Determinación del número de grupos sulfidrilo y de enlaces disulfuro... espectrometría de masas 21

21
PROTEÓMICA ● NÚMERO 0 ● JULIO 2007
Determinación del número de grupos sulfidrilo y de enlaces disulfuro mediante
espectrometría de masas
Juan José Calvete
Laboratorio de Proteinómica Estructural, Instituto de Biomedicina de Valencia, C.S.I.C., Jaume Roig 11,
46010 Valencia. Tel.: 96 339 1778; Fax: 96 369 0800; E-mail: [email protected]
Resumen:
En este artículo se exponen, discuten e ilustran principios generales y sencillos protocolos basados en espectrometría de masas- para la cuantificación del número de cisteínas y enlaces
disulfuro de proteínas monoméricas, homo- y heterodiméricas, y multiméricas.
Palabras clave:
Cuantificación de cisteína, determinación de grupos sulfidrilo, enlace disulfuro, espectrometría
de masas MALDI-TOF, espectrometría de masas ESI.
Introducción
Además de su relevancia funcional en
proteínas que actúan mediante mecanismos de
oxido-reducción (redox), de todos los
aminoácidos proteicos, la cisteína es el único
utilizado ampliamente durante la evolución
para estabilizar la estructura espacial (terciaria
o cuaternaria) de proteínas que, por su tamaño
y/o secuencia, carecen de un núcleo
hidrofóbico estable o de los elementos de
estructura secundaria regular (hélice alfa, hojas
beta) formadores de enlaces de hidrógeno
(Cheek et al., 2006). Por el contrario, los
enlaces disulfuro son raros en proteínas
termoestables. Los enlaces disulfuro intra- e
intermoleculares se forman por oxidación de
cisteínas espacialmente cercanas (≤ 5Å entre
los Sγ) en las estructuras terciaria y cuaternaria,
respectivamente.
Se acepta generalmente que el efecto
estabilizador de un enlace disulfuro es debido a
que su formación reduce los grados de libertad
conformacional del estado desplegado,
reduciendo así la entropía del estado
desplegado (Anfisen y Scheraga, 1975;
Thornton, 1981). El aporte energético de un
enlace disulfuro a la conformación nativa es de
2.5-3.5 kcal/mol. El gran impacto estructural a
bajo coste energético destaca la importancia de
la ingeniería de enlaces disulfuro como un
mecanismo evolutivo de la diversificación
estructural ( y por tanto, funcional) de proteínas
que, como es el caso de muchas toxinas, están
sometidas a evolución Darwiniana acelerada
(Olivera, 2006; Calvete et al., 2003a; Ménez,
2002). En el caso de serpientes y lagartos
ponzoñosos, los venenos se originaron en
etapas tempranas de su evolución por
reclutamiento, y posterior transformación
estructural y funcional, de proteínas ordinarias
pertenecientes a un número reducido de
familias proteicas (Fry et al., 2006).
Una característica de estas proteínas es su
alto contenido en cisteínas, las cuales
usualmente se encuentran formando enlaces
disulfuro. El número de cisteínas totales,
reducidas (grupos sulfidrilo) y oxidadas
(formando enlaces disulfuro), es en gran
medida específico de cada familia de toxinas
(Tabla 1) y tiene, por tanto, un valor
taxonómico relevante. En efecto, un serio
inconveniente a la hora de caracterizar
mediante técnicas proteómicas el conjunto de
proteínas presentes en los venenos de
serpientes es la total carencia de bases de datos
de genomas de reptiles. Una traba añadida es
que, a pesar de que la base de datos pública
UniProtKB/TrEMBL (v.35.3, 17 de Abril del
2007) (http://us.expasy.org/sprot/) contiene 932
secuencias de proteínas de serpientes ("viper")
que representan a todas las familias de
proteínas encontradas en los venenos, las
estructuras primarias de toxinas de una misma
familia varían enormemente debido a su
diversificación estructural por evolución
acelerada, impidiendo -por lo general- una
identificación basada en el análisis de la huella
22
PROTEÓMICA ● NÚMERO 0 ● JULIO 2007
peptídica mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF. Se necesita, pues, recurrir a la
secuenciación de novo mediante MS/MS y a la
búsqueda posterior de similitud de secuencia
(utilizando BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST). Sin embargo, el orden de estos
dos pasos puede invertirse, para nuestro
provecho, si conocemos a priori en qué familia
proteica englobar a una determinada toxina.
