Diagnóstico clínico

PRACTICA 1: PIPETEAR
Material:
• Prepipeta.
• Pipeta graduada.
• Vaso de precipitado.
• Agua.
Técnica:
• En el vaso de precipitado se llena con una cantidad suficiente de agua.
• Con la pipeta, limpia y seca, se coloca la prepipeta en la parte superior de la pipeta.
• Se mueve la rueda que se encuentra en la prepipeta, con la que conseguiremos que se llene de agua la
pipeta.
• Si al llenar la pipeta nos hemos sobrepasado en la cantidad de agua deseada, movemos de nuevo la rueda de
la prepipeta y así conseguiremos enrasar la cantidad deseada.
• Para enrasar debemos de colocar a la altura de los ojos la pipeta para que no se produzca ningún error en la
medición.
• Acabado el pipeteo, después de haber realizado varias repeticiones, limpiamos el material y lo colocamos
en su lugar correspondiente.
PRACTICA 2: PESAR. BALANZA GRANATORIO
Material
• Balanza Granatorio.
• Pesas.
• Portaobjetos (material a pesar)
Técnica:
• Antes de comenzar la practica, hay que asegurarse de que la balanza esta en reposo.
• En uno de los platillos se coloca el portaobjetos y en el otro platillo se van colocando poco a poco las pesas.
• Para comprobar si se necesitan o no mas pesas de las ya puestas, se baja la palanca para que los platillos
suban.
• Si la balanza no esta equilibrada se vuelve a poner en reposo y se ponen o se quitan pesas, dependiendo del
lado al que se incline la balanza.
• Así se sigue hasta que se equilibre la balanza.
• Si por el contrario la balanza se encuentra equilibrada se vuelve a poner en reposo y se cuentan las pesas
utilizadas para saber los gramos necesitados para que la balanza se esté en equilibrio.
PRÁCTICA III: PREPARACIÓN DE UNA DISOLUCIÓN
1. Introducción
Las disoluciones son mezclas homogéneas. Las disoluciones binarias tienen dos componentes: disolvente (el
mayoritario o el que da aspecto a la disolución) y soluto (el minoritario). Las disoluciones más frecuentes son
aquellas cuyo disolvente es el agua, llamadas disoluciones acuosas.
1
2. Material
− pipetas
− matraces aforados
− balanza electrónica
− vidrio de reloj
− varilla de vidrio
− frasco lavador
− espátula
3. Procedimiento
Preparación de una disolución a partir de un soluto sólido
El primer paso es pesar la cantidad necesaria de soluto. Pero antes de pesar debemos asegurarnos que el fiel de
la balanza marque cero. En caso contrario, se ajustará. Las sustancias a pesar nunca se echan directamente
sobre los platillos, sino sobre papel de filtro o un vidrio de reloj, que deben encontrarse escrupulosamente
limpios y secos. Para sacar el sólido del recipiente que lo contiene utilizaremos una espátula perfectamente
limpia y seca.
Una vez pesado se pone en un vaso de precipitados con la menor cantidad posible de agua destilada (enjuagar
con agua destilada el vidrio de reloj echando este agua en el vaso). Se disuelve agitando con una varilla de
vidrio y se vierte en el matraz aforado. Enjuagamos con agua destilada el vaso y echamos este agua al matraz
aforado. Se añadirá agua con el frasco lavador hasta que el nivel haya subido casi hasta el cuello del matraz,
pero no dentro del mismo. A continuación se agita de modo que el líquido se mezcle bien. Se sigue añadiendo
agua hasta que falte como un centímetro, para la marca de enrase. Por último, con un gotero y gota a gota, el
matraz se llena de agua destilada hasta el enrase. El enrase se considera bien realizado cuando el menisco que
forma el líquido queda tangente, por encima, a la marca de enrase.
Preparación de una disolución a partir de una disolución de ácido concentrado comercial
Con un frasco lavador llenamos de agua destilada la mitad del matraz aforado. Utilizando una pipeta graduada
con un émbolo o una bureta se toma la cantidad necesaria del ácido concentrado comercial, que se vierte en el
matraz aforado. A continuación, se agita para que el líquido se mezcle bien y se vuelve a añadir agua hasta
que el nivel suba casi al cuello del matraz, pero no dentro del mismo. Se agita nuevamente para mezclar bien.
Se sigue añadiendo agua hasta que falte como un centímetro, para la marca de enrase. Por último, con un
gotero y gota a gota, el matraz se llena de agua destilada hasta el enrase. El enrase se considera bien realizado
cuando el menisco que forma el líquido queda tangente, por encima, a la marca de enrase.
Primer ejercicio
Disolución de 10 ml: Patrón colorante azul
Dilución:
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
2
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
• Cogemos 5ml de colorante azul (1/2 de 10 ml=5ml) con la pipeta. Enrasamos con agua hasta llegar a 10 ml.
Todo esto en el tubo 1.
• Ahora pasamos al tubo 2. hallamos la dilución que debemos hacer en este tubo:
1/2 * X=1/4, X=1/2
Esto quiere decir que debemos coger 5ml del tubo 1(lo hacemos de esta forma porque son diluciones
seriadas). Enrasamos con agua hasta llegar a 10 ml.
• Igual que anteriormente:
1/4 * X= 1/8 , X=1/2
Luego cogemos 1/2 del tubo 2, que son 5 ml. Enrasamos con agua hasta 10 ml.
• 1/6 = 1/8 * X, X=1/2 . Pipeteamos 5 ml del tubo 3. Enrasamos con agua hasta 10 ml
• Y finalmente cogemos 5ml del tubo 4 y lo echamos en el 5. Luego enrasamos con agua hasta 10 ml.
PRACTICA IV: DETERMINACIÓN DEL HEMATOCRITO (Microhematocrito)
Fundamento
Esta determinación se basa en la mayor densidad de los hematíes con respecto a los demás componentes de la
sangre.
Por esto cuando los hematíes sedimentan en el fondo del tubo se puede ver el volumen que éstos ocupan con
respecto al volumen total. Para acelerar el proceso de sedimentación utilizaremos una centrífuga.
Material.
• Alcohol
• Algodón
• Plastilina
• Lanceta
• Centrífuga para hematocrito
• Lector de microhematocrito o regla milimetrada
Técnica
• Marcaremos dos tubos capilares con anticoagulante (EDTA).
