S3-BYQ18 - Centro de Investigaciones en Optica, A.C.

Reparación del miocardio infartado a través del transplante autólogo intracoronario
de células mononucleares CD34+ CD133+ de la médula ósea.
Caracterización de las células mononucleares de la médula ósea.
Fraga Olvera Alira1, Rodríguez Bandala Cindy1, De Zatarain Rivero Rodrigo3, Lobato Tolama Ruben Daniel3
Gómez Conde Eduardo1-2
1
Laboratorio de Biología Celular y Patología Experimental, Facultad de Medicina, Benemérita Universidad
Autónoma de Puebla (FMBUAP), 2 Laboratorio de Biología Celular. Centro de Investigación Biomédica de
Oriente del Instituto Mexicano del Seguro Social (CIBIOR – IMSS),
3
Unidad Médica de Alta Especialidad. Hospital de Especialidades, Centro Médico “Manuel Ávila Camacho”
IMSS-Puebla Puebla. México.
[email protected], [email protected]
Resumen.
El uso de la terapia celular para la regeneración miocárdica está basada en el conocimiento de las
células pluripotenciales y su diferenciación, lo cual es una gran oportunidad para crear nuevas y mejores
estrategias terapéuticas.
Este estudio se divide en dos fases: la primera de carácter biomédico cuyo objetivo es el de caracterizar las
células mononucleares de la médula ósea. (CMMO) Y la fase de aplicación clínica cuyo objetivo será el
analizar si el trasplante de estas células tiene efecto sobre la función ventricular de los pacientes
postinfartados. Se estudió médula ósea obtenida por aspiración de cresta iliaca posterior o esternón, de
pacientes aparentemente sanos del servicio de hematología de la UMAE. Hospital de Especialidades, CMN
“Manuel Ávila Camacho” IMSS-Puebla durante abril a diciembre del 2005. Se realizaron frotis de las células
de la médula ósea, los cuales se tiñeron con técnica de Wright, también se separaron CMMO por gradiente de
densidad, se cultivaron en medio RPMI suplementado con suero fetal bovino al 10% a 37°C durante 5-7días y
se observaron al microscopio invertido con la técnica de Hoffman, se filmaron y capturaron las imágenes.
Además de realizar tinciones de sus ácidos nucléicos con naranja de acridina. Esta el momento hemos logrado
hacer una caracterización parcial de las células de la médula ósea al comparar la morfología de las células en
frotis y de las células en cultivo. Y gracias a la tinción de sus ácidos nucléicos podemos observar la
distribución de éstos en la célula y el aspecto de sus núcleos. Aun nos falta identificar los marcadores de
diferenciación mesenquimatosa sin embargo creemos que este proyecto es una oportunidad para la creación
de estrategias terapéuticas y líneas de investigación encaminadas a la regeneración de órganos y tejidos
lesionados a fin de reducir las complicaciones que dicho daño puedan originar en los individuos.
Introducción.
Una célula madre es aquella capaz de crear los componentes principales de la sangre y otros tejidos. Están
dotadas tanto de la capacidad de autorrenovación como de la de originar células que se convertirán finalmente
en los diferentes tipos celulares especializados. Las células madre pueden extraerse de la médula ósea y ser
manipuladas posteriormente en un laboratorio para que se convirtieran en células específicas para ser
implantadas en el sitio que se requieran sin que exista riesgo de rechazo inmunitario. Las últimas décadas se
han distinguido por un avance importante en el manejo del infarto del miocardio sin embargo éste sigue
siendo la principal causa de muerte a nivel mundial. El uso de la terapia celular para la regeneración
miocárdica está basada en el conocimiento de las células pluripotenciales y su diferenciación, lo cual es una
gran oportunidad para crear nuevas estrategias terapéuticas.
Este estudio está dividido en dos fases; la primera de carácter biomédico cuyo objetivo es el de caracterizar
las células mononucleares de la médula ósea (CMMO). La segunda fase es la aplicación clínica que tiene
como objetivo principal el analizar si el trasplante autólogo intracoronario de células mononucleares CD34+ y
CD133+ de la médula ósea tiene efecto sobre la función ventricular de los pacientes postinfartados, la cual se
llevará a cabo una vez finalizada la fase biomedica.
Objetivo general.
Analizar si el trasplante autólogo intracoronario de células mononucleares CD34+ y CD133+ de
médula ósea tiene efecto sobre la función ventricular de los pacientes infartados.
Objetivos particulares y específicos.
Fase 1. Caracterizar las células de la médula ósea. (CMO)
1. Caracterización morfológica de las células de la médula ósea en frotis
2. Caracterización morfológica de las células de la médula ósea mantenidas en cultivo
3. Caracterización morfológica de las CMMO en frotis y en cultivo.
4. Identificar los marcadores de diferenciación mesenquimatosa (CD34+ CD133+) de las CMO.
5. Identificar los marcadores de diferenciación mesenquimatosa (CD34+ CD133+) de las CMMO.
Fase 2. Analizar si el trasplante autólogo intracoronario de las células mononucleares CD34+ CD133+ de
la médula ósea tiene efecto sobre la función ventricular de los pacientes postinfartados.
