 I Ca (V ) kc c) dt donde la corriente de Ca2+ es I Ca gCa m (V )3 h (V )(V VCa ) Las variables de nuestro modelo son entonces, el potencial de membrana V, la concentración de calcio intracelular c y la proporción de canales abiertos n. De esta forma el sistema queda separado en un subsistema rápido (ecuaciones de V y n) y una ecuación lenta para c. Figura 2. Concentración de calcio intracelular de una neurona que realiza bursting. Comparando con la figura 1 es posible ver que el momento del bursting coincide con el aumento de la concentración de Ca2+ intracelular, mientras que el período de reposo coincide con la disminución de [Ca2+]. Una vez que introducimos este modelo en el Matlab (Apéndice A) realizamos las simulaciones para distintos parámetros y condiciones iniciales. En la figura 1 mostramos las oscilaciones de bursting para una única neurona marcapasos y en la figura 2 sus respectivas variaciones de concentraciones de calcio en función el tiempo. En estas figuras se puede observar que el período en que el potencial hace bursting coincide con el aumento de la concentración de Ca2+ intracelular, mientras que el período de reposo coincide con la disminución de c. Por otro lado, al mirar las figuras 1 y 2 se aprecia claramente la separación de escalas temporales ya que V varía muy rápidamente en comparación a c. Luego de comprender el funcionamiento de una neurona, procedimos a acoplarla, por medio de una sinapsis eléctrica, con otra neurona marcapasos idéntica. Para ello modificamos las ecuaciones agregando un término de corriente Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel 3 proporcional a la diferencia de potencial. Éste término está dado por I acopl K (V2 V1 ) donde V1 y V2 son los potenciales de membrana de las neuronas conectadas y K es la conductividad. En la figura 3 se muestra el comportamiento de dos neuronas desacopladas con condiciones iniciales distintas. Allí se observa que cada neurona tiene la misma frecuencia pero no se encuentran sincronizadas. Luego de conectarlas el comportamiento es cualitativamente diferente (figura 4): podemos observar que rápidamente las neuronas se sincronizan, teniendo ambas la misma frecuencia y fase. Lo mismo sucede con las concentraciones del calcio (figuras 5 y 6) Figura 4. Potenciales de acción en función del tiempo para dos neuronas idénticas acopladas mediante una sinapsis eléctrica de conductividad K=0.01 mS. Figura 5. Concentraciones de calcio de dos neuronas idénticas no acopladas con condiciones iniciales distintas. Figura 3. Potenciales de acción de dos neuronas idénticas desacopladas realizando bursting, con condiciones iniciales diferentes. Figura 6. Concentraciones de calcio de dos neuronas que se encuentran acopladas. Si bien sus condiciones iniciales son diferentes, a partir de los 15 s aproximadamente los comportamientos son semejantes. El segundo objetivo de nuestro trabajo es analizar el comportamiento de las neuronas “seguidoras”. Para ello probamos dos modelos diferentes: el Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel 4 primero consiste en acoplar el modelo de una neurona marcapasos, capaz de realizar bursting, con un típico modelo de H-H (Apéndice B) para la neurona seguidora. En cambio en el segundo caso (Apéndice C), el modelo que utilizamos para la neurona seguidora fue igual que para la primera neurona pero con diferente capacidad de membrana. En la figura 7.a y 7.b presentamos las simulaciones para el acoplamiento del primer caso. En estas puede observarse que dependiendo del valor de la conductividad K , el comportamiento de la neurona seguidora cambia: en (a) el potencial permanece en reposo, mientras que en (b) dispara en forma continua. En ambos casos no se observa sincronización entre las neuronas. Esto