PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
1.
OBJETIVO.
Preparar los medios necesarios para inducción de callo a partir de raíz de zanahoria, introducción
en cultivo “in vitro” de tallo de crisantemo, micropropagación de olivo y medio de enraizamiento de olivo
que se necesitarán para las prácticas de la asignatura.
2.
MATERIAL
Agitador magnético
Imanes para agitar
Probetas
Pipetas automáticas de 1 y 10 ml
Soluciones madre
Agar
Sacarosa
Granatario
Balanza de precisión
pHmetro
3.
METODOLOGÍA
3.1. Introducción “in vitro” de tallo de crisantemo
Para esta práctica se utilizarán 3 medios: A, B y C que difieren entre sí sólo en lo que respecta a las
hormonas. El medio base es el que se describe en los párrafos 1 y 2 a, b, c y de del apartado 3.1. y se
preparan como allí se describe. Se preparará un volumen de 500 ml de cada uno de los medios A, B,
yC
Se toma un vaso de precipitados de 500 ml, se adicionan aproximadamente 200 ml de agua
destilada y se van adicionando, a la vez que se agita la solución, los siguientes volúmenes de soluciones
madre:
1) Compuestos inorgánicos
a) Macronutrientes
50 ml de solución madre de NH4NO3 del medio MS 10 X
50 ml de solución madre de KNO3 del medio MS 10 X
(16.5 g/l)
(19.0 g/l)
50 ml de solución madre de CaCl2.2H2O del medio MS 10 X (4.4 g/l)
50 ml de solución madre de MgSO4.7H2O del medio MS 10 X (3.7 g/l)
50 ml de solución madre de KH2PO4 del medio MS 10 X (1.7 g/l)
b) Micronutrientes
50 ml de solución madre de FeSO4.7H2O y Na2EDTA.2H2O del medio MS 10 X (0.278 g/l del
primero y 0.372 g/l del segundo
5 ml de solución madre de MnSO4.H2O 100X de 1.69 g/l
5 ml de solución madre de ZnSO4.7H2O 100X de 0.86 g/l
5 ml de solución madre de H3BO3 100X de 0.62 g/l
1
5 ml de solución madre de KI 100X de 0.083 g/l
5 ml de solución madre de Na2MoO4.2H2O 100X de 0.025 g/l
0.5 ml de solución madre de CuSO4.5H2O 100X de 0.025 g/l
5 ml de solución madre de CoCl2.6H2O 100X de 0.0025 g/l
2) Compuestos orgánicos
a) Vitaminas, aminoácidos y hexitoles: 25 ml finales
de solución madre de tiamina HCl de 0.002 g/l
de solución madre de ácido nicotínico de 0.01 g/l
de solución madre de Piridoxina HCl
de 0.01 g/l
de solución madre de Glicina
de 0.04 g/l
de mioinositol de 2 g/l
Carbohidrato
15 g de sacarosa
A continuación veremos las hormonas que cada uno de estos medios contiene:
MEDIO A: medio base + kinetina (K) 2 mg/l y ácido indolacético (IAA) 4 mg/l
Se prepara medio base y se le adiciona para 500 ml: 0.5 ml de solución de K de 0.002 g/ml
0.5 ml de solución de IAA de 0.004 g/ ml
MEDIO B: medio base + bencilaminopurina (BAP) 1,5 mg/l y 0,5 mg/l IAA.
Se prepara medio base y se le adiciona para 500 ml de medio 0.5 ml de solución de BAP de 0.0015 g/ml
0.0625 ml de solución de IAA de 0.004 g/ml
MEDIO C: medio base +Acido giberélico (GA3 ) 3 mg/l
Se prepara medio base y se le adiciona para 500 ml de medio: 0.5 ml de solución de GA 3 de 0.003 g/ml
Una vez disueltos todos los componentes, se completa la solución hasta unos 450 ml, se ajusta el
pH a 5.8, se añaden 3.75 g de agar, se disuelve en microondas, se reparte en tubos de cultivo a razón de
15 ml/tubo y se autoclava 20 min a 121 ºC.
3.2. Medio para micropropagación de olivo. Se preparará un volumen de 500 ml.
Se toma un vaso de precipitados de 500 ml, se adicionan aproximadamente 150 ml de agua
destilada y se van adicionando, a la vez que se agita la solución, los siguientes volúmenes de soluciones
madre:
a)
50 ml de solución A
50 ml de solución B
50 ml de solución C
50 ml de solución madre D
10 ml de solución madre E
5 ml de la solución F1
5 ml de F2
50 ml de H
b) Hexitoles
0.5 g de mio-inositol
c) Fuente de carbono
15 g de sacarosa
2
d) Hormonas: Se preparan como se describe en cada uno de los apartados A, B y C del guión de
prácticas para micropropagación de olivo
Una vez disueltos todos los componentes, se completa la solución hasta unos 450 ml, se ajusta el
pH a 5.8, se añaden 3.5 g de agar, se disuelve en microondas, se reparte en tubos de cultivo a razón de 15
ml/tubo y se autoclava 20 min a 121 ºC.
3.3. Medio para enraizamiento de olivo. Se preparará un volumen de 500 ml.
Se toma un vaso de precipitados de 500 ml, se adicionan aproximadamente 200 ml de agua
destilada y se van adicionando, a la vez que se agita la solución, los siguientes volúmenes de soluciones
madre:
a)
25 ml de solución A
25 ml de solución B
25 ml de solución C
25 ml de solución madre D
5 ml de solución madre E
2.5 ml de la solución F1
2.5 ml de F2
25 ml de H
b) Hexitoles
0.5 g de mio-inositol
c) Fuente de carbono
15 g de sacarosa
d) Hormonas: Se preparan como se describe en cada uno de los apartados A, B y C del guión de
prácticas para enraizamiento
Una vez disueltos todos los componentes, se completa la solución hasta unos 450 ml, se ajusta el
pH a 5.8, se añaden 3.5 g de agar, se disuelve en microondas, se reparte en tubos de cultivo a razón de 15
ml/tubo y se autoclava 20 min a 121 ºC.
1.
Bibliografía
Álvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de
prácticas de
Biotecnología Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz)
Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort.
Science, 19(4).
Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiología Plantarum, 15, 473-497.
Revilla, M.A.; Pacheco, J.; Casares, A. y Rodríguez, R. In vitro reinvigoration of mature olive trees
(Olea europaea L.) through micrografting. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 32:257-261 1996.
3