1. Seleccionar dos grupos de pacientes postinfartados sometidos a angioplastía primaria con
colocación del Stent. (grupo control y grupo de terapia celular)
2. Describir la función ventricular de los pacientes de ambos grupos luego de la angioplastía
primaria con colocación del Stent. (función ventricular basal)
3. Realizar el trasplante autólogo intracoronario de las células mononucleares CD34+ CD133+ de
la médula ósea a los pacientes del grupo de terapia celular.
4. Describir la función ventricular de los pacientes de ambos grupos luego de 6 y 12 meses de la
evaluación inicial. (función ventricular de efecto)
5. Analizar ambas poblaciones para determinar mediante recursos estadísticos si el trasplante
autólogo intracoronario de células mononucleares CD34+ CD133+ de médula ósea tiene efecto
sobre la función ventricular.
Material y métodos.
Caracterización de las CMO en frotis y en cultivo.
La médula ósea se obtuvo por aspiración de la cresta iliaca posterior o del esternón de pacientes
aparentemente sanos del servicio de hematología de la UMAE. Hospital de especialidades CMN “Manuel
Ávila Camacho” IMSS-Puebla. Durante el abril a diciembre del 2005. Se realizó un frotis de la médula ósea y
se tiñó con Wright de acuerdo a la técnica ya establecida, lo cual nos permitió tener una base de las
características de las diferentes poblaciones celulares
Adhesión de las células de la medula ósea.
Para la adhesión a cubreobjetos se empleó un sistema de cubreobjetos. En este sistema se agregaron 5 ml de
médula ósea heparinizada y 45 ml de solución salina. Luego se incubaron por 2 horas a 37°C y una atmósfera
de CO2 al 5% para que, por gravedad, las células se adhirieran a los cubreobjetos.
Otra técnica para adherir las células fue colocando los cubreobjetos dentro de los pozos de una placas de
cultivo Corning®. Después se agregaron, en pozos diferentes, las células de la médula ósea diluida o las
células mononucleares separadas por gradiente de densidad.
Cultivo de las CMMO.
Las células de médula ósea se cultivaron en botellas de plástico Costar con RPMI 1640 suplementado con
suero fetal bovino al 10% a 37°C y una atmósfera de CO 2 al 5% durante 5-7 días. Una vez adheridas las
células, se lavaron con el mismo medio y se observaron en el microscopio invertido con la técnica de
Hoffman. Se filmaron y capturaron las imágenes con el sistema PCTV Vision.
Tinción de los ácidos nucléicos de las células de la médula ósea.
Las células de la médula ósea adheridas y fijadas se hidrataron al sumergirlas en alcohol en concentraciones
descendentes (R-OH absoluto, al 70% y al 50%) durante 2 minutos en cada uno. Luego se lavaron 2 veces en
agua destilada durante 2 y 5 minutos respectivamente. Después se realizaron dos baños en PBS completo (pH
6) durante 2 minutos. A continuación se introdujeron en una solución de naranja de acridina al 0.1% durante
10 a 15 minutos, se lavaron dos veces más con PBS completo (pH 6) y se montaron en los portaobjetos. Los
bordes de los cubreobjetos se sellaron con barniz.
Caracterización morfológica de las CMMO en frotis y en cultivo.
Para la caracterización de las CMMO es necesario separarlas del resto de las poblaciones celulares de
la médula ósea, para ello inicialmente las separamos por gradiente de densidad, en un futuro mediato se
pretende realizar esta separación mediante inmunomagnetismo, para con ello lograr obtener CMMO CD34+
CD133+ específicamente.
Separación de las células mononucleares de la médula ósea.
La médula ósea se heparinizó con 1000 UI y se diluyó en solución salina al 0.9% a 37°C en una proporción de
4:1. Después se agregó por las paredes a un tubo de cultivo, sobre un colchón de Linfoprep® (Ficoll 1.077)
que luego se centrifugó a 2000 rpm (400g) por 20 minutos, para obtener un anillo en la interfase, el cual
corresponde a las células mononucleares (CMMO), éstas se separaron con una pipeta de plástico estéril, luego
se lavaron dos veces con solución salina al 0.9% a 37°C. A continuación se desechó el sobrenadante y el
botón celular se resuspendió con solución salina a 37°C.
Finalmente las CMMO se sembraron en una botella de cultivo Costar® y se incubaron a 37°C con una
atmósfera de CO2 al 5% durante 5 a 7 días y se capturaron imágenes para su posterior análisis.
Identificación de marcadores de diferenciación mesenquimatosa (CD34+CD133+)
Para la identificación de los marcadores de diferenciación , tanto a las células de médula ósea como a
las CMMO, se les realizarán técnicas de inmunohistoquímica empleando anticuerpos monoclonales anti
CD133 y anti CD34 humanos.
Aplicación clínica.