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• Informamos al paciente de la técnica y procedemos a desinfectar la zona a pinchar, normalmente la yema de
los dedos. También podremos coger la sangre de una muestra de sangre con anticoagulante
• Llenamos cada capilar con sangre del punto de punción o de la muestra. Llenamos las ¾ partes del capilar y
sin burbujas.
• Sellaremos los extremos por los que hemos llenado los capilares con plastilina.
• Luego los colocamos en la centrífuga con el extremo sellado hacia fuera. También hemos de colocarlos de
manera que queden equilibrados. Se centrífuga durante 5 minutos.
• Al pasar este tiempo observamos que los elementos corpusculares de la sangre están en la parte inferior del
tubo.
Resultado
Tras todo el proceso la sangre muestra un hematocrito del 43% ( 4.3. 1012 hematíes/l) cantidad que esta
dentro de los valores normales.(Mujer: 42+− 5%)
PRÁCTICA 5: VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR
Fundamento
Es la velocidad a la que sedimentan los elementos formes de la sangre, en una unidad de tiempo de una
muestra de sangre anticoagulada.
Si se coloca en un tubo con sangre anticoagulada en posición vertical y se queda en reposo, se observa que
pasado un tiempo, las células sedimentan quedando dos fases: la superior al plasma, y la inferior a las células.
La velocidad se expresa con un número que indica los mm que la columna de células ha descendido durante
un periodo de tiempo que suele ser una hora.
Material
• Pipeta de vidrio
• Pipeta de Westergreen desechable
• Soporte
• Papel para limpiar la pipeta
• Sangre entera
• Anticoagulante citrato sódico al 3,8%
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• Guantes
Técnica
• Homogeneizar la muestra
• Colocar citrato sódico (0,4ml) en un bote al 3,8%
• Añadir 1,6ml de sangre con la pipeta de vidrio y mezclarlo bien
• Colocar este tubo en el soporte y en el tubo metemos la pipeta de westergreen desechable y aspiramos con
el aspirador hasta la señal del tapón
• Dejarlo a temperatura ambiente totalmente vertical y protegerlo de la luz directa y de las vibraciones
• Dejar pasar una hora. Al cabo de este tiempo se mira cuanto han descendido los elementos formes.
Resultado
El resultado no es significativo ya que han pasado 24 horas desde q se hizo la técnica. El resultado es de 9mm
PRACTICA 6: TECNICA DEL MANEJO DEL MICROSCOPIO
Material:
• Microscopio óptico
• Papel milimetrado
• Rotuladores de colores: Rojo, Negro, Amarillo, Verde y Azul.
• Portaobjetos
Técnica:
• En el papel milimetrado dibujamos un cuadrado de 1 mm2.
• Este cuadro lo dividimos en tres partes iguales en cada lado.
• Cada cuadro secundario lo pintamos de un color; el cuadro central deberá esta coloreado de negro.
• Recortaremos el cuadro de 1 mm2 y lo pegamos en un portaobjetos con cinta celo.
• Lo situamos en el microscopio y comenzamos a observar los cuadros según la hoja inicial y a medir la
superficie de cada cuadro.
Resultados:
Objetivo de 4x:
− Diámetro: Horizontal: 131 + 0,4 =131,4 mm
Vertical: 11 + 0,5 = 11,5 mm
Objetivo de 10x:
− Diámetro: Horizontal: 132 + 0,1 =132,1 mm
Vertical: 11 + 0,4 = 11,4 mm
VERDE Horizontal: 132 + 0,1 = 132,1 mm
Vertical: 11 + 1 = 12 mm
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ROJO Horizontal: 133 + 0,3 = 133,3 mm
Vertical: 13 + 0,2 = 13,2 mm
AMARILLO Horizontal: 130 + 0,8 = 130,8 mm
Vertical: 13 + 0,3 = 13,3 mm
AZUL *Horizontal: 130 + 0,8 = 130,8 mm
*Vertical: 11 + 0,3 = 11,3 mm
NEGRO *Horizontal: 131 + 0,2 = 131,2 mm
*Vertical: 12 + 0,3 = 12,3 mm
Objetivo de 40x:
El diámetro real del campo es menor de 1 mm.
PRACTICA 7: SUSPENSION DE HEMATIES
Material:
• Tubos cónicos para centrifuga
• Pipetas Pasteur
• Varilla de vidrio
• Embudo
• Frasco lavador de plástico
• Gradillas
• Vaso de precipitado
• Espátula
• Matraz aforado con tapón
• Micro pipeta automática
• Vidrio de reloj
• Parafilm
• Balanza electrónica
• Sangre entera
• Cloruro sódico + agua destilada (suero fisiológico)
Preparación del suero fisiológico:
Preparamos una disolución de suero al 9%. Haremos 0´5 L de disolución.
Pesamos 4´5 g de NaCl en la balanza, sobre el vidrio de reloj:
100 ml −−−−−−−−−−−−−−− 9g
500 ml −−−−−−−−−−−−−−−− x , X= 4´5 g
Echamos los 4´5 g en un vaso de precipitado y mezclamos con un poco de agua destilada. Vertemos la mezcla
en un matraz aforado de 0´5 L, aclaramos el vaso de precipitado con agua, para asegurarnos que todo el soluto
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ha sido vertido al matraz. Ahora enrasamos con agua destilada. Para mayor precisión en el enrase, una vez
estemos cerca de la línea de enrase, terminaremos echando gota a gota el agua destilada hasta la línea de
enrase. Mezclamos y etiquetamos la disolución.
Técnica:
• En un tubo de ensayo, echamos una parte de sangre y 4 de suero (hay que echarlo poco a poco, ya que se
pueden romper los hematíes)
• Tapamos con parafilm el tubo de ensayo y centrifugamos 3 minutos a 3000 r.p.m para proceder al lavado de
hematíes. Una vez centrifugados los glóbulos rojos, con una pipeta pasteur desechamos el sobrenadante.