Así, en aquellos casos en los que la calidad de
los espectros de fragmentación no es suficiente
para la secuenciación de novo completa de los
iones peptídicos, este conocimiento nos
permite generar un alineamiento múltiple de
todas las proteínas homólogas conocidas que
nos sirva entonces bien de guía para extender
las secuencias parciales deducidas, bien para
realizar un análisis tipo MS-BLAST
(Shevchenko et al., 2001) (http://dove.emblheidelberg.de/Blast2/msblast.html) frente a una
base de datos propia, específica y reducida.
yodoacetamida)1 (concentración final de 25
mM) durante 1 hora a temperatura ambiente y
en la oscuridad (Henschen, 1986). A
continuación, las proteínas de las muestras A,
B y C se purifican utilizando pipetas Zip-Tip
C18 (Millipore) previamente activadas con una
mezcla de acetonitrilo (ACN) al 70% y TFA al
0.1% y equilibradas en TFA al 0.1%. Tras la
adsorción a la matriz C18 (5-6 ciclos de
pipeteo), las Zip-Tip se lavan 5-6 veces con
0.1% TFA. Las proteínas libres de reactivos se
eluyen con 3-5 μl de 70% ACN/0.1% TFA y
sus masa moleculares se determinan mediante
nanoESI-MS o MALDI-TOF MS utilizando
ácido sinapínico (ácido 3,5-dimetoxi-4hidroxicinámico) saturado en 70% ACN/0.1%
TFA como matríz.
El número de grupos sulfidrilo reactivos
(NSH) se calcula mediante la ecuación I:
NSH = (MALK - MNAT)/MR
Contando cisteínas y enlaces disulfuro
A. Proteínas monoméricas
La espectrometría de masas es, sin duda, la
técnica idónea, por su sencillez y precisión,
para determinar el contenido en cisteínas libres
(grupos sulfidrilo, SH) y enlaces disulfuro
(cistinas, S-S) de una proteína. Para ello, la
muestra
(típicamente
una
fracción
cromatográfica eluída de una columna C18 de
fase reversa) se divide en tres alícuotas y éstas
se secan mediante centrifugación a vacío
(SpeedVac) o liofilización. Las muestras se
disuelven en 10 μl de tampón 50 mM HEPES,
pH 9.0, conteniendo 5M cloruro de guanidina y
1 mM EDTA, y las proteínas se desnaturalizan
a 85 ºC durante 15 min. Una de las muestras
(A) no será sometida a tratamiento posterior y
se utlizará para medir la masa molecular de la
proteína nativa (MNAT). A la muestra B se le
añade un reactivo alquilante (4-vinilpiridina o
yodoacetamida) hasta una concentración final
de 10 mM y la mezcla se deja a temperatura
ambiente (~25 ºC) y en la oscuridad durante 1
hora. Esta muestra se utilizará para determinar
la presencia de grupos sulfidrilo reactivos. Por
último, la muestra C se reduce con 10 mM 1,4ditioeritriol (DTE) durante 15 min. a 80 ºC, y
los grupos sulfidrilos se bloquean con un
reactivo
alquilante
(4-vinilpiridina
o
(ecuación I),
donde MALK representa la masa molecular de la
proteína desnaturalizada, pero no reducida,
incubada en presencia del reactivo alquilante
(muestra B); MNAT es la masa de la proteína
nativa (muestra A), y MR es el incremento de
masa debido a la alquilación de un grupo
sulfidrilo (105.3 Da para S-piridiletilación, si
se utilizó 4-vinilpiridina como agente
alquilante, y 57.1 Da por carbamidometilación
por yodoacetamida).
