Contenido del manual - Thermo Fisher Scientific

Equipos GSSP SeCore®
Instrucciones de uso
1
Uso diagnóstico in vitro
Equipos GSSP SeCore®
Instrucciones de uso
Los GSSP (Productos para secuenciación específicos de grupo) SeCore® de Invitrogen han sido diseñados
para resolver combinaciones ambiguas del HLA en heterozigosis, y se usan conjuntamente con los
equipos para secuenciación SeCore® . Los reactivos son para uso exclusivo en la secuenciación
postamplificación. Para conocer las instrucciones acerca de cómo preparar la amplificación del ADN
genómico de locus específico, los usuarios deberán consultar las secciones 1 a 6 de las Instrucciones de
uso del equipo para secuenciación SeCore® .
Cada equipo GSSP SeCore® contiene un vial con cebador para la secuenciación específica de grupo, un
vial con el BigDye® y un vial con tampón de PPT de secuenciación. El amplicón tratado ExoSAP-IT™,
preparado con el equipo para secuenciación SeCore® , sirve de plantilla para las reacciones de los GSSP.
Los datos generados a partir de los GSSP se analizan junto con los datos originales del equipo para
secuenciación SeCore® correspondiente para determinar el resultado de la secuencia.
Contenido del manual:
Sección
Descripción
Página
1.
Componentes del equipo
3
2.
Materiales, reactivos y equipo no suministrado
3
3.
Preparación de la muestra
4
4.
Reacción de secuenciación
5
5.
Precipitación de etanol de productos de reacción de
secuenciación
5
6.
Electroforesis de los productos de reacción de
secuenciación
6
7.
Análisis de datos
7
8.
Limitaciones y precauciones
7
9.
Solución de problemas
8
10.
Licencias y marcas comerciales
2
Uso diagnóstico in vitro
10
1
Componentes del equipo:
Los equipos de GSSP SeCore® de Invitrogen se suministran como locus y/o grupos independientes. Los
productos de clase I se designan por un número “Z” y los equipos de clase II se designan por los
locus/grupos “DR”. Consulte los equipos específicos para identificar los locus/el grupo.
Descripción
Cantidad
Almacenamiento
Cebador para secuenciación
Depende del
equipo
A -20 °C en un congelador que no
forme escarcha
BigDye®
Depende del
equipo
A -20 °C en un congelador que no
forme escarcha
Depende del
equipo
A -20 °C en un congelador que no
forme escarcha
Tampón de PPT de
secuenciación
Nota: la mezcla con el terminador colorante es fotosensible y deberá protegerse de
la luz mientras permanezca almacenado y cuando se esté utilizando.
2
Materiales, reactivos y equipo no incluido:
2.1
Termociclador de 96 pocillos con tapa térmica:
2.1.1 Los equipos para secuenciación SeCore® se han probado en los siguientes
termocicladores:
Tétrada del motor de ADN PTC 225 de MJ Research, Amplificador Genético 9600,
Amplificador Genético 2700 y Amplificador Genético 9700 de Applied Biosystems.
2.2
Secuenciador de ADN automático y accesorios:
2.2.1 Los equipos para secuenciación SeCore® han sido probados con el
secuenciador ABI Prism® 3100 de Applied Biosystems. El uso de otros
secuenciadores de ADN necesita ser validado por cada usuario.
2.2.1.1
Usuarios de ABI 3100: Matriz capilar 3100 de 36 cm para ABI 3100, código
de producto de Applied Biosystems 4315931.
2.3
Juego de dispositivo de retención/bandeja de 96 pocillos MicroAmp®, código de producto de
Applied Biosystems 403081.
2.4
Tubos de reacción de 0,2 ml, tubos de reacción (8 tubos/franja) y tapas (8 tapas/franja)
MicroAmp®, códigos de producto de Applied Biosystems N801-0533, N801-0580 y N8010535.
3
Uso diagnóstico in vitro
2.5
Bandeja óptica de 96 pocillos y tapa de bandeja completa 9600 MicroAmp ®, código de
producto de Applied Biosystems N801-0560 y N801-0550.
2.6
Centrifugador de sobremesa con adaptadores para bandejas de 96 pocillos. El centrifugador
debe alcanzar una fuerza de 2.500 x g.
2.7
Pipetas y puntas de pipetas: 1-10 µl, 10-200 µl, 100-1.000 µl.