• Realizamos el lavado tantas veces como sea necesario hasta obtener un sobrenadante limpio(transparente)
• una vez conseguido, haremos una suspensión de hematíes de 5 ml al 10%
100 −−−−−−−−−−−− 5
10 −−−−−−−−−−−− x , x= 0´5 ml de GR lavados
PRACTICA 8: RECUENTO DE GR
Introducción
Los recuentos celulares sanguíneos son una determinación fundamental en hematología, los más habituales
son: recuentos de GR, GB y plaquetas, aunque también se realizan recuentos más específicos como por
ejemplo el recuento de eosinófilos y reticulocitos. También se pueden hacer recuentos en otros líquidos
biológicos como el LCR, sinovial, pleural
Cualquier método de recuento de células lleva consigo 4 fases:
• Dilución de la sangre: se puede hacer en cualquier otro liquido biológico
• Toma de un volumen determinado de sangre diluida
• Recuento de las células en ese volumen
• Cálculo matemático, para saber el numero de células por volumen
Material
• Cámara de recuento de glóbulos (Nuebauer)
• Pipeta de dilución de GR
• Papel de filtro
• Sangre entera
• Liquido diluyente (Hayem)
• Tubo aspirador
• Cubreobjetos
• Microscopio
Técnica
• Homogeneizar la muestra de sangre
• Montar la cámara con su correspondiente cubreobjetos
• Mediante el tubo aspirador y la pipeta de dilución, cogemos sangre hasta la señal de 0,5 con la pipeta de
glóbulos rojos.
• Se limpiará por fuera la pipeta, a continuación, se coge el liquido diluyente (liquido de Hayem) y se
enrasará hasta la marca de 101.
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• Homogeneizamos el contenido del bulbo sujetando la pipeta con el dedo índice y pulgar, y agitamos
suavemente durante 2 ó 3 minutos.
• Antes de llenar la cámara hay que desechar las 3 ó 4 primeras gotas que corresponden al capilar inferior, ya
que es líquido diluyente.
• Llenada la cámara, dejamos que por capilaridad se llene la cuadricula, evitando la formación de burbujas y
rebosamiento de la muestra fuera de los bordes.
• Una vez llenada la cámara, dejamos reposar 3 ó 4 minutos para que sedimenten las células.
• Una vez que hayan sedimentado, nos vamos al microscopio, enfocamos el retículo de la cámara con el
objetivo de 10x, para comprobar la distribución homogénea de la muestra.
• Si está distribuido bien, pasamos al objetivo de 40x y empezamos a contar las células
• Una vez contadas las células se realizan los cálculos pertinentes para saber el número de células totales que
hay en la cámara de Nuebauer.
Cálculos
Nº células /mm3 = Nº células contadas x Corrección del volumen x Corrección de la dilución
Numero de células contadas ! 45+ 70+ 42+ 53+ 67= 277
277 * 1/0,02 * 200= 2.770.000 GR
Interpretación resultados
Valores normales: 4,5 *10^12/L
En nuestro caso, al utilizar sangre envejecida no sale un resultado correcto
PRACTICA 9: RECUENTO GLOBULOS BLANCOS
Material
• Cámara de recuento (Nuebauer)
• Pipeta de dilución de glóbulos blancos
• Papel de filtro
• Sangre entera
• Liquido diluyente (Trk)
• Tubo aspirador
• Cubreobjetos
• Microscopio
Técnica
• Homogenizar la muestra de sangre
• Montar la cámara con su correspondiente cubreobjetos
• Mediante el tubo aspirador y la pipeta de dilución, cogemos sangre hasta la señal de 0,5.
• Se limpia por fuera la pipeta, se coge el liquido de Trk y se enrasa hasta 11
• Homogeneizamos el contenido del bulbo sujetando la pipeta con el dedo índice y pulgar, y agitamos
suavemente durante 2 ó 3 minutos
• Antes de llenar la cámara hay que desechar las 3 ó 4 primeras gotas que corresponden al capilar inferior, ya
que es líquido diluyente.
• Llenada la cámara, dejamos que por capilaridad se llene la cuadricula.
• Una vez llenada la cámara, dejamos reposar 3 ó 4 minutos para que sedimenten las células.
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• Una vez sedimentadas, nos vamos al microscopio, enfocamos el retículo de la cámara con el objetivo de
10x, para comprobar la distribución homogénea de la muestra.
• Si está bien distribuido, pasamos al objetivo de 40x y empezamos a contar las células
• Una vez contadas las células se realizan los cálculos necesarios para saber el número total de células.
PRACTICA 10: FROTIS SANGUINEO
Fundamento
La práctica de un frotis sanguíneo también llamado extensión es de gran importancia en hematología ya que el
diagnóstico de muchas enfermedades hematológicas puede realizarse con solo observar las características
morfológicas de las células sanguíneas Debido a ello la técnica de realización del frotis tiene que ser
impecable procurando que este no sea excesivamente fino ni excesivamente grueso. Con ello se conseguirá
una distribución adecuada de las células en las diferentes áreas del frotis cuyo conocimiento es fundamental
tanto para la observación de la morfología eritrocitaria como para la realización de la fórmula leucocitaria o
recuento diferencial de leucocitos.
Existen 3 procedimientos para realizar el frotis sanguíneo:
• Método de los 2 portaobjetos o portas
• Método de los 2 cubreobjetos
• Método automático mediante extensor de frotis por centrifugación.
En cualquiera de estos métodos se tendrán en cuenta las siguientes precauciones:
1− Todo el material que hay que utilizar tiene que estar escrupulosamente limpios y desengrasados.
2·− Si se parte de punción digital no se debe utilizar nunca la primera gota.
3·− Si se parte de punción venosa el frotis deberá hacerse con la máxima rapidez posible con sangre no tratada
con anticoagulante. En caso de tenerlo que realizar con anticoagulante será el EDTA potásico, debido a su
escasa acción sobre la morfología de las células sanguíneas. El frotis debe ser realizado siempre dentro de las
2 primeras horas de practicada la extracción ya que si no es así el efecto del anticoagulante sobre los
leucocitos producen hinchamiento nuclear con falso aumento del número de neutrófilos no segmentados,
vacuolización citoplasmática y aparición de diversos artefactos.
En las extensiones de sangre sobre portas diferenciamos una cabeza, un cuerpo y una cola:
• la cabeza es la línea en la cual hemos apoyado un portaobjetos sobre todo antes de hacer la extensión.
Es una zona excesivamente gruesa y en ella se aprecia un aumento de los linfocitos.
• El cuerpo representa la mayor parte de la extensión, corresponde a al región intermedia del frotis y en
ella existe un reparto equilibrado de las células. Es la zona ideal para hacer el recuento diferencial.
• La cola es una excesivamente fina. Corresponde al final de la extensión y termina con un área donde
las células adoptan una disposición acordonada que se conoce como flecos o barbas. En esta región
existe un exceso de granulocitos y monocitos.