El número total de cisteínas se determina
entonces mediante la ecuación II:
NCys = [(MCM - MALK)/(MR +1)] + NSH (ecuación II),
1
La yodoacetamida y la 4-vinilpiridina, en las
concentraciones
normalmente
empleadas
(exceso molar de 5 respecto a la concentración
de resíduos de cisteína o del reactivo reductor,
lo que en la práctica equivale a concentraciones
finales de 50-250 mM) son reactivos específicos
para grupos sulfidrilo. La solubilidad de 4-VP
en tampones acuosos es muy baja y debe
emplearse para alquilar proteínas en presencia
de cloruro de guanidino 5-6 M. Hay que tener
también en cuenta que la pridiletilación aumenta
la hidrofobicidad de las proteínas, por lo que,
para las medidas espectrométricas, éstas deben
ser manejadas en disoluciones conteniendo
solventes orgánicos (ej. 70% acetonitrilo/0.1%
TFA, que se emplea para desorber proteínas del
material C18 de las pipetas Zip-Tip).
23
PROTEÓMICA ● NÚMERO 0 ● JULIO 2007
en la que MCM es la masa de la proteína
totalmente reducida y alquilada, y (MR +1) es
el incremento de masa debido a la alquilación
de un resíduo de cisteína que previamente a la
reducción formaba parte de un enlace disulfuro
(106.3 Da o 58.1 Da, dependiendo de que se
utilizara, respectivamente, 4-vinilpiridina o
yodoacetamida como agente alquilante). En el
caso de péptidos, cuya masa molecular puede
ser determinada con precisión isotópica (ej.
utilizando el reflectrón de un instrumento de
tiempo de vuelo o mediante ionización por
electrospray), nominalmente bastaría con
reducir la muestra para determinar su contenido
en S-S (Fig.1). Sin embargo, dado que la
reducción de un enlace disulfuro produce un
pequeño incremento de masa (+2 Da/S-S),
cuando la exactitud de la medida es ≤ 2 Da, se
hace necesario amplificar esa diferencia
mediante la introducción de un grupo
alquilante.
Figura 1. Espectros de masas obtenidos en un
instrumento de tiempo de vuelo Voyager DE-Pro™
(Applied Biosystems) en modo reflectror, mostrando la
distribución isotópica de los iones. La diferencia de 2 Da
entre las masas del péptido nativo (NR) y del reducido
(Red) indica la existencia de un S-S intramolecular.
Finalmente, el número de enlaces disulfuro
(NS-S) puede calcularse mediante la ecuación
III:
NS-S = (Ncys - NSH)/ 2 (ecuación III).
Las unidades de masa en las ecuaciones IIII están expresadas en Daltons (1 Da o unidad
de masa atómica unificada (1 u) = 1/12 de la
masa del C12 = 1/NA (gramos), siendo NA el
número de avogadro (1.66053886 ±
0.00000028) x 10-24 g).
Para ilustrar lo anteriormente expuesto
examinemos la Figura 2.
Figura 2. Determinación del número de grupos sulfidrilo
y de enlaces disulfuro mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF utilizando un espectrómetro Voyager DEPro™ (Applied Biosystems). Panel A, espectro de masas
de la proteína nativa que resultó ser idéntico al de la
proteína desnaturalizada, pero no reducida, y tratada con
4-vinilpiridina. Panel B, Masa molecular de la proteína
completamente reducida y S-piridiletilada.
El panel A muestra el espectro de una
proteína del veneno de Sistrurus miliarius
barbouri purificada por HPLC de fase reversa
(Juárez et al., 2004). La masa de la proteína no
24
PROTEÓMICA ● NÚMERO 0 ● JULIO 2007
varió en presencia de 4-vinilpiridina (MNAT =
MALK = 13980 Da), deduciendose que la
proteína no contiene cisteínas libres. Por otra
parte, la masa molecular de la proteína
reducida y S-piridiletilada (MCM) sufrió un
incremento de 15483 - 13980 = 1503 Da,
indicando que la proteína posee un total de
1503/106.3 = 14.1 (14) resíduos de cisteína, los
cuales, en la proteína nativa, forman 7 enlaces
disulfuro. Muy posiblemente se trata de una
PLA2 (Tabla 1).
