La conversión microbiológica de carbohidratos ... productos de interés industrial es tema de constante actualidad debido... Año 2006

Año 2006
SEMINARIO I
ESTEQUIOMETRIA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
La conversión microbiológica de carbohidratos para obtener biomasa y
productos de interés industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente
dependencia de los recursos renovables.
Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia
significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la
formulación de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de
operación de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede
transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos
juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante
de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de
sumo interés poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den
cuenta de las transformaciones que se están llevando a cabo en un biorreactor. Los
balances de materia y energía resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha
extendido ampliamente en ciencias básicas y aplicadas.
La aparición en el mercado de sensores que permiten medir importantes
variables de los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los
biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se cultivan los microorganismos)
han ampliado el horizonte para la aplicación de balances de materia y energía. la
producción de biomasa (biomasa = concentración de microorganismos expresada
en gramos de células secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de C y
energía, de nitrógeno y Oxígeno y las producción de CO 2 y desprendimiento de calor
son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas
experimentales y utilizadas en el planteo y cálculo de balances de materia y energía.
Antes de proceder a considerar el sistema de análisis propuesto, es
conveniente introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones sobre
algunas “regularidades” observadas experimentalmente en el cultivo de
microorganismos.
En primer lugar se ha encontrado que la composición elemental de un
importante número de microorganismos, cultivados bajo diferentes condiciones, se
mantiene prácticamente constante; así podemos definir un “microorganismo
promedio” (composición standard) como aquel cuya composición es (% p/p): C =
46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, donde el aproximadamente 5 % restante está
representado por sales. Es importante recalcar que si bien la composición elemental
promedio de la biomasa se mantiene prácticamente constante, la concentración
intracelular de proteínas, RNA y demás constituyentes celulares puede variar
sensiblemente entre diferentes especies e incluso entre diferentes estadíos del
cultivo de un mismo microorganismo.
Teniendo en cuenta esta composición media, podemos escribir lo que sería la
“fórmula mínima” de nuestro m.o. promedio como C H 1,79O0,5N0,2 (en la que está
representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente prácticos definir “1 Cmol de biomasa” como la cantidad de biomasa que contiene 1 átomo gramo de C.
Así pues tenemos que:
1 C - molde biomasa =
12  1,79  16x 0,5  14x 0,2
= 25,8g
0,95
1
Si llamamos “x” a la fracción de C en la biomasa y tenemos en cuenta que
para nuestro m.o. promedio x = 0,465, obtendríamos el mismo valor anterior
haciendo el siguiente cálculo: 12/0,465 = 25,8. Estrictamente hablando, para
conocer la cantidad de biomasa que corresponde a n C-moles de biomasa debemos
conocer su composición elemental y en términos generales el factor de conversión
12
resulta ser: n.
g de biomasa.
x
De forma análoga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 1 Cmol de sustrato (entiéndase por sustrato fuente de carbono y energía, FCE), 1 C-mol
de fuente de N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C 6H12O6, 1 C-mol de glucosa
estará representado por CH2O y pesará 30 g, y para el etanol, 1 C-mol de etanol
(CH3O0,5) pesará 23 g.
Otro concepto que debemos introducir es el de “grado de reducción” o “grado
de reductancia”, el cual será de gran utilidad en el momento de plantear nuestros
balances de materia y energía.
Tomemos como ejemplo las siguientes reacciones de oxidación:
C + O2. CO2
CH4 + 2O2  CO2 + 2H2O
CO + 0,5 O2  CO2
CH2O + O2  CO2 + H2O
CH3O0,5 + 1,5 O2 CO2 + 1,5 H2O
=4
=8
=2
=4
=6
`
Podemos observar que los distintos valores de  que figuran a la derecha de
cada ecuación coinciden con el número de “electrones disponibles” que fueron
transferidos desde el compuesto a oxidar al oxígeno. En general  se expresa en
términos de n de e- disponibles / c-mol.
Para calcular el valor de  de un determinado compuesto se toman los grados
de reducción 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N. En el caso del
CO2, H2O y NH3 no se tienen e- disponibles (estados de referencia), luego CO2 =
H2O = NH3 = 0. Se considera además que el estado de oxidación predominante del
N en la biomasa es -3. En términos generales para un compuesto de fórmula
CHaObNc, su grado de reducción vendrá dado por:
 = 4 + a - 2b - 3c
(1)
Si tenemos un compuesto cuya fórmula es Ch Hi Oj Nk, debemos llevarlo a la forma
CH i O j N k
h
h
h
Si tomamos como ejemplo a nuestro m.o. promedio su x (donde el subíndice
x indica biomasa) será:
e - disp.
 x = 4,19
C - mol
Este valor, junto a su correspondiente x = 0,4, son dos de las “regularidades”
a las que nos habíamos referido con anterioridad. Estos valores pueden ser
2
empleados en balances de materia y energía en aquellos casos en que se
desconoce la composición de la biomasa sin temor de incurrir en errores groseros
de cálculo. Otras regularidades observadas en el cultivo de m.o. es que el calor de
reacción por mol de e- transferidos al O2 es relativamente constante para la
oxidación de una amplia variedad de moléculas orgánicas y corresponde a 27
Kcal/mol e- disponibles transferidos al O2.
Estamos ahora en condiciones de plantear una serie de balances de materia
y energía, para lo cual trataremos al cultivo de un m.o. como si fuera una reacción
química simple.
r = velocidad de
1C  mol S + a mol fte de N + b O2 reaccion
 yx X  y p prod + CO2 + w H2 O + q (calor )
Donde X significa “biomasa”, cuaquiera sea su naturaleza.
Debemos hacer notar que los coeficientes estequiométricos están referidos a
1 C-mol de fuente de C y energía. Así pues:
yx