Ya que se haya cumplido con los objetivos de la primera fase, se pretende realizar un estudio clínico
para analizar si el trasplante autólogo intracoronario de células mononucleares CD34+ CD133+ de médula
ósea tiene efecto sobre la función ventricular el cual se llevará acabo en el departamento de Hemodinámica de
la UMAE, Hospital de especialidades CMN “Manuel Avila Camacho” IMSS Puebla. Se reclutarán pacientes
con diagnóstico de IAM que cumplan los criterios de inclusión y acepten ser parte del estudio al firmar el
consentimiento informado. Se considerará un total de 22 pacientes distribuidos en dos grupos homogéneos
cuyo tamaño muestral será de 11 pacientes para cada uno formados por pacientes de ambos sexos entre 30 a
70 años de edad, con diagnóstico de IAM que recibieron terapia de reperfusión con angiografía primaria y
colocación de Stent dentro de las primeras 72hrs y que no acepten participar en el estudio mediante firma de
consentimient informado.
A los pacientes que constituyan el grupo de terapia celular, se les realizará el mismo día que se programe el
implante, aspirado de médula ósea por medio de punciones repetidas de cresta iliaca posterior, a razón de
1ml/Kg., la cual se colocará en una bolsa colectora (etiquetada con el nombre del paciente) que contenga 5000
UI de heparina sódica para su posterior procesamiento. La suspensión de las células mononucleares CD34+
CD133+ purificadas se trasplantaran a una concentración de ( 1 - 1.5 *106 cels/ml ) por via intracoronaria en
infusión lenta. A todos los pacientes, se les realizará un estricto seguimiento clínico en el día 0 post
angioplastía con colocación de Stent y a los 6 y 12 meses mediante evaluación clínica, laboratorios analíticos
(Química sanguínea, citometría hemática, pruebas de tendencia hemorrágica y función hepática, examen
general de orina, marcadores de daño miocárdico, como CPK total y MB, PCR, DHL, Troponina T
cuantitativa, etc.), EKG de 12 derivaciones y monitoreo electrocardiográfico de 24hrs. Además
ecocardiografía basal y de stress con dobutamina, angiografía ventricular izquierda, resonancia magnética
nuclear cardiaca, ventriculografía por radionúclidos a fin de obtener datos para el análisis estadístico.
Resultados.
Esta el momento hemos logrado hacer una caracterización parcial de las células de la médula ósea al
comparar las células en frotis que fueron teñidas con Wright y las células en cultivo.
De las células de médula ósea que se cultivaron encontramos células mesenquimatosas (Fig. 1) caracterizadas
en cultivo, adheridas y/o extendidas, de formas diversas con lamelipodios. Su núcleo presentó aspecto
granular, y denso a la tinción con naranja de acridina. (Fig. 1a-c). Estas células solo se adhirieron formando
un halo a su alrededor que las aisló de las otras poblaciones celulares (Fig 1d-e). Unas células mostraron un
núcleo central y grande, inmerso en un citoplasma hialino escaso y con filopodios (Fig. 2a-c).
Se observaron células redondas y pequeñas con un núcleo bien delimitado, redondo localizado en la periferia
y con citoplasma escaso (Fig. 2 d-f). También se identificaron células con citoplasma abundante y granular
cuyo núcleo presentó un contorno irregular. (Fig 2 g-h) Algunas células de forma estrellada presentaron
grandes prolongaciones citoplasmáticas o se encontraban en división (Fig 2 i ).
La morfológia celular tanto en frotis como en las cultivadas tiene diferencias poco significativas.
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Fig.
c1 Células mesenquimatosas. decmédula ósea adheridas. (a) tinción
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is2 Células de médula ósea. is(a-c) célula dendrítica teñidas n
iscon wright, con naranja de
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acridina y en cultivo. (d-f) célula linfocitica teñidos con wrigth, con tinción de ácidos nucléicos
i de acridina y en cultivosiL(g-h) células mesenquimatosassise observa nucleo granular e
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irregular. (i) células fibroblastoides en
amitosis (100x).Discusión
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células mesenquimatosas presenten estos marcadores. Sin embargo creemos que este proyecto es el inicio de
una gran oportunidad para la creación de nuevas y mejores estrategias terapéuticas encaminadas a la
regeneración de órganos y tejidos lesionados a fin de reducir las complicaciones que dicho daño puedan
originar en los individuos.
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Bibliografía.
a
a
ca
r
rc
rc
1. Krause DS,é
WM. CD34:Structure,
se
s biology and clinical utility, Blood
sFackler MJ, Civin CI, Stratford
é
ré
r 1-13
1996;87 (1):
lother cells by spontaneous cell fusion.
2. Terada N let al. Bone marrow cellslgadopt the phenotype of e
e
Nature 2002;
i
i
i 416: 542- 545
u
u
u
3. Gordon MY,
Riley GP, Greaves MF. Plastic-adherent progenitor
g
cells in human bone marrow. Exp
g
r
Hematol 1987;
lur 15:772-78
lu
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r
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a
la
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se
se
se
r
a
a
g
g
g
e
r
r
iu
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iu
s
4.
Thomas R, Lipsky P. Dendritic cells: origin and diferenciation Stem cells 1996;14:196-206