Tabla 1. Clasificación de toxinas de venenos de serpientes de las familias Viperidae (víboras) y Crotalidae
(crótalos, serpientes de cascabel) en función de su contenido de cisteínas y enlaces disulfuro. a, enlaces
disulfuro intermoleculares; b, enlaces disulfuro intramoleculares; PLA2, fosfolipasa tipo A2; CRISP, proteína
rica en cisteínas; SVMP, Zn2+-metaloprotease de tipo PI de veneno de serpiente; DC, fragmento C-terminal
de SVMP de tipo PIII (SVMP-PIII) compuesto por un dominio tipo disintegrina y un dominio rico en
cisteínas; svVEGF, factor de crecimiento endotelial de veneno de serpiente; LAO, L-aminoácido oxidasa.
Rango de masa molecular
(kDa)
1.6-2
4- 5
6- 8
10-12
13-15
23-33
46-58
Nº total de:
Familia proteica
-SH
S-S
1
1
1
1
3
4
3
5
6
2
(2a + 4b)
7
8
4
6
(1a + 3b)
(1a + 4b)
13
3
18
Péptido natriurético
Miotoxina
Disintegrin corta
Inhibidor tipo Kunitz
Subunidad de disintegrina dimérica
Disintegrina mediana
Ohanina
Cistatina
Disintegrina dimérica
PLA2
CRISP
PI-SVMP
Proteasa de serina
C-lectin αβ
svVEGF
Fragment DC
LAO
PIII-SVMP
Figura 3. Espectros de masa MALDI-TOF (Voyager DE-Pro™, Applied Biosystems) de una proteína homodimérica
nativa (izquierda) y de su subunidad (derecha) aislada por RP-HPLC tras reducción de sus S-S y S-piridiletilación
de los grupos sulfidrilo formados.
25
PROTEÓMICA ● NÚMERO 0 ● JULIO 2007
De manera similar, la cuantificación del
número total de resíduos de cisteína de una
proteína heterodimérica (LS) exige reemplazar
el término MCM de la ecuación II por la suma de
las masas de las subunidades mayor (L) y menor
(S) reducidas y alquiladas (MCM L + MCM):
de cisteínas (NCYS) del heterodímero LS es:
[(8687.1 + 8162.8 - 14733.7)/106.3] = 19.9 y
[(8204.6 + 7680.8 - 14733.7)/ 58.1] = 19.8.
Además, combinando los dos conjuntos de datos
podemos determinar el número de cisteínas
presentes en cada subunidad:
NCys LS = [((MCM L + MCM S) - MALK)
/(MR +1)] + NSH (ecuación V).
NCysL = (MVPL - MIAL)/ (ΔMVP-ΔMIA)
(ecuación VIa)
La figura 4 muestra los espectros de masas
de una proteína de masa molecular MNAT =
MALK = 14733.7 Da (panel central) y de sus
subunidades aisladas tras reducción y
alquilación con 4-vinilpiridina (4VP, paneles
superiores) y con yodoacetamida (IA, paneles
inferiores).
NCysS = (MVPS - MIAS)/ (ΔMVP-ΔMIA)
(equation VIb),
Figura 4.
Espectros de masas MALDI-TOF
(adquiridos como en las figuras 1 y 2) de una proteína
heterodimérica nativa (panel central) y de sus subunidades
S (izquierda) y L (derecha) aisladas mediante HPLC de
fase reversa tras reducción de sus S-S y S-piridiletilación
(paneles superiores) y carbamidometilación (paneles
inferiores) de los grupos sulfidrilo generados.
Resulta evidente que se trata de una proteína
heterodimérica y que ninguna de sus
subunidades contiene grupos sulfidrilo. Por otra
parte, los resultados de alquilación con 4VP o
con IA, podemos determinar que el número total
En las ecuaciones VIa y VIb, (MVPL - MIAL) y
(MVPS - MIAS) corresponden, respectivamente, a
la diferencia entre las masas alquiladas con 4vinilpridina y con yodoacetamida de las
subunidades mayor y menor, y (ΔMVP-ΔMIA) es
la diferencia entre el incremento de masa debido
a la alquilación de un grupo tiol con 4vinilpyridina (ΔMVP) o con yodoacetamida
(ΔMIA) (106.3 - 58.1 = 48.2). Utilizando los
datos de la figura 4 se deduce que las
subunidades L y S de la proteína de MNAT
14733.7 Da contienen, respectivamente, (8687.1
- 8204.6)/ (106.3 - 58.1) = 10 Cys y (8162.8 7680.8)/ (106.3 - 58.1) = 10 Cys. Debe tratarse,
pues, de una disintegrina heterodimérica (Tabla
1).
