Practicas de Bioquimica y biología molecular:

CINÉTICA ENZIMÁTICA E INHIBICÍON ENZIMÁTICA
Representantes:
Carlos Agúndez López
Daniel González Mancebo
PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Cinética enzimática. Determinación de parámetros cinéticos
Inhibición enzimática.
1) Caracterización enzimática de la fosfatasa alcalina:
El objetivo básico es el estudio de la cinética enzimática de la fosfatasa alcalina. Las
fosfatasas son enzimas que se encargan de catalizar la hidrólisis de esteres del acido
fosfórico.
Las fosfatasas se pueden clasificar en dos grupos, fosfomonoestereasas y las
fosfodiestereasas. La enzima objeto de nuestro estudio pertenece al primer grupo e
hidroliza monoésteres fosfóricos.
En nuestro experimento vamos a utilizar fosfatasa alcalina comercial. Para determinar la
actividad enzimática. Y además usaremos como sustrato el p-nitrofenilfosfato (pNǾP).
Los productos de la reacción van a ser el p-nitrofenol, compuesto de color amarillo a pH
alcalino, y como segundo producto el fosfato.
El color amarillo del p- nitrofenol, nos va a servir para la determinación de la actividad
enzimática debido a que éste se produce en un tiempo dado y es proporcional a la
actividad de la fosfatasa que esta presente en el medio. Por tanto si medimos su
absorción a una longitud de onda de 405 nm en un colorímetro, podemos determinar
esta actividad. Esto lo conseguimos porque podemos convertir los datos de absorción en
unidades de velocidad.
2) Operaciones a realizar en la práctica:
1º) Medimos la linealidad con el tiempo de la actividad fosfatasa:

Para ello preparamos una batería de 10 tubos de ensayos colocados y numerados
en una rejilla. Cinco de ellos los numeramos como 1, 2, 3, 4, C (Control) y los
otros cinco 1’, 2’, 3’, 4’, C’. Esto lo hacemos para realizar el experimento por
duplicado para estar más seguro de los resultados y también para evitar posibles
despistes en la realización de la práctica. Además los tubos C, C’. Los vamos a
usar como un ensayo en de control en el que no va a haber reacción enzimática y
lo vamos a utilizar para normalizar el espectrofotómetro. En esta prueba vamos a
variar el tiempo dejando las demás variables constantes, por eso una vez los
tenemos separados y numerados procedemos de la siguiente manera:

Utilizando una micropipeta adicionamos 100μl de tris-HCl 0,5M a pH = 8,5 a
todos los tubos de ensayos que tenemos colocados en la rejilla.
Adicionamos también con una micro pipeta 500 μl de pNOP 2 mM también a
todos los tubos de ensayos
A continuación añadimos 300 μl de agua destilada a todos los tubos de ensayos
Una vez llegados a este punto tenemos que estar preparados con un cronometro
para controlar el tiempo una vez añadida la enzima de cada tubo de ensayo.
-

Para disparar la reacción añadimos 100 μl de la fosfatasa alcalina a cada tubo de
ensayo. Pero vamos a añadirlo en cada tubo con un intervalo de 2 minutos entre
cada tubo. Al tubo de C y C´ no tenemos que adicionarle la fosfatasa alcalina.
El tiempo que vamos a tener actuando la enzima en cada tubo es diferente, así
que los tiempos para cada uno de ellos son:
1º tubo = 5 minuto
2º tubo = 10 minutos
3º tubo = 15 minutos
4º tubo = 20 minutos

Por lo tanto a los 5 minutos de haber disparado la primera reacción la paramos.
Para ello lo que tenemos que añadirle es 3ml de NaOH 0.2 N con una pipeta.
Como hemos ido disparando las reacciones cada 2 minutos los tiempos para
parar las reacciones en cada tubo son los que siguen a continuación:
1º tubo = 5 minutos
2º tubo = 12 minutos
3º tubo = 17 minutos
4º tubo = 22 minutos
NOTA: esto lo hacemos porque solo tenemos un cronometro. Si tuviéramos más de uno
controlaríamos el tiempo de cada uno por separado.