Limpieza del material: los portas sucios pueden limpiarse sumergiéndolos durante 24 horas en mezcla
crómico (100 gr. de dicromato potásico disuelto en 750 ml de agua a la cual se le ha añadido con cuidado 250
ml de sulfúrico concentrado) trascurrido este tiempo se lavan los portas con agua corriente y se enjuagan con
agua destilada y se guardan en alcohol del 95% o en una mezcla de alcohol−éter. Antes de utilizarlos se secan
y se frotan con un paño limpio
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Material
1) Porta objetos
2) Alcohol
3) Sangre entera
4) Porta extensor
5) Pipetas pasteur
Técnica de los dos portas
Para conseguir una buena extensión de sangre es imprescindible utilizar portaobjetos limpios, secos y
desengrasados. Estos portas se utilizan siempre cogiéndolos por los bordes
1. Poner un portaobjetos limpio y seco sobre una superficie horizontal
2. Depositar una gota de sangre de 5 microlitros de no más de 3mm de diámetro. La gota se sitúa sobre la
línea central del porta aproximadamente a 1cm de uno de sus extremos. Este portaobjetos se sitúa con la gota
a la derecha y se sujeta por el extremo opuesto con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda.
3. Para extender la sangre se utiliza otro portaobjeto esmerilado que sujetándolo con la mano derecha se sitúa
delante de la gota de sangre de forma que los dos portaobjetos formen un ángulo entre 30º y 45º y desplazarlo
suavemente hacia atrás hasta que alcance la gota de sangre.
4. Esperar a que por capilaridad se distribuya uniformemente deslizar suavemente y a velocidad moderada un
porta sobre otro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie
del primer portaobjetos. El grosor del frotis sanguíneo puede variar según sea el ángulo que formen entre sí
ambos portas. Así, si es superior de 45º la extensión obtenida será gruesa y corta. Por lo contrario, si el ángulo
es muy pequeño será largo y fijo.
5. El secado del frotis se hará a temperatura ambiente y en posición horizontal
PRACTICA 11: TINCIÓN RÁPIDA O PANÓPTICO RÁPIDO
Material
• Extensión sanguínea secada y rotulada.
• Reactivos: Fijador (azul claro), colorante ácido (rojo eosina), colorante básico (azul de metileno).
• Pinzas de madera.
• Frasco lavador con agua destilada.
Técnica
• Colocar el porta con la extensión sanguínea en la pinza de madera (para evitar mancharnos con los
colorantes).
• Sumergir la extensión cinco veces en el bote que contiene el fijador.
• Sumergir cinco veces la extensión en colorante ácido.
• Sumergir cinco veces la extensión en el colorante ácido.
• Lavamos la extensión teñida con agua destilada.
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• Secamos la extensión teñida al aire.
• Se observa al microscopio.
PRACTICA 12: TINCION DE GIEMSA
Material
• Extensión sanguínea secada y rotulada.
• Cristalizador.
• Varillas paralelas.
• Reactivos: Solución de Giemsa y metanol.
• Pipeta pasteur.
• Cronometro.
• Frasco lavador con agua destilada.
Técnica
• Poner agua en el fondo del cristalizador para que los colorantes no se peguen al fondo.
• Colocar las varillas paralelas sobre el cristalizador.
• Colocar sobre las varillas la extensión.
• Cubrir la extensión con metanol y esperar de cuatro a cinco minutos.
• Decantar para eliminar el metanol.
• Cubrir la extensión con solución de Giemsa y dejar actuar durante veinticinco minutos (una gota de Giemsa
por cada nueve de agua destilada)
• Lavar la extensión con agua destilada hasta eliminar los restos del colorante.
• Secar al aire.
• Observar al microscopio para comprobar la calidad de la tinción.
PRÁCTICA 13: TINCIÓN DE MAY− GRUNWALD
Material
• Extensión sanguínea secada y rotulada.
• Cristalizador.
• Varillas paralelas.
• Reactivos: Solución de metanol de eosina y azul de metileno.
• Pipeta pasteur.
• Cronometro.
• frasco lavador con agua destilada
Técnica
• Poner agua en el fondo del cristalizador para que los colorantes no se peguen al fondo.
• Colocar las varillas paralelas sobre el cristalizador.
• Colocar sobre las varillas la extensión.
• Cubrir la extensión con un volumen conocido de solución de May−Grünwald y dejar actuar tres minutos.
• Añadir el mismo volumen de agua destilada y soplar ligeramente con la pipeta para homogeneizar, dejar
actuar entre ocho y diez minutos.
• Lavar la extensión con agua destilada hasta eliminar los restos del colorante.
• Secar al aire.
30 . Observar al microscopio para comprobar la calidad de la tinción
11
PRÁCTICA 14: TINCION DE MAY− GRUNWALD− GIEMSA
Material
• Extensión sanguínea secada y rotulada.
• Cristalizador.
• Varillas paralelas.
• Reactivos: May−Grünwald y Giemsa.
• Pipeta pasteur.
• Cronometro.
29. Frasco lavador con agua destilada
Técnica
• Poner agua en el fondo del cristalizador para que los colorantes no se peguen al fondo.
• Colocar las varillas paralelas sobre el cristalizador.
• Colocar sobre las varillas la extensión.
• Cubrir la extensión con un volumen conocido de solución de May−Grünwald y dejar actuar dos minutos.
• Añadir el mismo volumen de agua destilada y soplar ligeramente con la pipeta para homogeneizar, dejar
actuar entre dos y tres minutos.
• Decantar.
• Cubrir con colorante Giemsa recién diluido y dejar actuar veinte minutos.
• Lavar con agua destilada.
• Secar.
• Observar al microscopio.
PRACTICA 15: TINCION DE WRIGHT
Material
• Extensión sanguínea secada y rotulada.
• Cristalizador.
• Varillas paralelas.
• Reactivos: colorante de Wright
• Cronometro.
• Frasco lavador con agua destilada.
Técnica
• Poner agua en el fondo del cristalizador para que los colorantes no se peguen al fondo.
• Colocar las varillas paralelas sobre el cristalizador.
• Colocar sobre las varillas la extensión.
• Cubrir la extensión con un volumen conocido de solución de Wright y dejar actuar durante un minuto.
• Añadir el mismo volumen de agua destilada y soplando ligeramente con la pipeta.
• Dejar actuar durante tres o cuatro minutos.
• Lavar con agua destilada.
• Secar.
• Observar al microscopio.
PRACTICA 16: FORMULA LEUCOCITARIA
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Material
• Muestra: Sangre venosa o capilar.
• Microscopio.
• Registrador de células
Técnica
• Realizar una extensión de sangre, fijada y teñida preferentemente con May−Gründwald−Giemsa.