C - mol de X
 C - mol de fte. de C y E  lo mismo para yp e yCO2.


Generalizando:
CHS 2OS 2 + a NH3 + bO2  y X CHX 1OX 2 N X 3 + y p CHP1OP2 N P3 + yCO2 CO2 + wH2 O + q
(1’
)
El balance de carbono para esta reacción de formación de biomasa y producto será:
yx + yp + yCO2  1
(2)
De igual forma podemos establecer un balance del grado de reducción:
s + (-4)b = yx . x + yp . p
(3)
Reordenando y dividiendo por s obtenemos
4b
s

yx .  x
s

yp .  p
s
1
(4)
o lo que es lo mismo
++=1
donde  =
(5)
4b
(fracción de e- disponibles del sustrato transferidos al O2)
s
y .
 = x x (fración de e- disp. del s transferidos a la biomasa)
s
y p . p
=
(fracción de e- disp. del s transferidos al producto)
s
3
Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservación de la
masa y la energía, en el primero de ellos, no puede haber entre los productos más
carbono del que un c-mol de sustrato puede aportar y el en el caso del segundo, los
electrones disponibles del sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos.
Si asumimos, como ya se mencionó, que el calor de reacción por mol de e disponibles transferidos al oxígeno es constante para un importante n de moléculas
orgánicas, el primer término de la ecuación (4) nos da la fracción de energía del
sustrato que evoluciona como calor. Si llamamos qo a esa constante con qo = 27
Kcal/mol e- disponibles transferidos al O2, el calor generado en la ecuación l’ vendrá
dado por:
q = 4 qo b kcal/C-mol de sustrato
(6)
Si conocemos la velocidad de consumo de O 2 de nuestroo cultivo podemos
calcular la velocidad de producción de calor y por lo tanto los requerimientos de H 2O
de enfriamiento para mantener constante la temperatura de nuestro biorreactor.
El concepto de e- disponibles nos brinda un método simple de cálculo para
chequear los resultados obtenidos experimentalmente en lo que se da en llamar
“análisis de consistencia interna”. Empleando las ecuaciones (2) y (4) o (5) con
datos obtenidos en el laboratorio, podemos estimar parámetros no medidos y tener
idea de cuán confiables fueron nuestras determinaciones. Medidas realizadas en el
laboratorio deben encontrarse dentro de los intervalos:
0,94  yx + yp + yCO2  1,06
0,93   +  +   1,07
Valores inferiores o superiores a estos límites de aceptabilidad determinados
estadísticamente ponen en evidencia errores en las determinaciones
experimentales.
En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificación de la biomasa producida
se efectúa gravimétricamente, es decir, se determina el incremento en biomasa
expresado en g/l (x) correspondiente a la utilización de una determinada cantidad
de sustrato (s) (igualmente expresada en g/l) con lo cual definimos nuestro
x
rendimiento en base a sustrato como Yx  
al que tomamos como “rendimiento
s
global” en el que sólo se tienen en cuenta los valores finales e iniciales de biomasa y
sustrato, más rigurosamente Yx debiera ser expresado por el límite x / s con s 
dx
0, esto es: Yx  
(observar que el signo negativo es introducido porque x y s
ds
varían en sentido contrario).
Estamos ahora en condiciones de calcular los valores de yx, yp, y yCO2
conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de x, s, p y CO2
tal cual vemos a continuación: y x  Yx
 CO
p
x
; y p  YP
; yCO  YCO
S
S
S
2
2
2
(7)
Resulta de gran interés conocer los destinos que toma la fuente de C y
energía durante el crecimiento microbiano y la fracción de la misma empleada por el
4