Es necesario aclarar que, con independencia
de los reactivos alquilantes que se utilicen en un
experimento de doble marcaje -como el
mostrado en la figura 4- las especies de mayor
(o menor) masa molecular corresponden a la
misma
subunidad.
Esta
relación
de
proporcionalidad se cumple siempre que i) el
número de cisteínas de la subunidad mayor sea
igual o mayor que el de la subunidad menor
(NCYSL ≥ NCYSS), o ii) en el caso de que NCYSS
> NCYSL, la diferencia entre las masas
moleculares de las subunidades mayor (MNATL)
y menor (MNATS) sea superior a la diferencia
entre el número de cisteínas de la subunidad
menor (NcysS) y el número de cisteínas de la
subunidad mayor (NcysL) multiplicada por el
incremento de masa debido a la alquilación de
un grupo tiol por el agente alquilante que genera
mayor aumento de masa (MRH). Esta segunda
condición puede expresarse de manera general
mediante la ecuación VII:
(ML - MS) > (NcysS - NcysL) x MRH
(equation VII).
26
PROTEÓMICA ● NÚMERO 0 ● JULIO 2007
Aunque, tanto en el caso de proteínas homo- y
heterodiméricas, los datos relativos a la cantidad
de cisteínas de sus subunidades no permiten
asignar el número de enlaces S-S intra- e
intermoleculares, si que se puede formular de
manera general que si una proteína dimérica no
contiene grupos -SH, entonces tanto el número
de S-S intracatenarios como el de S-S
intermoleculares será par si las subunidades
contienen un número par (2n) de cisteínas, e
impar (2n-1) si el número de cisteínas de cada
subunidad es impar. Nótese que no puede darse
el caso de que una subunidad contenga 2nCys y
la otra (2n-1) Cys.
son [MCMSub- (8 x 58.1)]: 16041 Da (SubA),
15906 Da (SubB), 14743 Da (SubC), 14828 Da
(SubD) y 14799 Da (SubE). El ∑MNATSubA-E =
76317 Da. La diferencia entre este valor y la
masa molecular de la proteína nativa es -15834
Da, indicando que la proteína nativa es
hexamérica con una estequiometría cuaternaria
[A(B)2CDE].
C. Proteínas multiméricas
Conceptualmente, los mismos principios
que se aplican para la determinación del
contenido de sulfidrilos y enlaces disulfuro en
proteínas diméricas son válidos para proteínas
n-méricas, si bien, logicamente, hay que
modificar las ecuaciones anteriores. Así, el
número total de cisteínas de una proteína
multimérica (NCys Mult) puede determinarse
mediante una modificación de las ecuaciones II,
IV y V:
NCys Mult = [(∑MCM Sub) - MALK) /(MR +1)] +
NSH (ecuación VIII),
donde ∑MCM Sub es el sumatorio de las masas
moleculares de todas las subunidades reducidas
y alquiladas.
La figura 5 ilustra el protocolo seguido para
establecer la estructura cuaternaria de una
proteína multimérica (masas moleculares
aparentes por SDS-PAGE: MNAT, 94 kDa; MSUB,
13-16 kDa). La masa molecular de la proteína
nativa (92151 ± 11 Da) fue determinada
mediante ionización por electrospray con un
espectrómetro híbrido triple cuadrupolo-trampa
iónica lineal (QTrap 2000, Applied Biosystems)
(panel A). Mediante la ecuación VIa (o VIb), y
partiendo
de
las
masas
moleculares
determinadas para las subunidades aisladas por
HPLC de fase reversa piridiletiladas y
carbamidometiladas (tabla), se deduce que cada
subunidad contiene un total de 8 cisteínas. Por
tanto, las masas moleculares promedio
calculadas para las subunidades nativas (con
todas las cisteínas formando S-S) (MNATSub)
Figura 5. Espectros de masas adquirido mediante
ionización por electrospray (ESI) en un espectrómetro
QTrap 2000 (Applied Biosystems) de una proteína
purificada del veneno de Bitis nasicornis (A) y de una de
sus subunidades (B). La masa molecular aparente, por
SDS-PAGE, de la proteína nativa es 94 kDa y la
determinada por ESI-MS es 92151 ± 11 Da. La reducción
y alquilación de esta proteína produjo las subunidades
listadas en la tabla. El espectro ESI-MS mostrado en el
panel B corresponde a la subunidad piridiletilada de
16756 Da.
Este tipo de estructura supramacromolecular
es típico de C-lectinas multiméricas formadas
por la asociación cíclica de heterodímeros (αβ).
