Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs
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TRABAJO PRÁCTICO N° 6 Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs FUENTE: CÁTEDRA HEMATOLOGÍA CLÍNICA UNLP A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION a) Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%). b) Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, antiB, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. c) Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2% d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. e) Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y macroscópicamente. f) Scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++ varios aglutinatos grandes + muchos aglutinatos pequeños pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo - negativo no se observan aglutinatos B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO a) Tomar una muestra de suero libre de hematíes. b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes: 1) hematíes A conocidos 2) hematíes B conocidos 3) hematíes del propio individuo 4) hematíes O conocidos c) Incubar 1 hora a ta o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. d) Leer primero los controles y luego los problemas, microscópicamente en visor y macroscópicamente. C. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2% a) Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn. b) Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. c) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica. d) Tomar una gota de culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%. D. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA a) b) c) d) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota. Agregar una gota de anti-A absorbido1 y mezclar bien con una varilla de punta fina. Al terminar de mezclar, disparar el cronómetro. Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto. Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados: Glóbulos rojos problema Suero problema Anti A + + Anti B + + Anti AB + + + Grupo ABO A B O AB GR A + + - GR B + + - GR AB + + + - Grupo ABO A B O AB E. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn. b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra. c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm. d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se hará microscópicamente con un visor y macroscópicamente. e) Proceda de la misma manera con los tubos controles. E.1 Controles a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB. E.2 Reacciones Positiva: los hematíes D(Rho) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el culot globular. Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación. 1 También se puede utilizar un monoclonal anti-A1 F. PRUEBA PARA DETECTAR Du Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti –D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. Coloque dos gotas de suero anti –D(Rho) en un tubo de Kahn2. Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina. Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C. Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Centrifugue y elimine el sobrenadante. 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se hará macro y microscópicamente. 1) 2) 3) 4) F.1 Reacciones Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar desprender el culot globular. Negativa: los hematíes Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y no aglutinarán. F.2 Controles utilizados Se utilizan tres controles para 1. Probar la bondad del suero 2. Comprobar su especificidad 3. Para seudoaglutinación Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con el antígeno E(rh”) presente ,dado que, en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo. El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero). Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados. El tercer control, es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de persona de grupo sanguíneo AB, se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados. 2 La detección de Du también se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du. G. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS. G.1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%. 2) Centrifugar, quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica, eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. G.2 Prueba de Coombs directa 6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%. 7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2 8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscópicamente con visor y microscópicamente. Anti-A, Anti-B o Anti A,B Monoclonal Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional. Por este motivo, la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes, se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. La ausencia de aglutinación en todos los casos, implica grupo O. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: - Solución fisiológica - Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS) - Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS) - Albúmina Bovina 30% de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Centrífuga - Tubos de hemólisis - Placas - Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". PROCEDIMIENTO En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica, PBS o LISS. I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa limpia, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. 2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse microscopio. II- TECNICA EN TUBO (por centrifugación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. III- TECNICA EN TUBO (por sedimentación) 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva. Grupo sanguíneo A B 0 AB Variants débiles del grupo A como Ax Anti-A + + +/- Antisuero Anti-B + + - Anti-A,B + + + + METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones: - Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido. Por esta razón deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros. - Leucemias u otros desórdenes malignos. - Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idéntico. - Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes, compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. - Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías, el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica, resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas células con 2 gotas de solución fisiológica. No debe producirse aglutinación. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. 1443152). Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. 1443154). Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. 1443153). BIBLIOGRAFIA - Moore, S. et al. “Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”. París, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59. - Widman, F.K. “Technical Manual”. 9th Edition, Washington, D.C. American Association of Blood Banks 1985. Chapter 8. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S. Disp. Nº: 1076/89 (Anti-A) Disp. Nº: 1073/89 (Anti-B) Disp. Nº: 1071/89 (Anti-A,B) Anti-D (Rho) monoclonal Reactivo para la detección de antígeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno, ya sea por transfusión o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente, se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente: - Solución fisiológica. - Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo. MUESTRA Glóbulos rojos o sangre entera a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la técnica que se emplee, podrán ser necesarios: - Centrífuga - Tubos de hemólisis - Placa de vidrio - Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos, o solución fisiológica. También puede emplearse sangre entera. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. II- TECNICA EN TUBO Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos, o en solución fisiológica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4). Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du. III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos, o solución fisiológica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. 4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica, descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico), mezclar, centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. 6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados. Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-50oC. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. 1443155). BIBLIOGRAFIA - Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940. - Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959. - Widman, F.K. - “Technical Manual” - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of Blood Banks, Chapter 9, 1985. - Race , R.R. and Sanger, R. - “Blood Groups in Man” - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific Publications, pág. 178, 1975. Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S. Disp. Nº: 1074/89 Suero Anti-humano (poliespecífico) Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica, siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta - Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. - Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. - Fenotipo de glóbulos rojos. - Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. Prueba Antiglobulina Directa - Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido. - Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. - Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos. FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente. REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. REACTIVOS NO PROVISTOS - Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos. De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente: - Solución fisiológica. - Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS). - Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS). INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo. MUESTRA Glóbulos rojos a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción). Si los glóbulos provienen de coágulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Centrífuga - Baño de agua a 37oC - Tubos de hemólisis PROCEDIMIENTO I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal). 1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar. 2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS. 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos. 4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm. 6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles. 7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles. II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica). El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos. Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%. 1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar. 2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS. 3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I). III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos. 1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%. 2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I). INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: - Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. - Lavado inadecuado de las células. - Tiempo o temperatura de incubación inadecuados. - Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados. - Concentración inadecuada de glóbulos rojos. - Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados. Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cód. 1443156). BIBLIOGRAFIA - Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945. - Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945. - Widman, F.K. - “Technical Manual”. 9th ed. Washington D.C. American Association of Blood Banks, pág. 376, 1985. Wiener lab. 2000 Rosario - Argentina Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Téc.: Viviana E. Cétola Bioquímica Producto Inscripto M.S. Disp. Nº: 2503/91 Determinación de anticuerpos inmunes A. TITULACIÓN DE ANTICUERPOS A.1 Técnica básica de titulación A.1.1. Preparación de diluciones madres. a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario). b) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solución fisiológica (SF). Colocar 0,300 ml de suero a titular en el tubo N°1. c) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2. d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones. A.1.2 Titulación a) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. Con una pipeta Pasteur para cada dilución, colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos. b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%. Agitar la mezcla. c) Incubar a la temperatura apropiada , el tiempo requerido. d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero. e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución. El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados. El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación . Si en la última dilución, con aglutinación, el tipo de aglutinato es tr, el título se determinará promediando dicha dilución con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16, el tipo de aglutinato es tr, el título será (16+8)/2=12. a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes. b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos gotas del suero a titular.