2.8
Pipetas electrónicas para dispensación: con capacidad para dispensar alícuotas de 1 a 125 µl.
2.9
Pipetas multicanal (8 o 12 canales):
volumen ajustable de 1 a 100 µl.
2.10 Sistema CoolSafe de ajuste de tubos de 0,2 ml, código de producto de Diversified Biotech
CSAF-1000.
2.11 Reactivos para secuenciador capilar ABI 3100:
2.11.1 Polímero POP-6, código de producto de Applied Biosystems 4316357 . El uso
de los polímeros POP-4 y POP-7 deberá ser validado por cada usuario.
2.11.2 Tampón para análisis genético 10X, código de producto de Applied
Biosystems 402824.
2.11.3 Formamida Hi-Di™, código de producto de Applied Biosystems 4311320.
2.12 Etanol absoluto, código de producto de Sigma Aldrich 270741-1L.
2.13 Software del secuenciador:
2.13.1 Para usar con ABI 3100.
2.14

Software de recogida de datos ABI Prism® v1.1 o superior (Win NT).

Software para análisis de secuencias v3.7 o superior (Win NT).
Software para análisis.
2.14.1 Software uTYPE® SBT de Invitrogen, código de producto 539991 or 539992
(CE).
3
Preparación de la muestra:
3.1
Las amplificaciones de ADN genómico de locus específico purificadas con ExoSAP-IT™ a
partir de los equipos para secuenciación SeCore® pueden utilizarse con este equipo.
Nota: los amplicones tratados con ExoSap-IT™ se pueden almacenar a –20 ºC hasta
una semana.
Nota: Cambie las puntas de las pipetas en cada toma de muestra y mezclas o reactivos
diferentes para evitar la contaminación cruzada. La misma punta de pipeta se puede
utilizar para administrar la misma mezcla o reactivo en varios tubos, siempre que no
4
Uso diagnóstico in vitro
entre en contacto con el ADN genómico o el producto de PCR. Si existe alguna duda al
respecto, cambie la punta para evitar cualquier contaminación.
4
Reacción de secuenciación:
4.1
Preparación de las reacciones de secuenciación:
Nota: las mezclas de reacción de secuenciación se deben conservar tan frías como sea
posible, utilizando el sistema CoolSafe recomendado o hielo.
4.1.1 Para las muestras de clase II, si los amplicones tratados con ExoSap-It™ son
utilizados, ellos han sido diluídos durante la secuenciación inicial, por lo tanto,
no seran necesarias mas diluciones; pero si la muestra no fue diluída al
comienzo, entonces diluya al doble el volumen del amplicón.
4.1.2 Para las reacciones de clase I y clase II, añada al tubo o al pocillo
correspondiente 2 µl de amplicones de PCR tratados con ExoSAP-IT™.
4.1.3 Mezcle el contenido de los viales que contienen el terminador BigDye® y la
mezcla del cebador para secuenciación.
Nota: después de mezclar, el vial con el cebador/ BigDye® deberá almacenarse a -20 ºC
hasta la fecha de caducidad que consta en la etiqueta del equipo.
4.1.4 Añada 8 µl de cada mezcla cebador de secuenciación/ BigDye® al tubo o
pocillo correspondiente.
4.1.5 Cubra los tubos o la bandeja, agite en vórtice brevemente hasta mezclar y
centrifugue los tubos o la bandeja para llevar el líquido al fondo de los pocillos.
4.1.6 Coloque los tubos o la bandeja en el termociclador y ejecute el perfil descrito
en la sección 4.2.
4.2
Perfil de secuenciación para las clases I y II:
Paso
Ciclo
Remojo
Número de ciclos
25
1
Temperatura
Duración
95 °C
20 s
50 °C
15 s
60 °C
60 s
4 °C
Infinita
La duración total de la reacción es ~1,5 horas.
5
Precipitación en etanol de los productos de la reacción de secuenciación:
Después de la secuenciación, se realiza una precipitación de etanol para eliminar los terminadores
sobrantes. Las instrucciones son similares para las reacciones de secuenciación de clase I y clase II.
5.1
Añada 2 µl de tampón de PPT de secuenciación a cada mezcla de reacción de secuenciación.
5
Uso diagnóstico in vitro
5.2
Centrifugue brevemente para asegurarse de que todo el contenido se mezcle y se deposite
en el fondo del pocillo.
5.3
Añada 40 µl de etanol al 100% a cada mezcla.