Una vez hemos terminado con todas las reacciones procedemos a la lectura de la
absorción de luz en un espectrofotómetro de la siguiente forma.
Vamos primero a medir la absorción de luz a 405 nm en el tubo C y C´.
Una vez medidos le damos al botón de tara para tenerlo como referencia para las
siguientes medidas. Luego vamos midiendo uno de tras de otro todos los tubos, los
anotamos y obtenemos la siguiente tabla. Una vez obtenida la tabla representamos
gráficamente los datos obtenidos, poniendo en el eje de ordenadas la absorción a 405
nm y en el eje de abscisas el tiempo
Tiempo
5
10
15
20
A 405 nm
0,13
0,247
0,359
0,49
A´ 405 nm
0,089
0,224
0,328
0,43
2º) Medimos la linealidad con la actividad de enzima
Ahora volvemos a preparar la misma batería de tubos de ensayos y los volvemos a
numerar de la misma manera. Para este experimento vamos a dejar constantes todas las
variables, menos la cantidad de enzima que va ser la variable. Vamos a actuar de la
siguiente manera:
Utilizando una micro pipeta adicionamos 100 μl de tris-HCl 0,5M a pH = 8,5 a
todos los tubos de ensayos que tenemos colocados en la rejilla.
- Adicionamos también con una micro pipeta 500 μl de pNOP 2 mM también a
todos los tubos de ensayos
- A continuación añadimos 300 μl de agua destilada a todos los tubos de ensayos
En este momento tenemos que añadir la enzima para disparar la reacción. Ahora
tenemos que tener en cuenta que la duración de la reacción en cada tubo es el mismo, 20
minutos.
- Añadimos con una micro pipeta 50 μl al tubo nº 1, 100 μl al tubo nº 2, 150 μl al
nº 3 y 200 μl al tubo nº 4 (también a sus respectivos duplicados). Al tubo C no le
añadimos la enzima. El tiempo que pasa entre cada adicción a cada tubo es de 1
minuto
- Pasados los 20 minutos tenemos que parar la reacción. Por tanto añadimos con
la pipeta 3 ml de NaOH 0.2 N en cada tubo con una separación de 1 minuto
entre cada tubo
Una vez hemos terminado con todas las reacciones procedemos a la lectura de la
absorción de luz en un espectrofotómetro de la misma forma que anteriormente. Una
vez obtenida la tabla, representamos gráficamente los datos obtenidos, poniendo en el
eje de ordenadas la absorción a 405 nm y en el eje de abscisas la cantidad de enzima
-
Fosfatasa
alcalina (μl)
50
100
150
200
A 405 nm
0,224
0,423
0,618
0,872
A´405 nm
0,215
0,434
0,621
0,814
3º) Vamos a medir el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad
enzimática y determinaremos la Km (constante de michaelis)
Volvemos a repetir la misma operación con todos los tubos y actuamos de la misma
manera. Teniendo en cuenta que en esta ocasión tenemos que sumarle un tubo más. Por
tanto tendremos 6 tubos numerados, esta vez lo vamos a hacer sin los duplicados para
ahorrarnos un poco de tiempo. En esta ocasión la variable va a ser la concentración del
sustrato, todo lo demás va a ser constante. También variaremos la cantidad de agua pero
el agua no interviene en la reacción, solamente la utilizamos para igualar la cantidad de
cada tubo de ensayo.
- Utilizando una micro pipeta adicionamos 100 μl de tris-HCl 0,5M a pH = 8,5 a
todos los tubos de ensayos que tenemos colocados en la rejilla.
- Añadimos 60 μl, 120 μl, 180 μl, 300 μl, 500 μl y 180 μl respectivamente a cada
tubo de ensayo.
[pNǾP]
0,12
0,24
0,36
0,6
1
A 405 nm
0,285
0,407
0,43
0,483
0,515
A´ 405 nm
0,04
0,071
0,129
0,19
0,273
1 / [pNǾP] mM-1
8,33
4,16
2,77
1,66
1
1 / A 405 nm
3,51
2,46
2,33
2,07
1,94
1 / A´ 405 nm
25
14,08
7,75
5,26
3,66