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PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008
6
Intensity
556.4
b30+
296.3
y”2 +
a3+
286.4 294.2
4
5
y20+
276.2
2
0
solubilización con SDS
Intensity
833.6
556.4
K
b30+
296.1
8
6
y”2+
294.2
4
5
70
b50+
522.4
+
y”3
407.3
y”4
520.4
a4+
399.9
b3 +
314.2
y5 0+
b50+ 589.3
556.4
y”5+
607.4
[b5-I]+
443.3
b4+
427.3
b6*+
685.5
b40+
584.7
0
200
300
400
m/z
500
600
700
J
400
a2+
237.11
b2+
265.07
Intensity
b6+
b6
669.4 687.4
0+
[b6-I]+
574.4
b7+
815.6
b7*+
798.7
a6+
659.4
y”6+
607.7
600
b70+
797.4
800
700
y”4+
720.50
y”6+
520.36
b4 +
520.36
b40+
473.0
y”3 +
833.59
y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2
T Y I I S I L F K
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8
y”5+
607.47
a4+
b3 +
378.26 463.28
40
y”5+
607.7
500
50
833.6
y6 y5 y4 y3 y2
a5+
512.4
60
549.1
300
Intensity
60
a5+
546.4
b3 b4 b5 b6 b7
b5+
427.3
+
300
100
50
a4+
399.3
b6+
702.5
b1 b2 b3 b4 b5
b5+
574.5
y”4+
520.4
I I S I L F K
2
833.6
40
549.1
b40+
409.3
0
200
30
[b6 0-I]+
556.4
b4+
427.3
10
42.39
549.1
10
20
b4
409.2
y”3 +
407.3
mitocondria
[b60-II]+
443.3
D
10
b3+
314.1
Retentio n Time (min)
12
15
I S I L F K
0+
720.5
720.5
y5 y4 y3 y2 y1
[b50-II]+
330.2
L
549.1
10
549.1
[b50-I]+
443.3
8
42.23
E
15
30
b7+
804.48
2+
20
y”8+
294.23
10
200
300
y”1
b70+
540.42
b6+
786.47
b5+
691.45
578.28
y”7 +
407.33
400
500
600
700
800
y”2+
996.62
b8+
923.49 b80+
933.49
900
1000
digestión
péptidos
Figura 1. Esquema del proceso de identificación de Cx43 en la membrana mitocondrial de cardiomiocitos de rata
Perfil de expresión proteica diferencial de la infección porcina con PCV2 por
SDS-PAGE, marcaje enzimático mediante isótopos estables (16O/18O) y trampa
iónica.
Ramírez-Boo M1., Serrano H2., Núñez E2., Jorge I2., Vázquez J.2, Segalés Q.3, Garrido J. J.1, Moreno
A1.
1
Dpt. Genética, Universidad de Córdoba- CSIC; Córdoba. 2Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica,
CBMSO (CSIC-UAM); Madrid. 3Universitat Autónoma de Barcelona (CReSA); Barcelona.
Introducción
El circovirus porcino tipo 2 (PVC2) es el agente
primario causante del llamado síndrome del destete, enfermedad que afecta al sistema inmune y al
patrón de expresión de muchas proteínas del cerdo.
Con vistas a caracterizar los mecanismos inmunológicos implicados en la interacción cerdo-PCV2,
hemos realizado estudios de expresión diferencial
en ganglios linfáticos mediante una combinación
de SDS-PAGE, seguida de una digestión en gel de
las proteínas separadas, marcaje de los péptidos con
16
O/18O e identificación y cuantificación con trampa
iónica lineal.
Material y métodos
Diez cerdos obtenidos por cesárea y privados
de calostro (4 controles y 6 inoculados con PCV2)
fueron sacrificados, comprobándose que habían de-
37
PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008
sarrollado una infección subclínica. Los ganglios
linfáticos inguinales fueron resuspendidos en tampón de lisis (urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 4% (p/
v), DTT 1% (p/v), anfolitos 0,8%, PMSF 0,2M) y
sometidos a disociación mecánica. Los extractos
de proteína fueron mezclados en cada uno de los
grupos y se analizaron mediante SDS-PAGE, se
cortaron en 19 fracciones y se sometieron a digestión en gel, marcaje isotópico estable de los péptidos
resultantes con 16O/18O, y análisis por trampa iónica
lineal, según hemos descrito previamente (Serrano
et al., 2007). Para el procesamiento y análisis de
datos se utilizaron los programas pRatio y QuiXoT,
desarrollados en el Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica (CBMSO, CSIC-UAM, Madrid) (Navarro et al., 2007).
Resultados
Los resultados obtenidos tras la búsqueda fueron
analizados por el pRatio con una FDR del 5%, y
cuantificados con el QuiXoT. Se realizó un análisis
conjunto de todas las fracciones ya que mostraban
una distribución semejante. Se eliminaron del análisis aquellos péptidos cuya eficiencia de marcaje fue
menor que 0.7. Hasta ahora se ha analizado un 30%
del proteoma total y se han conseguido cuantificar
más de 1000 proteínas, de las cuales, una docena
presentaron cambios de expresión. La digestión de
las muestras fue homogénea y la oxidación de las
metioninas no afectó al cálculo de la cuantificación.
(Fig.1). Los cambios de expresión encontrados se
recogen en la (Fig.2).
Conclusiones
Nuestros resultados demuestran que, usando la
electroforesis 1DE acoplada a un marcaje enzimático mediante isótopos estables con 16O/18O y el análisis de los péptidos marcados mediante trampa iónica
lineal, es posible detectar cambios de expresión de
proteínas en ganglios linfáticos, con vistas a mejorar
nuestro conocimiento de la respuesta inmune del
cerdo al PCV2.
Bibliografía
Serrano H., Jorge I., Martínez-Acedo P., Navarro P.J.
et al., Proteómica 2007, 0:29-34.
Navarro Pj., Martínez P., Serrano H., Jorge I et al., Joint
SEProt-EuPA Congress 2007, Valencia, Spain,
February 10-14. Abstracts book, P 9, PP. 119.