Cada dímero contiene 3 S-S intracatenarios, 1 SS interdimérico y se enlaza a otros dos dímeros
mediante dos S-S, uno entre las cisteínas Nterminal (Cys1) de la subunidad α y C-terminal
(Cys8) de la subunidad β y otro entre las
correspondientes cysteínas C-terminal de la
subunidad β y N-terminal de la subunidad α de
dímeros vecinos. La proteína de 92 kDa puede
describirse como un trímero de dímeros de
27
PROTEÓMICA ● NÚMERO 0 ● JULIO 2007
fórmula [(αβ)2]3 o [α-SS-β]1-CysCterα-CysNterβ[α-SS-β]2-CysCterα-CysNterβ-[α-SS-β]3-CysCterαCysNterβ-[α-SS-β]1 (Calvete et al., 2003b). La
asociación cabeza-cola de heterodímeros αβ es
una solución evolutiva sencilla para formar
polímeros de complejidad creciente, (αβ)n, que
desarrollen nuevas actividades biológicas. Pero
esto es harina de otro costal...
Otras consideraciones
La metodología descrita ha sido aplicada en
nuestro
laboratorio
esencialmente
para
caracterizar toxinas de venenos de serpientes e
ilustra los conceptos básicos aplicables
toericamente a cualquier otra proteína. La
limitación práctica es la precisión con que
puedan medirse las masas de las diversas
especies moleculares. Ello no sólo depende de
las características operativas del espectrómetro
de masas sino también de las propiedades
fisicoquímicas de la proteína. Además,
modificaciones
postraduccionales
como
glicosilación (en particular con azúcares
ácidos), sulfatación, fosforilación, etc. suelen
producir poblaciones proteicas heterogéneas y
afectan a las propiedades iónicas y, por tanto, al
proceso de ionización de las proteínas. La masa
molecular de la proteína cuyo espectro de
masas se muestra en la figura 5 pudo ser
determinada por ESI-MS con una precisión de
unas 120 ppm. Sin embargo, la proteína de la
figura 6 (MAT, http://au.expasy.org/uniprot/
P13444, Mav calculada = 43567 Da, NCYS = 10)
no pudo ionizarse mediante electronebulización
aunque si utilizando MALDI-TOF-MS. En este
caso (Fig.6), se aprecia que los picos son más
anchos que los iones de la figura 5 y, por tanto,
de menor resolución. No obstante, incluso con
una resolución nominal 10 veces inferior a ESIMS (que puede mejorarse hasta ~ ±200 ppm si
se trabaja con un estándar interno y se optimiza
el tiempo de extracción de los iones), un valor
teórico de 44000 ± 50 Da permite determinar
con precisión suficiente la incorporación de un
grupo piridiletil (alquilación de un solo grupo
sulfidrilo), dado que un incremento de masa de
105.3 es 2.1 veces el error medio. Queda clara,
pues, la importancia de amplificar lo más
posible la diferencia de masa entre las especies
MNAT, MALK y MCM utilizando reactivos
alquilantes que generen un incremento de masa
(MR) mayor que el error experimental de la
medida. Aunque los reactivos alquilantes más
comunmente utilizados son yodoacetamida (MR
= 57.1) y 4-vinilpiridina (MR = 105.3), la
variedad de reactivos específicos de grupos
Figura 6. Espectros de masas de la proteína MAT nativa (A), MAT tratada con 4-vinilpiridina en condiciones
desnaturalizantes pero no reductoras (B) y MAT reducida y piridiletilada (C) adquiridos mediante MALDI en un
espectrómetro Voyager DE-Pro™ (Applied Biosystems) en modo lineal y con 200 nseg de extracción retardada (DE,
delayed extraction) de iones. La masa molecular promedio, Mav, de MAT fue 49 Da inferior a la Mav calculada (43567
Da). No obstante, dado que este error afecta, en principio, por igual a las medidas siguientes efectuadas con la misma
calibración, el cálculo de NSH = (44331-43518)/106.3 = 7.6, NCys = (44555 - 43518)/106.3 = 9.75, y NSS = (9.75-7.6)/2 =
1.07 indicó claramente que 2 de las 10 cisteínas de la molécula estaban formando un enlace disulfuro y las restantes 8
estaban reducidas (Pérez-Sánchez et al. 2003).