no se corresponde con lo observado en el experimento del paper, por lo tanto descartamos este modelo. Fig 7b. Primer intento de modelado del acople marcapasos-seguidora. Potenciales de acción de la neurona marcapasos (en azul) y de la neurona seguidora modelada con H-H (en verde). En este caso el valor de la conductividad es K=0.04. Se observa que la neurona seguidora dispara continuamente aunque la neurona marcapasos no haya disparado aún (compárese la escala de tiempo con la figura 7a). En el segundo caso, el modelo que propusimos reflejó las características principales del comportamiento biológico de ambas neuronas. En la figura 8.a se observan los potenciales de la neurona marcapasos haciendo bursting y de la neurona seguidora desacoplada, la cual es incapaz de disparar potenciales de acción por sí misma. En cambio en las figuras 8.b y 8.c se muestran ambas neuronas acopladas con dos constantes de acoplamiento diferentes. En ambos casos la neurona “seguidora” se sincroniza con la marcapasos. Fig 7a. Primer intento de modelado del acople marcapasos-seguidora. En azul se observa una neurona realizando bursting (marcapasos) y en verde una neurona modelada con H-H (seguidora). Las neuronas están acopladas por una conductividad K=0.03. No se observa respuesta de la seguidora al estímulo de la neurona marcapasos. Fig 8a. Potenciales de acción de dos neuronas desacopladas: en azul la marcapasos y en verde la seguidora. Ambas se modelaron con las mismas ecuaciones diferenciales pero parámetros diferentes. Para la primera se utilizó una capacidad de membrana de Cm=1F y para la segunda Cm=0.5F. Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel 5 sí lo hace. El acople de este modelo con el de una neurona capaz de realizar bursting simula una estimulación tetánica, dependiendo de los valores que toma K en Iacopl. Al acoplar por medio de una sinapsis eléctrica dos neuronas idénticas, ambas realizando bursting, se observó que luego de un transitorio, éstas se sincronizan. Fig 8b. Potenciales de acción en función del tiempo para una neurona marcapasos acoplada con una neurona seguidora. Ambas modeladas con las mismas ecuaciones diferenciales y capacidades Cm=1F y Cm=0.5F. La constante de acoplamiento usada es K=0.01 mS. Fig 8c. Idem figura 8b pero con constante de acoplamiento K=0.005 mS. Conclusiones El modelo presentado nos permitió estudiar el comportamiento de las interacciones sinápticas de neuronas en una red neuronal. La simulación del acople sináptico de una neurona capaz de hacer bursting con una neurona típica según el modelo Hodgkin y Huxley no fue capaz de mostrar sincronicidad entre ambas neuronas. Más aún, no se observó que la segunda neurona fuese capaz de reproducir bursting. Según este modelo, no cualquier neurona es capaz de generar bursting, a pesar de estar acoplada a una neurona que Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel En cambio, al acoplar dos neuronas capaces de realizar bursting pero una de ellas con parámetros tales que no presente oscilaciones espontáneas, se observa que ésta última sigue el estímulo de la neurona que sí posee una frecuencia propia (marcapasos). Entonces logramos reproducir el resultado del paper que muestra que ciertas neuronas se apagan luego de aplicar una droga que inhibe las condiciones sinápticas: al aplicar la droga, la comunicación entre la neurona marcapasos y la seguidora se pierde; observando que ésta última deja de disparar su potencial de acción. Referencias [1] Keener J., Sneyd J. (2001). Mathematical Physiology pp 190. Springer-Verlag. [2] J. Rinzel,Y.S. Lee. (1987). Dissection of a model for neural parabolic bursting pp 653-675. [3] Fisiología – R. Berne, M Levy, 1992. Mosby-Year Book de España, S.A. [4] Koshiya Naohiro, Smith Jeffery. (1999) Nature 400 pp 360-363. [5] Keener J., Sneyd J. (2001). Mathematical Physiology pp 117-135. Springer-Verlag. 