5.4
Cubra la bandeja y agite bien en vórtice durante unos 60 segundos.
Nota: asegúrese de que el contenido de todos los tubos o pocillos está bien mezclado.
5.5
Centrifugue la bandeja en un centrifugador provisto de un adaptador para bandejas durante
30 minutos a 2.000 g más.
5.6
Retire la tapa, cúbrala con una toallita de papel y déle la vuelta. Centrifúguela por poco
tiempo con la toallita de papel (< 1 min a 500 x g) en la posición invertida para eliminar la
mayor cantidad de líquido posible.
5.7
Añada 100 µl de etanol al 70% a los sedimentos de ADN. NO agite en vórtice la bandeja.
5.8
Centrifugue la bandeja durante 5 minutos a 2.000 g o más.
5.9
Elimine el sobrenadante mediante un giro invertido al igual que en el paso 8.6.
Nota: si se utilizan tubos independientes, centrifúguelos durante 15 minutos para la
precipitación inicial y durante 5 minutos para el lavado a ~12.000 rpm. Elimine el
sobrenadante mediante un breve giro invertido o por aspiración.
Nota: los sedimentos de ADN se pueden almacenar a –20 °C durante un máximo de 7
días.
6
Electroforesis de los productos de la reacción de secuenciación.
6.1
Preparación de las muestras que se van a cargar.
6.1.1 Añada 15 µl de formamida Hi-Di™ (código de producto de Applied Biosystems
4311320) a cada sedimento de ADN.
Nota: si se utilizan tubos individuales hasta este paso, cambie las muestras a una
bandeja óptica de 96 pocillos (código de producto de ABI N801-0560). Utilice la
distribución de muestras propuesta en la sección 7.1.4.2.
6.1.2 Cubra la bandeja y centrifúguela brevemente.
6.1.3 Desnaturalice las muestras a 95 °C durante 2 minutos en un termociclador.
6.1.4 Centrifugue brevemente para eliminar cualquier posible burbuja de aire de las
muestras.
Nota: si las burbujas de aire se introducen en el dispositivo capilar, provocarán
daños en el mismo.
6.1.5 Coloque la bandeja en el inyector automático del secuenciador.
6.2
Condiciones para la electroforesis en un secuenciador capilar ABI Prism® 3100.
6
Uso diagnóstico in vitro
Parámetros
Dye Set
Mobility File
Basecaller
Run Module
Injection Time
Default Run Time
7
Valores
E
KB_3100_POP6_BDTv1.mob
Kb.bcp
RapidSeq36_POP6
10 seconds
1800 seconds
Análisis de los datos:
7.1
Utilice el software para análisis de secuencias para procesar los datos sin procesar
recopilados y crear archivos de secuencias.
7.2
Utilice el software uTYPE® SBT de Invitrogen para procesar los ficheros de secuencias y
crear un informe del HLA.
Nota: se recomienda encarecidamente aplicar la base de alelos más reciente de la base
de datos IMGT/HLA del Instituto Europeo de Bioinformática (www.ebi.ac.uk/imgt/hla)
para efectuar el análisis de los datos de secuencias por medio de uTYPE®.
Los datos generados a partir del equipo de GSSP se analizan conjuntamente con los datos
originales del equipo para secuenciación SeCore® .
8
Limitaciones y precauciones:
8.1
Para garantizar un rendimiento óptimo de los equipos de GSSP SeCore® , utilice los
productos con los materiales, reactivos y equipos recomendados en la sección 2 de este
documento.
8.2
El tipado de HLA con los equipos SeCore® para la secuenciación del HLA se debe realizar en
presencia del director del laboratorio de HLA, un supervisor técnico u otro supervisor general,
siguiendo los estándares oficiales de homologación de laboratorio aceptados (ASHI y EFI).
Volvemos a hacer hincapié en que estos productos están destinados a un uso
exclusivamente profesional.
8.3
Los cebadores para los GSSP pueden detectar sitios polimórficos a partir de alelos a los que
no se accedía. Algunos de los picos detectados a partir de alelos a los que no se accedía
muestran generalmente amplitudes menores al 33% de los picos producidos por los alelos a
los que se tenía acceso.
8.4
La mejor alineación de los datos de secuenciación en la biblioteca se consigue con menos de
300 bases por secuencia.
8.5
Se recomienda que todos los resultados homozigóticos sean verificados por otro método.
