PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL IN 1. INTRODUCCIÓN

PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
MICROPROPAGACIÓN Y ENRAIZAMIENTO DE EXPLANTOS DE OLIVO CULTIVADOS IN
VITRO
1.
INTRODUCCIÓN
La finalidad de la multiplicación vegetativa es obtener plantas genéticamente idénticas entre sí y con respecto a
la planta materna y que si se cultivan en condiciones iguales darán lugar a un mismo fenotipo básico.
Formación de yemas adventicias
Organogénesis por vía directa
Segmentos nodales
Desarrollo de yemas preexistentes
Yemas axilares
En esta práctica se utilizará un método de multiplicación vegetativa por organogénesis directa, concretamente la
multiplicación mediante segmentos nodales.
2.
OBJETIVO.
Hacer que el alumno practique procedimientos de micropropagación vegetativa y de manipulación de material
vegetal en condiciones de asepsia.
3.
MATERIAL
Explantos de olivo cultivados in vitro
Tubos para cultivo in vitro con medio DKW para multiplicación vegetativa de olivo
Tubos para cultivo in vitro con medio DKW para enraizamiento
Pinzas y bisturíes autoclavados
Azulejo y papeles de filtro estériles
Agua destilada estéril
Etanol del 70%
Recipiente con etanol absoluto para sumergir el material de disección antes de flamearlo
Cámara de flujo laminar
Mechero de alcohol
Cerillas
4.
METODOLOGÍA
Los alumnos extraerán los explantos del tubo de cultivo, los depositarán sobre una superficie estéril y los
cortarán en fragmentos que tengan un mínimo de dos pares de hojas. Al explanto basal se le elimina el callo, en caso de
existir. La mitad de los fragmentos se introducirán en medio de crecimiento y la otra mitad en medio de enraizamiento
4.1. Multiplicación vegetativa de explantos de olivo.
4.2.1. Composición de medio litro de medio de crecimiento para el olivo
50 ml de Solución A del medio DKW
50 ml de Solución B
"
50 ml de Solución C
"
50 ml de Solución D
"
1
1 ml de Solución E del medio DKW
5 ml de Solución F1
"
5 ml de Solución F2
"
50 ml de Solución G
"
50 ml de Solución H
"
Añadir 15 g de sacarosa
Añadir H2O destilada hasta los 450 ml y agitar.
Estos ingredientes serán comunes a los tres tipos de medio de cultivo, que difieren entre sí sólo en el
contenido en hormonas del crecimiento:
Medio de cultivo A:
Le añadiremos:
500 l de solución stock de IBA de 1 g/l (1000X) (para prepararla vamos a pesar 0.01 g y lo vamos a
llevar a 10 ml finales con agua destilada)
1ml de solución stock de BAP (8g/l) (1000X) (para prepararla vamos a pesar 0.04 g y lo vamos a llevar a
10 ml finales con agua destilada)
Medio de cultivo B
500 l de solución stock de IBA de 1 g/l (1000X) (para prepararla vamos a pesar 0.01 g y lo vamos a
llevar a 10 ml finales con agua destilada)
Añadiremos 500 l de una solución stock de zeatina de 2 g/l (1000X) (para prepararla pondremos 0.02 g
de zeatina y lo vamos a llevar a 10 ml finales con agua destilada)
Medio de cultivo C:
500 l de solución stock de IBA de 1 g/l (1000X) (para prepararla vamos a pesar 0.01 g y lo vamos a
llevar a 10 ml finales con agua destilada)
Añadiremos 1ml de una solución stock de 2iP de 4 g/l (1000X) (para prepararla pondremos 0.02 g de 2iP
y lo vamos a llevar a 10 ml finales con agua destilada)
Enrasar a 500 ml.
Ajustar el pH = 5.8
Añadir 3.5 g de agar
Se disuelve el agar en un microondas
Se reparte en tubos de cultivo a razón de 15 ml/tubo, se tapan y se autoclavan 20 minutos a 121 ºC
4.2.2. Condiciones de cultivo
Una vez fragmentado el explanto inicial, los segmentos nodales se introducen en el tubo de cultivo, se flamea su
boca, se tapa y se lleva a la cámara de cultivo con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 de oscuridad y temperatura diurna
de 25 ºC y nocturna de 20 ºC.
4.2. Enraizamiento de explantos de olivo
4.2.1. Composición de medio litro de medio de enraizamiento
25 ml de Solución A del medio DKW
25 ml de Solución B
"
25 ml de Solución C
"
25 ml de Solución D
"
0.5 ml de Solución E
"
25 ml de Solución H
"
2
Añadir H2O destilada sin llegar al litro y agitar.
Añadir 10 g de Sacarosa
Medio de enraizamiento A
Añadir 500 l de solución stock de AIA de 4 g/l (1000X)
Ajustar a pH = 5.8
Enrasar a 1 litro
Añadir 3.5 g de agar.
Medio de enraizamiento B
Añadir 1 ml de solución stock de IBA
Ajustar a pH = 5.8
Enrasar a 1 litro
Añadir 3.5 g de agar.
Medio de enraizamiento C
Añadir 750 l de solución stock de IBA
Ajustar a pH = 5.8
Enrasar a 1 litro
Añadir 1 g de gelrite.
Se disuelve el agar en un microondas
Se reparte en tubos de cultivo a razón de 15 ml/tubo, se tapan y se autoclavan 20 minutos a 121 ºC
4.2.2. Condiciones de cultivo para el enraizamiento
Para el enraizamiento se necesita tomar un explanto que tenga un mínimo de dos entrenudos, es decir, 2 pares
de hojas. Se deben mantener en oscuridad durante 15 días y a 25º C.
5.
BIBLIOGRAFÍA
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