28
PROTEÓMICA ● NÚMERO 0 ● JULIO 2007
tioles es grande, en particular los conjugados a
fluoróforos diseñados para estudios de Biología
Celular. Un ejemplo interesante es la eosina-5´yodoacetamida. Este reactivo hidrosolúble
(Molecular Probes, Invitrogen: http://probes.in
vitrogen.com/media/msds/30450.html) produce
proteínas fluorescentes y genera un MR = 830.8.
Resulta, por tanto, muy sencillo investigar
como paso previo a la cuantificación de NSH,
por SDS-PAGE tras el tratamiento con el
fluróforo, si una proteína contiene o no grupos
sulfidrilo reactivos. También los reactivos
biotinilados específicos para grupos tioles (ej.
N-(biotinoyl)-N'-(iodoacetyl) ethylene diamine,
MR = 454.3, Molecular Probes, Invitrogen)
representan alternativas útiles tanto para aislar,
por cromatografía de afinidad utilizando
streptavidina inmovilizada, proteínas que
contengan grupos -SH, como para cuantificar
cisteínas reducidas.
Bibliografía
Anfinsen CB, Scheraga HA. 1975. Experimental and
theoretical aspects of protein folding. Advances
in Protein Chemistry 29: 205–300.
Olivera BM. 2006. Conus peptides: biodiversitybased discovery and exogenomics. Journal of
Biological Chemistry 281: 31173-31177.
Calvete JJ, Moreno-Murciano MP, Theakston RDG,
Kisiel DG et al. 2003a. Snake venom
disintegrins: novel dimeric disintegrins and
structural diversification by disulphide bond
engineering. Biochemical Journal 372: 725-734.
Sánchez-Pérez G, Gasset M, Calvete JJ, Majares
MA. 2003. Role of an intrasubunit disulfide in
the association state of the cytosolic homooligomer
methionine
adenosyltransferase.
Journal of Biological Chemistry 278: 72857293.
Calvete JJ, Moreno-Murciano MP, Marcinkiewicz
C.
2003b.
Venenos
de
serpientes.
Diversificación estructural de proteínas
ancestrales. Investigación y Ciencia Abril 2003:
33-35.
Cheek S, Krishna S, Grishin NV. 2006. Structural
classification of small, disulphide-rich protein
domains. Journal of Molecular Biology 359:
215-237.
Fry BG, Vidal N, Norman JA, Vonk FJ et al. 2006.
Early evolution of the venom system in lizards
and snakes. Nature, 439: 584-588.
Henschen A. 1986. Analysis of cyst(e)ine residues,
disulfide bridges, and sulfhydryl groups in
proteins. Advanced Methods in Protein
Microsequence Analysis (Wittmann-Liebold et
al., eds.), Springer Verlag, Berlin, pp.244-255.
Juárez P, Sanz L, Calvete JJ. 2004. Snake venomics:
characterization of protein families in
Sistrurus barbouri venom by cysteine
mapping, N-terminal sequencing, and tandem
mass spectrometry analysis. Proteomics 4:
327-338.
Ménez A (Ed.). 2002. Perspectives in Molecular
Toxinology, John Wiley & Sons, Ltd.:
Chichester, UK.
Shevchenko A, Sunyaev S, Lobodo A, Shevchenko
A et al. 2001. Charting the proteomes of
organisms with insequenced genomes by
MALDI-Quadrupole
time-of-flight
mass
spectrometry and BLAST homology searching.
Analytical Chemistry 73: 1917-1926.
Thornton JM. 1981. Disulphide bridges in globular
proteins. Journal of Molecular Biology 151:
261-287.