7
Uso diagnóstico in vitro
9
Solución de problemas:
Problemas
Causas posibles
Soluciones
Fondo excesivo (ruido de línea
de referencia)
Matriz insuficiente o incorrecta
ABI 3100: Repita la calibración
de espectro y vuelva a
inyectar las muestras.
Inyección escasa (ABI 3100)
Vuelva a inyectar las
muestras.
ABI 3100: Se ha establecido
un tiempo de inyección
demasiado largo.
ABI 3100: Reduzca el tiempo
de inyección y vuelva a
efectuar la inyección. Las
potencias de señal
comprendidas entre 300 y
3.000 son óptimas. (Es posible
que las muestras de poca
calidad presenten una
potencia de señal inferior,
aunque se pueden analizar y
efectuar un tipado de ellas.).
Reacción de secuenciación
insuficiente debido a un error
de pipeta
Asegúrese de que tanto el
producto de PCR tratado con
ExoSAP-IT como la mezcla
de secuenciación
correspondiente se añaden y
se combinan.
Se ha seleccionado un archivo
de movilidad incorrecto; los
picos aparecerán trasladados o
superpuestos.
Seleccione el archivo de
movilidad correcto.
Se ha añadido EtOH 100% en
exceso.
Resecuenciación. Compruebe
que la pipeta tiene el volumen
correcto.
Las reacciones de
secuenciación no se han
agitado en vórtice
correctamente tras la adición
del tampón de PPT de
secuenciación y EtOH.
Repita las reacciones de
secuenciación. Agite en vórtice
(de 50 a 60 segundos) tras la
adición de EtOH. Asegúrese de
que las reacciones están
mezcladas.
Se debe aumentar el tiempo
de inyección.
Repita las reacciones de
secuenciación e incremente el
tiempo de inyección.
Señal débil
8
Uso diagnóstico in vitro
Manchas de coloración
excesivas
El tampón de PPT de
secuenciación no se ha
agregado a las reacciones de
secuenciación antes de la
adición de EtOH.
Repita la reacción de
secuenciación. Añada el
tampón de PPT de
secuenciación antes que el
EtOH.
Fallo al lavar las reacciones de
secuenciación con EtOH 70%.
Repita las reacciones de
secuenciación sin omitir el
paso de lavado con EtOH
70%.
Reacción de secuenciación
insuficiente debido a un error
de pipeta o a un producto de
amplificación poco
consistente.
Asegúrese de que tanto el
producto de PCR tratado con
ExoSAP-IT como la mezcla
de secuenciación
correspondiente se añaden y
se combinan. En caso de
amplificación débil, confirme la
intensidad del producto de
amplificación utilizando gel de
agarosa.
Fallo al eliminar los restos de
EtOH durante la precipitación.
Repita las reacciones de
secuenciación. El paso de
centrifugado de 500 x g es
muy importante a la hora de
eliminar el etanol sobrante de
los tubos de reacción.
El EtOH utilizado en el paso de
lavado estaba demasiado
diluido.
Repita las reacciones de
secuenciación y confirme que
se utiliza EtOH 70% en el paso
de lavado.
Potencia de señal excesiva
ABI 3100: Se ha establecido
un tiempo de inyección
demasiado largo.
ABI 3100: Reduzca el tiempo
de inyección y vuelva a
efectuar la inyección. Las
potencias de señal
comprendidas entre 300 y
3.000 son óptimas. (Es posible
que las muestras de poca
calidad presenten una
potencia de señal inferior,
aunque se pueden analizar y
efectuar un tipado de ellas.).
Fallos aleatorios de secuencia
Reacción de secuenciación
insuficiente debido a un error
de pipeta
Asegúrese de que tanto el
producto de PCR tratado con
ExoSAP-IT como la mezcla
de secuenciación
correspondiente se añaden y
se combinan.
9
Uso diagnóstico in vitro
10
Licencias y marcas comerciales
AVISO AL COMPRADOR; LICENCIA LIMITADA
Toda licencia sujeta a las reivindicaciones sobre procesos de las Patentes estadounidenses:
151.507;5.171.534; 5.332.666; 5.242.796; 5.306.618; 5.366.860; 5.821.058 y/o de sus correspondientes
extranjeras, tiene un componente de tarifa por adelantado y un componente de pago recurrente. El
precio de compra de este equipo incluye derechos limitados no transferibles dentro del componente de
pago recurrente para usar solo esta cantidad del producto para llevar a cabo el proceso de secuenciación
del ADN descrito en las citadas patentes cuando este producto se utilice junto con un instrumento de
Análisis de Secuencia de ADN Autorizado cuya utilización esté cubierta por el componente de tarifa por
adelantado de estas patentes. No se otorga ningún otro derecho de manera expresa, por implicación, o
por preclusión, o bajo ningún otro derecho de patente propiedad de Life Technologies Corporation
(Invitrogen Corporation) o susceptible de ser entregado como licencia por esta empresa.
