MICROSCOPIA CONFOCAL CONSEJOS

MICROSCOPIA CONFOCAL
Más que un protocolo, son unos consejos para sacarle un buen partido a una visita al
confocal:
1. Siempre que pueda usarse las placas de in vivo es preferible su uso a cualquier
tipo de fijación de células, el resultado estructural es mucho mejor,
evidentemente el uso de cualquier fijador por bueno que sea nos hace perder
resolución, así que si no hay que realizar colocalización usar placas in vivo.
2. Recoger células, 500000 células es suficiente y depositarlas sobre la placa,
rápidamente se adhieren y pueden visualizarse, si hay problemas con el hl5 y no
deja verlas bien, cambiar el medio por PDF, en la misma placa se puede retirar y
poner PDF sobre ellas.
3. Una buena preparación siempre debe ser iniciada con muchas células pegadas, si
comenzamos con pocas, nuestro éxito no será mucho, así que hay que asegurarse
de que las células están bien pegadas, no poner pocas ni muchas ya que
interfiere en que se peguen el resto(entre 3 y 5 millones como mucho).
4. La preparación del paraformaldehido puede resultar aburrida y costosa
inicialmente sin embargo con un pequeño ayudante como es el hidróxido sódico
o sosa(NaOH) nos será más facil. Si preparamos 10-15ml ponemos 5ul de
NaOH 1M en la disolución con paraformaldehído, esto aumenta el ph y hace que
se disuelva el paraformaldehído más fácilmente (ojo con no pasarse y mirar con
un papel de ph que tras la disolución el ph queda alrededor de 7-8) . También
ayudaremos con agitación y 60-65ª de T, nunca debe superarse está temperatura.
Ojo con los vapores. Hacerlo en la cámara de gases y taparlo con papel de
aluminio.
5. Mi experiencia me dice que un paraformaldehído frío fija mejor que si aun tiene
cierta temperatura al proceder del baño a 65º, así que ponerlo en cuanto se acabe
de disolver en hielo y cubierto de papel albal para no inhalar aromas tóxicos.
Utilizar siempre mascarilla y guantes.
6. Cuando realizamos cualquier inmuno y tenemos que permeabilizar con metanol,
este debe ser echado por la pared del pocillo de manera rápida, ni mucho menos
debe pensarse que hay que realizarlo poco a poco, es necesario echarlo y mover
un pelín la placa para que no se forma una especie de remolino que levanta todas
las células y puede arruinar nuestra preparación. Del mismo modo hay que poner
el paraformaldehido.
7. Las cantidades de anticuerpo y tiempo de exposición variarán dependiendo del
anticuerpo, las células etc. Inicialmente habrá que probar para ver que funciona
mejor.
8. Si se quiere conservar la preparación es mejor usar prolong ya que protege mejor
la preparación y la fluorescencia no se pierde, el glicerol es peor protector pero
si queremos usar para ver un día y tirar puede usarse glicerol sin problemas.