LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR PRÁCTICA 4. CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS OBJETIVOS. 1. Distinguir entre aminoácidos no polares, polares sin carga y polares con carga en base a sus propiedades de solubilidad. 2. Describir el proceso de cromatografía y cómo éste puede ser utilizado para separar diferentes tipos de moléculas. INTRODUCCIÓN. Los aminoácidos pueden ser clasificados como moléculas no polares, polares sin carga y polares con carga (ácidos o básicos) en base a la estructura de sus grupos R. Dependiendo de la naturaleza de estos grupos R los diferentes aminoácidos serán más o menos solubles en diferentes tipos de solventes. Por ejemplo, los aminoácidos no polares serán más solubles en solventes no polares tales como cloroformo, mientras que los aminoácidos polares serán más solubles en solventes polares tales como el agua. Estas diferencias en solubilidad permiten que mezclas de aminoácidos puedan ser separadas por cromatografía. La cromatografía, un método para separar e identificar moléculas biológicas, hace uso de la tendencia de las moléculas a mostrar atracción selectiva a varias sustancias, dependiendo de su polaridad. Puesto que las moléculas muestran diferencias características de atracción, estas diferencias pueden ser usadas para identificar moléculas desconocidas y para separar e identificar mezclas de moléculas en solución. Hay muchas técnicas cromatográficas, pero la mayoría utilizan el mismo método básico. La mezcla a ser examinada es aplicada a una matriz sólida estacionaria (llamada “fase estacionaria”) la cual absorbe selectivamente la mezcla molecular. Ésta es luego expuesta a una sustancia móvil (la “fase móvil”). La matriz pueden ser finos granos empacados en una columna vertical (columna de cromatografía) o extendidos en una capa delgada sobre una laminilla de vidrio (cromatografía en capa fina). El papel filtro de alta calidad también puede ser utilizado como matriz sólida (cromatografía en papel). La fase móvil puede ser un líquido (o una combinación de diferentes líquidos) o un gas. Como la fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria, las diferentes moléculas dentro de la mezcla son separadas o “particionadas” de acuerdo a sus atracciones relativas por cada una de la dos fases. La tendencia de los diferentes tipos de moléculas en la mezcla para unirse a la fase estacionaria o a disolverse en la fase móvil será determinada como la distancia que son transportadas por la fase móvil. En una columna, cambios en el pH o el tipo de solvente (polar vs. no polar) ocasiona que las diferentes moléculas se muevan a diferente velocidad hasta salir de la columna, donde pueden ser colectadas en tubos. En la cromatografía en papel o en la de capa fina, después de que la fase móvil se ha movido a través de la fase estacionaria, cada tipo de molécula separada aparece como una mancha distintiva sobre la fase estacionaria (la laminilla o el papel). La fase estacionaria sobre la cual las moléculas se han particionado se denomina cromatograma. La cromatografía en papel puede ser llevada a cabo de manera ascendente o descendente. En la cromatografía ascendente un extremo de la matriz de papel es colocado en el fondo de una cámara que contiene un solvente. Conforme el solvente se mueve hacia arriba en el papel su progreso puede ser notado observando el “frente del solvente”. En la cromatografía descendente el solvente está contenido en un reservorio en la parte superior de la cámara. Es posible identificar compuestos separados utilizando el radio de la distancia recorrida por un compuesto en un solvente particular con respecto a la distancia recorrida por el solvente. Este radio es conocido como el valor Rf del compuesto. Rf = (distancia de la mancha desde el origen)/(distancia del solvente desde el origen) Para el análisis preciso, es mejor correr una cromatografía de los compuestos desconocidos junto con compuestos conocidos y luego comparar las distancias recorridas. La localización de sustancias en los cromatogramas puede ser realizada de varias maneras: usando fluorescencia u otros colorantes (usualmente aplicados al cromatograma en forma de spray) o por autorradiografía (visualización de manchas que contengan radioactividad). MATERIALES. Por equipo: - 2 vasos de precipitado de 500 mL - 2 vidrios de reloj - Lápiz (indispensable) - 2 pipetas Pasteur - 2 rectángulos de papel filtro de 12 x 20 cm - 4 clips de plástico - 2 toallas de papel - 1 regla Por grupo: - 200 mL de solvente para cromatografía que se prepara con alcohol n-butílico, ácido acético glacial y agua destilada en proporciones de 6:1:2. - Solución de ninhidrina. PROCEDIMIENTO. 