Para obtener más información sobre la compra de licencias para la realización de la secuenciación de
ADN, pueden ponerse en contacto con el Director de Licencias de Life Technologies Corporation, 5791
Van Allen Way Carlsbad CA 92008 EE. UU.
AVISO AL COMPRADOR; LICENCIA LIMITADA
El precio de compra de este equipo incluye una licencia de derecho limitado, no transferible, no exclusiva
(sin derecho de reventa, reembalaje, o sub-licencia) dentro del proceso de solicitud de una o más de las
Patentes estadounidenses 5.800.996, 5.863.727, y 5.945.526, y las reivindicaciones correspondientes en
patentes y solicitudes de patentes extranjeras homólogas, para utilizar este producto únicamente con una
máquina de secuenciación de ADN automatizada comercial de Life Technologies (Applied Biosystems LLC)
que haya sido autorizada dentro de estas patentes por Life Technologies. Por la presente, no se otorga
ninguna licencia para el uso de este equipo ni de los reactivos contenidos en cualquier otra máquina de
secuenciación automática. Para obtener información relativa a la disponibilidad de licencias adicionales
para la práctica de las metodologías patentadas, pueden ponerse en contacto con: Director de Licencias,
Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way Carlsbad CA 92008 EE. UU.
AVISO AL COMPRADOR: SOBRE LA LICENCIA LIMITADA
Este equipo también se vende de conformidad con una sub-licencia limitada de Amersham International
plc bajo una o más patentes estadounidenses con los números 5.498.523 y 5.614.365; y sus
correspondientes patentes extranjeras y solicitudes de patentes. La compra de este equipo incluye una
sub-licencia limitada no exclusiva (sin derecho de reventa, reembalaje, o sub-licencia) dentro de los
derechos de esas patentes para usar este reactivo para la secuenciación del ADN únicamente con una
máquina comercial automática de Secuenciación de ADN de Life Technologies (Applied Biosystems LLC).
Por la presente, no se otorga ninguna licencia para el uso de este equipo ni de los reactivos contenidos
en cualquier otra máquina de secuenciación automática. No se concede ninguna otra licencia de manera
explícita, implícita o por preclusión. Para obtener información sobre la disponibilidad de licencias
adicionales para la práctica de las metodologías patentadas, pueden ponerse en contacto con: Director
de Licencias de Life Technologies Corporation
Marcas comerciales
SeCore es una marca comercial registrada de Life Technologies Corporation
Invitrogen es una marca comercial de Life Technologies Corporation
ABI PRISM, Applied Biosystems, BigDye son marcas comerciales registradas de Applied Biosystems LLC o
sus filiales en Estados Unidos y otros países.
10
Uso diagnóstico in vitro
FastStart es una marca comercial de Roche Molecular Biochemicals.
ExoSap-IT es una marca comercial de USB Corporation
uTYPE es una marca comercial registrada de Life Technologies Corporation
Las demás marcas comerciales son propiedad exclusiva de sus respectivos propietarios.
PR043S
Revisión 06
Impreso el 6/09
11
Uso diagnóstico in vitro
Representante en Europa:
Invitrogen Ltd.
11 Bassendale Road
Croft Business Park
Bromborough, Wirral
CH62 3QL, U.K.
Tel: 44 151 346 1234
Invitrogen Corporation
9099 North Deerbrook Trail
Brown Deer, Wisconsin 53223, USA
Tel: (800) 955-6288
Fax: (800) 331-2286
www.invitrogen.com
12
Uso diagnóstico in vitro
Para obtener los datos de contacto específicos de cada país, visite nuestro sitio web en
www.invitrogen.com
Invitrogen Corporation
9099 N. Deerbrook Trail
Brown Deer, Wisconsin 53223, USA
Tel. 1-800-955-6288
Fax 1-800-331-2286
Email: [email protected]
13
Uso diagnóstico in vitro