• Observar la extensión con el objetivo de 10 x y seleccionar una zona del cuerpo de la extensión en que las
células estén bien distinguidas.
• Cambiar al objetivo de 100 x.
• Observar la zona de la extensión elegida y anotar cada uno de los leucocitos observando hasta un total de
100.
• No repetir los campos de la observación para no repetir dos veces la misma célula.
También se anotan todas las células que se encuentren en sangre periférica y que no suelen estar presentes.
Todas estas anotaciones se realizan mediante contadores automáticos, aunque se pueden realizar
manualmente.
PRACTICA 17: TINCION DE RETICULOCITOS
Material
• Sangre total anticoagulada.
• Tubo de hemólisis.
• Pipeta pasteur.
• Portaobjetos (normales, biselados y esmerilados)
• Colorante azul cresil brillante (1g.)
• Suero fisiológico cantidad suficiente para 100 ml.
• Microscopio.
• Parafilm.
Técnica
• En un tubo de hemólisis se mezclan entre tres y cinco gotas de sangre con otras tantas de colorantes
(proporción mitad−mitad)
• Se mezcla suavemente con papel parafilm y se deja en reposo a temperatura ambiente durante quince
minutos o se pone al baño María a treinta y siete grados cinco minutos.
• Se vuelve a homogeneizar la muestra.
• Posteriormente realizamos la extensión.
• Se seca y lo llevamos al microscopio.
• en el microscopio con el objetivo de 40x, se localiza una zona de la extensión donde los glóbulos rojos
estén bien distribuidos.
• Cambiamos al objetivo de 100x y localizamos una zona en la que el número de glóbulos rojos por campo
sea 100.
• Entonces se encuentran los reticulocitos en diez campos.
• Con el colorante los glóbulos rojos se ven de color azul−verdoso y el ARN azul.
Valores normales
13
0,5 − 1,5 %
En niños un poco más alto.
Disminución de reticulocitos: Reticulopenia
Aumento de reticulocitos: Reticulocitosis
Cálculos
nº reticulocitos
Reticulocito = −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− = %
10
nº reticulocito contado
Reticulocito = −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− x 100
nº GR. contado
Reticulocito contado __________________ GR. contado
X ___________________ 100
PRACTICA 19: METODO DE LA CIANOMETAHEMOGLOBINA
Material
• Sangre capilar o sangre venosa anticoagulada con edta o heparina.
• Tubos de ensayo.
• Cubetas.
• Espectrofotómetro.
• Pipetas automáticas de 20 µl.
• Pipetas de 3 ml.
• Prepipeta.
• Reactivos: de drabkin y patrón de Hb.
Preparación del reactivo de drabkin:
• 0,5 de hemoglobina con 24,5 de agua destilada, en un matraz enrollado con papel albal.
Técnica
• Conectar el espectrofotómetro.
• Rotular 3 tubos de ensayo: blanco, patrón y muestra.
• En cada tubo añadimos 5 ml. del reactivo de drabkin.
• Añadir 20 µl. de muestra en el tubo M.
• Añadir 20 µl. de patrón en el tubo P.
• Dejar reposar 5min. a temperatura ambiente, para que se forme la cianometahemoglobina.
• Pasado este tiempo, metemos el contenido de cada tubo en la cubeta de la muestra.
14
• Colocamos las cubetas en el espectrofotómetro, en el orden: B, P y M.
• Ponemos el espectrofotómetro para que nos mida la A a 540 nm.
• Presionamos MODE y seleccionamos la T%.
• Tiramos del émbolo para sacar el B y presionamos el OA.
• Tras parpadear, se pondrá en 100,00.
• Volvemos a presionar MODE para poner la A.
• Tiramos del émbolo, para que la luz atraviese el patrón, y así obtener su A 1,566.
• Tiramos de nuevo del émbolo para que la luz atraviese la muestra y leemos su A 0,725.
• Una vez realizado los pasos anteriores, abrimos la tapa, sacamos la cubeta e introducimos el émbolo.
Resultados
A muestra
Hb (g/dl) = −−−−−−−−−−−−−−− x [] de Hb Patrón;
A patrón
0.725
Hb (g/dl) = −−−−−−−−−−−−−−− x 15.3 = 7,31 g/dl.
1.566
PRACTICA 19: RESISTENCIA OSMOTICA ERITROCITARIA
Material
• Tubos de ensayo.
• Pipetas pasteur.
• Pipetas graduadas.
• Centrifuga.
• Espectrofotómetro.
• Cubetas.
• Matraz aforado.
• Vidrio.
• Balanza.
• NaCl
• Agua destilada.
• Sangre venosa fresca.
Técnica
• Se prepara una batería de 17 tubos de ensayo y se enumeran.
• Se añade una cantidad determinada de agua destilada y NaCl siguiendo la tabla.
Tubos
1
2
3
Solución
patrón (ml)
0.9%
9
8.5
8
Agua
destilada
(ml)
0
0.5
1
[]NaCl
0.9
0.85
0.8
15
4
7.5
1.5
0.75
5
7
2
0.7
6
6.5
2.5
0.65
7
6
3
0.6
8
5.5
3.5
0.55
9
5
4
0.5
10
4.5
4.5
0.45 ...
• Se añade 50 µl, a cada uno de los tubos, de sangre.
• Dejar a temperatura ambiente durante una hora.
• Centrifugar a 2500−3000 r.p.m. durante 5 min.
• Recoger el sobrenadante de cada tubo con una pipeta pasteur y los pasamos a tubos limpios debidamente
rotulados.
• Leer la absorbancia de cada uno de los sobrenadantes a 540nm.
• La lectura se realiza con una misma cubeta utilizando la cubeta nº 1 como blanco y leyendo el resto de
forma ordenada.
• Se halla el porcentaje de hemólisis utilizando los resultados de la absorbancia.
A tubo x
% hemólisis = −−−−−−−−−−−−−−
A tubo 1
• Una vez obtenidos todos los resultados, realizamos una gráfica. Sobre la gráfica se determina el valor de
NaCl para el que le corresponda una hemólisis del 50%. H50.
PRACTICA 20: DETERMINACION DEL GRUPO SANGUINEO EN PLACA O PORTA
Fundamento
Los Ags del sistema ABO que tengan los GR de la muestra, reaccionan con los Ac específicos de los sueros
usados como reactivos. La reacción Ag− Ac producida se pone de manifiesto por la aglutinación de los
hematíes.
Material
• Placa o porta.