m.o. para obtener la energía necesaria para llevar adelante sus funciones
metabólicas.
Por balance de sustrato:
s = sx + sp + sE
(8)
S = Sustrato total consumido
Sx = Fracción de sustrato utilizado en la formación de biomasa
Sp = Fracción de sustrato utilizado en la formación de producto
SE = Fracción de sustrato utilizado para obtener energía
donde
Por otro lado, se debe cumplir que: - Sx . s = X . x
Sp . s = P . p
(9)
(10)
por consiguiente:
SE = S - Sx - Sp
SE = S + X ..
fE =
x
P
 P.
s
s
S E
x
p
 1  Yx
 Yp
S
s
s
fE : fracc. de FCE destinada a la obtención
de E.
fE = 1 - yx - yp = yCO2
(11)
Experimentalmente lo que se hace es determinar la producción global de CO2
y conociendo la masa de CO2 y sustrato consumido y calcular SE por
estequiometría. Este método presenta dos inconvenientes: en primer lugar existen
reacciones enzimáticas que incorporan O2 a determinados componentes celulares
(O2 que no es empleado para obtener energía) no obstante este consumo puede ser
despreciado frente al global para oxidar la fte. de C y E; y el más importante es que
debemos suponer que x  s, caso contrario se introduce un grosero error en el
cálculo.
Hasta aquí los balances planteados por el método de e - disponibles
consideran el caso particular de formación de biomasa y producto cuando la fuente
de N es NH3. Ahora bien, qué sucede cuando ésta no es NH3?
Lo que se hace en este caso es modificar los estados de referencia para que
en los balances:  CO2 =  H 2 O = fte.de N = 0 con lo cual estamos estableciendo un
"grado de reducción generalizado".
Tomemos:
Biomasa = C H a1 O b1 N c1
Sustrato = C H a 2 O b2 N c2
Producto = C H a3 O b3 N c3
5
Fuente de N = Cd4 H a4 O b4 N c4
Se definen los i generalizados como:
 C1 
  4d 4  a 4  2 b 4 
 C4 
x = 4 + a1 - 2 b1 - 
 C2 
  4d 4  a 4  2 b 4  "
 C4 
s = 4 + a2 -2 b 2 - 
 C3 
  4d 4  a 4  2 b 4  "
 C4 
p = 4 + a3 - 2 b - 
3
 N 4
 C  d
a4
b
a
b 
 2 4   4 4 4  4  2 4 
d4
d 4  C4   d 4 d 4
d4 
Veamos ahora algunos ejemplos aplicados al análisis de datos
Ejemplo 1:
En un cultivo continuo de Saccharomyces cerevisiae se encontró que por
cada C-mol de biomasa formada se consumieron 4,26 C-moles de glucosa, 0,35
moles de O2 y se formaron 1,92 C-moles de etanol. La fuente de N fue NH3 y la
glucosa; a fuente de C y energía. La composición elemental es CH 1,8O0,56N0,17.
Verifique si el consumo de O2 es correcto.
x = 4,17
yx =
p = 6
1
= 0,235
4,26
s = 4
yp =
(C2H6O)
1,92
= 0,45
4,26
CH2O + c NH3 + b O2  yx biomasa + yp CH3O0,5 + (1-yc-yp)CO2 + w H2O
s - 4b = yx . x + yp . p
b = (s - (yx . x + yp . p) ) ¼ = 0,079
Valor experimental = 0,35
Verificación:
mol de O 2
C - mol de biomasa
mol de O 2
b

 0,34
C - mol de biomasa y x
6
mol de O 2
C - mol de S
Ejemplo 2:
Un microorganismo crece anaeróbicamente en un medio con glucosa como
fuente de C y energía; NH3 como fuente de N y NO3- como aceptor de electrones. El
yx = 0,6 C-mol/C-mol. El NO3- es reducido por el microorganismo a N2. Cuánto NO3será necesario para obtener 3,5 g de biomasa/l?
Al no tener datos sobre la composición elemental de la biomasa supongamos:
O0,5N0, sales 5 %, en consecuencia 1 mol de biomasa pesará 25,8 g y x =
CH1,8
4,19.
 NO3- = -5
CH2O + n NO3- + c NH3 ------- yx biomasa + (1-yx) CO2 + m N2 + w H2O
  y x . x mol de NO 3 
s - 5n = yx . x , luego será n = s

5
C - mol de S

mol de NO 3
n
será pues

 0,49 , por lo tanto se necesitarán:
C - mol de biomasa y x
3,5 g / l


x 0,49 mol de NO 3 / l = 0,066 mol de NO 3 / l
25,8 g / l
7