1. Coloque una toalla limpia de papel sobre la mesa limpia. Corte un pedazo de filtro Wathman en un rectángulo de 12 x 20 cm y colóquelo sobre la toalla de papel (esto ayuda a mantener el filtro limpio). 2. Oriente el papel filtro sobre la mesa de manera que el lado de 20 cm quede de frente a Usted. 3. Usando un lápiz y una regla, dibuje una línea delgada a 1.5 cm del borde inferior del filtro y que lo cruce a lo ancho. Comenzando a 3.3 cm del extremo izquierdo de la línea, marque cinco pequeñas cruces cada 3.3 cm. 4. Su instructor le proporcionará una muestra desconocida que contiene una mezcla de tres aminoácidos. Usted recibirá también tres aminoácidos conocidos. Registre los nombres de las muestras conocidas. 5. Usando una pipeta Pasteur aplique una pequeña gota de la solución desconocida (2 mm de diámetro) en el papel filtro sobre la línea en una de las marcas localizadas al centro del papel. Permita que la gota seque (puede utilizar una secadora de pelo). Repita este procedimiento en la misma marca dos veces adicionales. Por separado, dibuje en una hoja de papel el cromatograma para marcar el sitio de colocación de cada muestra. 6. Sobre tres de las otras marcas, aplique gotas de los aminoácidos conocidos (un aminoácido por marca). Aplique cada aminoácido tres veces, permitiendo que las gotas se sequen entre cada aplicación. Sobre el dibujo del cromatograma asegúrese de indicar cuál aminoácido se colocó en cada marca. 7. En la última marca aplique una gota de agua destilada y repita el procedimiento 3 veces. 8. Enrolle el papel de cromatografía formando un cilindro y manténgalo junto en las partes superior e inferior con clips de plástico. 9. Cubra la parte inferior de un vaso de precipitado con solvente para cromatografía (1 cm de profundidad). 10. Coloque el cilindro de papel de cromatografía dentro del frasco, tápelo con el vidrio de reloj y permita que corra por al menos 2 horas, preferiblemente 3 ó 4. Al término de este tiempo se removerán los cromatogramas y se marcará el frente del solvente. Los cromatogramas serán luego dejados secar al aire. 11. Día siguiente: Asperje su cromatograma con ninhidrina o, alternativamente, sumerja el cromatograma en una solución de ninhidrina. Precaución: Use guantes; si usted asperja la ninhidrina, hágalo dentro de una campana. Caliente el cromatograma de acuerdo a las indicaciones de su instructor. Los aminoácidos se volverán púrpura en presencia de ninhidrina (excepto si uno de ellos es prolina). 12. Encierre en un círculo las manchas y registre los colores en la Tabla 1. Determine los valores de Rf para cada mancha de la mezcla desconocida en su cromatograma, luego determine los valores de Rf para cada mancha de aminoácidos conocidos. Para encontrar los valores de Rf estime el centro de cada mancha de aminoácidos, mida la distancia que ha viajado desde el origen (marca) y luego mida la distancia que el frente del solvente ha viajado desde el origen. Encuentre el radio de esta distancia y registre la información en la Tabla 1. Muestra desconocida Mancha 1 Mancha 2 Mancha 3 Color Rf Muestras conocidas Color Rf Aminoácido 1 Aminoácido 2 Aminoácido 3 NOTA: Al manipular el papel filtro a lo largo de la práctica tenga la precaución de utilizar guantes para evitar contaminaciones de la fase estacionaria. ACTIVIDADES. 1. Compare los valores de Rf para las soluciones desconocidas y conocidas. Identifique y registre los aminoácidos en su mezcla. 2. Cada mancha de la solución desconocida debe coincidir con una de las manchas de los aminoácidos conocidos. ¿Obtuvo este resultado? De no ser así, ¿cómo explica la discrepancia?