• Pipeta pasteur.
• Palillos.
• Visualizador luminoso.
• Reactivo suero Anti A y Anti B.
6. Muestra: Sangre venosa o capilar
Técnica
• Colocar en el porta 2 gotas de sangre separadas una de otra o bien poner una gota en un porta rotulado con
la letra A y otro con la letra B.
• A: añadir una gota de suero Anti A Azul.
B: añadir una gota de suero Anti B Amarillo.
16
• Con el palillo mover y mezclar el reactivo y la gota de sangre.
(Utilizar palillos distintos para cada muestra).
• Observar la presencia o ausencia de aglutinación.
Anti A
Anti B
G.S.
+
−
A Ag A
−
+
B Ag B
+
+
AB Ag A y Ag B
−
−
O
PRACTICA 21: DETERMINACION DEL GRUPO SANGUINEO EN TUBO
Material
• Muestra: Sangre.
• Reactivos Anti A y Anti B.
• Centrífugas.
• Tubo de centrífugas.
• Gradillas.
• Pipeta pasteur.
• Suero fisiológico
Técnica
• Preparar una suspensión de hematíes al 5%.
• Rotular dos tubos con la letra A y B respectivamente.
• Colocar en cada uno una gota de la suspensión.
• Añadir al tubo A dos gotas de Anti − A y al tubo B dos gotas de Anti − B.
• Mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 15 min.
• Centrifugar durante 2 min. a 2000 r.p.m.
• Observar si existe o no aglutinación. Para ello se agitan los tubos suavemente, intentando resuspender el
botón celular que ha quedado como sedimento tras la centrifugación.
Si hay aglutinación los glóbulos rojos no se resuspenden, sino que el botón celular se resuspende en bloque.
Cuando no hay aglutinación los glóbulos rojos se resuspenden fácilmente.
• Se comprobará al microscopio los tubos que aparenten no tener aglutinación.
Para ello se coge una gota de la suspensión, se deposita en un porta, se pone un cubre y se mira con el objetivo
de 40 X
PRACTICA 22: PRUEBA SERICA O INDIRECTA
Fundamento
Los Ac contra los Ag del sistema ABO presentes en el suero de un individuo, se identifican enfrentando el
suero a hematíes sobre los que se conocen sus Ag ABO. La reacción entre Ag− Ac se pone de manifiesto por
la aglutinación de los hematíes usados como reactivos
17
Material
• Tubos.
• Pipetas pasteur. Muestra: Sangre.
• Microscopio.
• Suspensión de hematíes A al 3−5%.
• Suspensión de hematíes B al 3−55.
• Centrífuga
• Suero fisiológico.
• Suero problema Plasma
Técnica
• Coger 2 tubos rotulados con A y B respectivamente.
• Añadir 2 gotas de suero problema a cada tubo.
• Añadir al tubo A una gota de la suspensión de hematíes y otra gota de suspensión al tubo B.
• Mezclar suavemente.
• centrifugar durante dos min. a 1500 − 2000 r.p.m.
• Sacar de la centrifuga y observar si existe aglutinación.
Resultados
Ac plasma
/ suero
Anti−B
Anti−A
Anti−B y
A
Anti−B y
A
−
+
+
−
Grupo
sanguíneo
A
B
−
−
AB
−
+
0
Ag A Ag B
PRACTICA 23: DETERMINACION DEL RH
Fundamento
Si los hematíes de la muestra tienen antígeno D, este reacciona con los Ac específicos del suero anti− D usado
como reactivo. La reacción Ag− Ac se pondrá de manifiesto con la ausencia o presencia de aglutinación.
Material
• Portaobjetos
• Palillos
• Reactivos: suero anti−D y sangre entera
• Pipeta pasteur.
• Visualizador luminoso.
Técnica
• Depositar una gota de anti−D sobre un porta limpio y rotulado.
• Poner una gota de sangre sobre el mismo porta.
• Mezclar el reactivo y la sangre con un palillo.
18
• Mover el porta con pequeños movimientos y observar si existe aglutinación en el periodo de dos minutos.
• Si hay aglutinación, es Rh + y si no se observa aglutinación, es Rh −, pero existe una posibilidad de que sea
Rh + débil, por lo se debe de realizar la prueba de determinación del Rh + débil.
PRACTICA 24: VARIANTE DEL Du O Rh + DÉBIL
Fundamento
Bajo el termino Du se engloban todos los Ag D o Rh + débiles. Se manifiestan por una reacción dudosa sobre
portas o tubos.
En el laboratorio la investigación del Ag Du se lleva a cabo mediante una prueba de Coombs indirecta o bien
mediante enzimas.
Se aconseja la determinación de los Rh débiles en los siguientes casos:
• en la mujer embarazada y el RN de madre Rh −
• en los centros de transfusión al determinar el Rh de los donantes
Esta reacción puede hacerse visible añadiendo antiglobulina humana, después de que se haya producido la
reacción Ag− Ac entre el Du de los hematíes problema y el suero anti− D usado como reactivo.
Material
• Tubo de ensayo.
• Reactivos: suero anti−D.
• Suspensión de hematíes 3−5%.
• Centrifuga.
• Pipetas Pasteur.
• Sangre de Rh −.
Técnica
• Colocar en un tubo de ensayo rotulado dos gotas de suero anti−D.
• Añadir dos gotas de suspensión de hematíes.
• Mezclar e incubar a 37ºC durante 30 min.
• Sacar y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 2 min.
• Resuspender el botón celular.
• Si hay aglutinación, Rh +, y si no hay deberemos de continuar.
• Lavar los hematíes tres veces con solución salina y en el ultimo lavado, se debe de decantar por completo el
sobrenadante.
• Añadir dos gotas de suero de COOMBS (suero anti−G humana) y mezclar.
• Centrifugar durante 2 min. a 2000 r.p.m.
• Resuspender el botón celular y observar si existe o no aglutinación.
Resultados
Si existe aglutinación: Du + o Rh + débil.
Si no existe aglutinación: Rh −.
PRACTICA 25: PRUEBA DE COOMBS O PRUEBA DIRECTA
19
Fundamento
La prueba directa detecta Ac ya fijados a los hematíes y para ello se enfrentan los hematíes del pte con
antiglobulina. Se utiliza para detectar la enfermedad hemolítica del recién nacido y para otras anemias
hemolíticas
El suero de Coombs puede ser de dos clases: poliespecífico, si esta dirigido contra la Ig G y el componente
C3d del complemento, y monoespecifico, si solo esta dirigido contra la Ig G y algunos de los componentes del
complemento.