6 Apéndice A: Bursting de una neurona function y = f(t,x) f = 0.007; k1=0.0275; kc=0.00545; kd=1; gkca=0.02*(x(1)/(kd+x(1))); gl=0.012; gk=3*x(3)^4; Vk=-75; Vl=-40; Vca=100; Veq= 0; Vp=50; Ves=30; Cm=.5; am=0.1*(25-(x(2)-Veq+Vp))/(exp((25-(x(2)-Veq+Vp))/10)-1); bm=4*exp(-(x(2)-Veq+Vp)/18); ah=0.07*exp(-(x(2)-Veq+Vp)/20); bh=1/(exp((30-(x(2)-Veq+Vp))/10)+1); an=0.01*(10-(x(2)-Veq+Ves))/(exp((10-(x(2)-Veq + Ves))/10)-1); bn=0.125*exp(-(x(2)-Veq+Ves)/80); minf=am/(am+bm); hinf=ah/(ah+bh); gca=3.2*minf^3*hinf; Ica=gca*(x(2)-Vca); %--------------------------------------------------------y(1)= f*(-k1*Ica-kc*x(1)); % Concentración de calcio y(2)= -(1/Cm)*((gkca + gk)*(x(2)-Vk)+gca*(x(2)-Vca)+gl*(x(2)-Vl)) ;% Potencial de membrana y(3)= an*(1-x(3))-bn*x(3) ;% Canales n y=y'; Apéndice B: Acople Bursting – HH function y = f(t,x) f = 0.007; k1=0.0275; kc=0.02; kd=1; gkca=0.02*(x(1)/(kd+x(1))); gl=0.012; gk=3*x(3)^4; Vk=-75; Vl=-40; Vca=100; Veq= 0; Vp=50; Ves=30; Cm=.5; am=0.1*(25-(x(2)-Veq+Vp))/(exp((25-(x(2)-Veq+Vp))/10)-1); bm=4*exp(-(x(2)-Veq+Vp)/18); ah=0.07*exp(-(x(2)-Veq+Vp)/20); bh=1/(exp((30-(x(2)-Veq+Vp))/10)+1); an=0.01*(10-(x(2)-Veq+Ves))/(exp((10-(x(2)-Veq + Ves))/10)-1); bn=0.125*exp(-(x(2)-Veq+Ves)/80); minf=am/(am+bm); hinf=ah/(ah+bh); gca=3.2*minf^3*hinf; Ica=gca*(x(2)-Vca); gNa=120; gK=36; Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel 7 gL=0.36; VNa=115; VK=-12; VL=10.6; An=0.01*((10-x(4))/(exp((10-x(4))*0.1)-1)); Bn=0.125*exp(-x(4)/80); Am=0.1*((25-x(4))/(exp((25-x(4))*0.1)-1)); Bm=4*exp(-x(4)/18); Ah=0.07*exp(-x(4)/20); Bh=1/(1+exp((30-x(4))*0.1)); K=0.35; %--------------------------------------------------------y(1)= f*(-k1*Ica-kc*x(1)); % Concentración de calcio y(2)= -(1/Cm)*((gkca + gk)*(x(2)-Vk)+gca*(x(2)-Vca)+gl*(x(2)-Vl)) y(3)= an*(1-x(3))-bn*x(3) ;% Canales n ;% Potencial de membrana y(4)=-( gNa*x(6).*x(6).*x(6).*x(7).*(x(4)-VNa)+ gK*x(5).*x(5).*x(5).*x(5).*(x(4)-VK)+gL*(x(4)VL)+K*((x(4)-53.613)-x(1)))/Cm; %Potencial postsinaptico% y(5)=An*(1-x(5))-Bn*x(5); %Subunidad n% y(6)=Am*(1-x(6))-Bm*x(6); %Subunidad m% y(7)=Ah*(1-x(7))-Bh*x(7); %Subunidad h% y=y'; Apéndice C: Acople Bursting – Bursting function y = f(t,x) f = 0.007; k1=0.0275; kc=0.02; kd=1; gkca=0.02*(x(1)/(kd+x(1))); gl=0.012; gk=3*x(3)^4; Vk=-75; Vl=-40; Vca=100; Veq= 0; Vp=50; Ves=30; Cm=.5; am=0.1*(25-(x(2)-Veq+Vp))/(exp((25-(x(2)-Veq+Vp))/10)-1); bm=4*exp(-(x(2)-Veq+Vp)/18); ah=0.07*exp(-(x(2)-Veq+Vp)/20); bh=1/(exp((30-(x(2)-Veq+Vp))/10)+1); an=0.01*(10-(x(2)-Veq+Ves))/(exp((10-(x(2)-Veq + Ves))/10)-1); bn=0.125*exp(-(x(2)-Veq+Ves)/80); minf=am/(am+bm); hinf=ah/(ah+bh); gca=3.2*minf^3*hinf; Ica=gca*(x(2)-Vca); Cm2=1; gkca2=0.02*(x(4)/(kd+x(4))); gk2=3*x(6)^4; Am=0.1*(25-(x(5)-Veq+Vp))/(exp((25-(x(5)-Veq+Vp))/10)-1); Bm=4*exp(-(x(5)-Veq+Vp)/18); Ah=0.07*exp(-(x(5)-Veq+Vp)/20); Bh=1/(exp((30-(x(5)-Veq+Vp))/10)+1); An=0.01*(10-(x(5)-Veq+Ves))/(exp((10-(x(5)-Veq + Ves))/10)-1); Bn=0.125*exp(-(x(5)-Veq+Ves)/80); Minf=Am/(Am+Bm); Hinf=Ah/(Ah+Bh); gca2=3.2*Minf^3*Hinf; Ica2=gca2*(x(5)-Vca); K=0.01; Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel 8 %--------------------------------------------------------y(1)= f*(-k1*Ica-kc*x(1)); % Concentración de calcio y(2)= -(1/Cm)*((gkca + gk)*(x(2)-Vk)+gca*(x(2)-Vca)+gl*(x(2)-Vl)) y(3)= an*(1-x(3))-bn*x(3) ;% Canales n ;% Potencial de membrana y(4)=f*(-k1*Ica2-kc*x(4)); % Concentración de calcio post y(5)=-(1/Cm2)*((gkca2 + gk2)*(x(5)-Vk)+gca2*(x(5)-Vca)+gl*(x(5)-Vl)+K*(x(5)-x(2))) de membrana post y(6)=An*(1-x(6))-Bn*x(6); % Canales n post ;% Potencial y=y'; Marcapasos neuronales - Biofísica - FCEyN-UBA – 2005 Herrera, María; Elías Costa, Martín y Cancela, Ezequiel 9