Material
• Gradilla.
• Centrifuga.
• Tubos de ensayo.
• Suero fisiológico.
• Pipetas Pasteur.
• Suero coombs
• Suspensión de hematíes problema
Técnica
• Preparar una suspensión al 5% en solución salina.
• Colocar 1 gota de suero de coombs en 1 tubo.
• Añadir 1 − 2 gotas de la suspensión.
• Mezclar y centrifugar 1−2 min. a 2000 r.p.m.
• Sacar de la centrifugadora y resuspender el botón celular y observar si hay o no aglutinación.
Si hay aglutinación, hay Ac incompletos
PRACTICA 26: PRUEBA INDIRECTA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA O TEST DE
COOMBS INDIRECTO
Fundamento
Se pretende detectar generalmente la presencia en el suero del enfermo de Ac incompletos libres.
Se incuba el suero del paciente con unos hematíes tipo (GR que no tienen adheridos a su superficie ningún
tipo de Ig y ningún componente del complemento)
La finalidad de esta incubación consiste en lograr una sensibilización in Vitro de los hematíes tipo por parte
de los Ac incompletos que pueden estar contenidos en el suero problema. Los hematíes tipo que se suelen
utilizar con los 0+.
Material
• Gradilla.
• Centrifuga.
• Tubos de ensayo.
• Solución salina.
• Pipetas Pasteur.
• Suero coombs.
20
• Suspensión de hematíes al 5%
Técnica
• Preparar una suspensión de hematíes tipo al 5% en solución salina.
• Colocar en 1 tubo 2 gotas de los hematíes tipo y 2 gotas de suero problema.
• Mezclar e incubar a 37ºC durante 30 min.
• Lavar 3 veces el producto incubado en solución salina.
• Tras el último lavado resuspender el sedimento de hematíes.
• Añadir 2 gotas del suero coombs.
• Mezclar bien y centrifugar a 2000 r.p.m. 1−2 min.
• Agitar el tubo y observar si hay o no aglutinación.
Resultados
Si existe aglutinación tiene Ac − incompletos.
Si no existe aglutinación no tiene Ac − incompletos
PRACTICA 27: FACTOR REUMATOIDE
Fundamento
Los factores reumatoideos son un grupo de Ac tipo Ig M (aunque también se ha descrito la presencia de Ig G e
Ig A) que reaccionan contra el fragmento Fc de las moléculas de Ig G.
Los FR aparecen principalmente en el suero de ptes con artritis reumatoide pero también otras enfermedades
pueden producir FR: procesos inflamatorios crónicos, enfermedades infecciosas como endocarditis bacteriana
subaguda, malaria, sífilis, lepra, tuberculosis y variedad de enfermedades autoinmunes como el LES.
Material
• Plasma.
• Pipeta 50 µl.
• Punta de pipeta.
• Gradilla.
• Reactivo.
• Controles Azul − y Rojo +.
Técnica
• Cogemos 4 botes de suero problema.
• Ponemos en la plantilla 1 gota de cada suero, en un círculo de 1 a 4.
3. En el 5 y en el 6 ponemos en uno el y en el otro
• Añadimos el reactivo 1 gota en cada círculo y agitamos 2 min. con la mano.
• Observar si hay aglutinación.(en este caso no existe aglutinación, pero seguiré detallando el proceso en caso
de tener resultado positivo)
• En el no aparece, en el si aparece. Esto se hace para comprobar si el reactivo está bien.
• En el círculo que nos haya salido aglutinación, significa que tiene F.R., cogemos esa sangre y realizamos
21
diluciones seriadas.
• ½ Tubo 1: Echamos 200 µl suero y 200 µl.
¼ Tubo 2: Echamos del anterior 100 µl suero y 100 µl s.f..
1/8 Tubo 3: Echamos del anterior 100 µl suero y 100 µl s.f.
1/16 Tubo 4: Echamos del anterior 100 µl suero y 100 µl s.f.
• Se colocan 1 gota de cada tubo en la plantilla y se añade el reactivo.
• En el primer círculo de la plantilla da aglutinación, mientras que en los demás no.
Resultados
Resultados positivos: la presencia de aglutinación indica una concentración de FR en el suero "30 UI/mL. Los
suero positivos pueden titularse (en este caso hemos hecho diluciones seriadas)
Resultados negativos: la ausencia de aglutinación indica un contenido de FR en el suero de "30 UI/mL
PRACTICA 28: PRUEBAS CRUZADAS
Fundamento
Las pruebas cruzadas consisten en enfrentar suero y hematíes del donante con suero y hematíes del receptor,
para comprobar la existencia o no de aglutinación. Si aparece aglutinación es indicativo de la existencia de Ac
en el suero contra los hematíes. La no aglutinación indica la compatibilidad entre ambas sangres.
Las pruebas cruzadas se realizan en tres medios:
• en medio albuminoso
• con antiglobulina humana
• pruebas enzimáticas con bromelina
Objetivos
Determinar la compatibilidad sanguínea enfrentando el suero del receptor con los hematíes del donante.
Detectar los posibles Ac que se hallen fijados a la membrana de los hematíes con antiglobulina humana.
Material
• portas
• palillos
• pipetas pasteur
• tubos de centrifuga
• centrifuga
• pipetas
• prepipetas
• baño termostatado
Reactivos
22
• Anti A, Anti B y Rh
• suero fisiológico
• sangre (mínimo dos muestras diferentes)
• albúmina bovina
• antiglobulina humana
• solución de bromelina
Técnica
• Primero debemos obtener dos muestras de sangre de igual grupo sanguíneo y Rh. Para ello debemos
determinar su grupo sanguíneo y Rh, lo haremos en porta.
• Antes, debemos coger con pipetas Pasteur el suero de cada tubo de sangre. Lo depositaremos (el suero) en
tubos de centrifuga, un tubo contendrá el suero del donante y el otro el del receptor.
• Una vez separado el suero y determinado su grupo sanguíneo, haremos una suspensión de hematíes al 5%.
Para ello debemos proceder al lavado de hematíes con suero fisiológico. Una vez lavados, haremos los
cálculos necesarios para hacer la suspensión de hematíes.
100 mL suspensión −−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 5 mL hematíes lavados
10 mL −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− x
X= 0,2 mL hematíes lavados
9,8 mL suero fisiológico
4. Se hará una suspensión por cada tubo de sangre, es decir, suspensión del donante y suspensión del receptor.
5. Una vez hechas las suspensiones, realizaremos la prueba en cada uno de los medios antes indicados
A) Prueba cruzada en medio albuminoso
En las pruebas en tubo se hace la prueba mayor y menor a la vez.
• Rotular 4 tubos de hemólisis como M, Cr, m, Cd (mayor, control receptor, menor y control donante)
• Poner en cada tubo las suspensiones y los sueros según el cuadro:
M
2gotas
Suero receptor
Suero donante
Albúmina al
2gotas
30%
Suspensión
5hematíes
receptor
Suspensión 5%
hematíes
2gotas
donante
Cr
2gotas
m
Cd
2gotas
2gotas
2gotas
2gotas
2gotas
2gotas
2gotas
2gotas
• Mezclar e incubar 10 minutos a 37ºC
• centrifugar 2 minutos a 2000 rpm
23
• comprobar si existe aglutinación o hemólisis. En este caso no hay signos de aglutinación macroscópica ni
microscópica. Esto significa que hay compatibilidad entre el donante y el receptor
B) Prueba cruzada con Antiglobulina Humana
1. Rotular los 4 tubos como en la prueba anterior
2. Poner en cada tubo las suspensiones y los sueros según el cuadro:
Suero receptor
Suero donante
Suspensión 5%
receptor
Suspensión 5%
donante
M
2 gotas
Cr
2 gotas
2 gotas
m
Cd
2gotas
2 gotas
2 gotas
2 gotas
2 gotas
3 Mezclar y centrifugar dos minutos a 2000rpm
• comprobar si existe o no aglutinación. Si hay, indica incompatibilidad. En este caso no existe aglutinación,
por lo cual continuaremos con la prueba.
• incubar 15 minutos a 37ºC
• lavar los hematíes 3veces, desechando el sobrenadante
• añadir dos gotas de antiglubulina humana a cada tubo
• mezclar y centrifugar 2 minutos a 2000 rpm
• observar si hay aglutinación. En este caso no la hay, indica compatibilidad.
C) Prueba enzimática con Bromelina
1. Rotular 4 tubos de hemólisis como M, Cr, m, Cd (mayor, control receptor, menor y control donante)
2. Poner en cada tubo las suspensiones y los sueros según el cuadro
Suero receptor
Suero donante
Bromelina
Suspensión
receptor
Suspensión
donante
M
1
1
Cr
1
m
Cd
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3. mezclar e incubar a temperatura ambiente 5 minutos
4. Centrifugar 2 minutos a 2000rpm
5. Comprobar si existe aglutinación. En este caso no hay. Son compatibles.
Interpretación
24
La aparición de hemólisis o aglutinación en las pruebas, en cualquiera de los medios, indica incompatibilidad
de las sangres. La aglutinación aparecerá en uno u otro medio, dependiendo del tipo de Ac causante de la
incompatibilidad.
La aglutinación en un control indica la existencia de autoanticuerpos en la sangre del receptor o del donante,
según el tubo control en el que aparezca.
PRACTICA 29: PRUEBAS QUE ESTUDIAN LA COAGULACIÓN MÉTODO DE SABRAZES
Material
1. Capilares sin Acg
2. Lancetas
3. Cronómetro
4. Sangre entera capilar o venosa.
Técnica: Punción capilar
• Se hace una incisión en el dedo y se pone en marcha el cronómetro cuando empiece a fluir sangre.
• Llenamos 2/3 del capilar.
• Se deja en reposo durante 3 min. a partir de los cuales se invierte de un extremo a otro cada 30 seg.
• Cuando la sangre deje de desplazarse de un lado a otro se para el cronómetro.
• Medimos el tiempo y este será el tiempo de coagulación.
Resultados
Valores normales: 3 − 6 min.
Técnica: Punción venosa
1. Se extrae la sangre venosa y en cuanto entre sangre en la jeringa se pone en marcha el cronómetro.
2. Llenar un capilar a partir de la jeringa.
3. Se deja en reposo durante 3 min., a partir de los cuales se invierte de un extremo a otro cada 30 seg.
4. Cuando la sangre deje de desplazarse de un lado a otro se para el cronómetro.
5. Medimos el tiempo y este será el tiempo de coagulación.
Resultados:
Valores normales: 3 − 6 min.
PRÁCTICA 30: TEST DE HOWELL
Material:
• 2 tubos de hemólisis.
25
• Pipetas 0'1 ml. (100 microlitos).
• Baño a 37ºC.
• Cronómetro.
• Plasma control normal.
• Cl2Ca 0'025 M.
• PRP
Técnica:
1. Atemperar los reactivos y las muestras a 37ºC. durante 10−15 min.
• Roturar un tubo con la letra M y otro con la letra C control.?
• Añadir 0'1 ml. de prp M y 0'1 ml. de control.
• Añadir a cada tubo 0'1 ml. de Cl2Ca 0'025 M y poner en marcha el cronómetro.
• Inclinar los tubos M y C hacia delante y hacia atrás cada segundo aproximadamente.
• Parar el cronómetro cuando exista un enturbiamiento o solidificación del plasma se ha producido
coagulación.
PRACTICA 31: TIEMPO DE TROMBROPLASTINA PARCIAL ACTIVADA
Introducción
El Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada es una prueba que mide la funcionalidad de las vías intrínseca
y común de la cascada de la coagulación. El organismo utiliza la cascada de la coagulación para producir
coágulos sanguíneos que permiten reparar las lesiones producidas sobre los vasos sanguíneos y los tejidos;
también para prevenir pérdidas adicionales de sangre, y para dar a las áreas lesionadas tiempo suficiente para
cicatrizar. La cascada consiste en un grupo de factores de la coagulación. Estas proteínas se activan de manera
secuencial juntamente a la vía extrínseca (relacionada con los tejidos) o bien juntamente a la vía intrínseca
(relacionada con los vasos sanguíneos). Las ramas de ambas vías confluyen en la vía común, y completan su
tarea formando un coágulo sanguíneo estable. Cuando una persona empieza a sangrar, estas tres vías han de
actuar conjuntamente.
Cada componente de la cascada de la coagulación debe funcionar correctamente y estar presente en cantidad
suficiente para asegurar la formación de un coágulo sanguíneo normal. Si existe un déficit adquirido o
hereditario de uno o más factores, o si los factores funcionan anormalmente, entonces estará inhibida la
formación de un coágulo estable y se podrá producir un sangrado o bien una coagulación excesiva.
La prueba TTPa mide el tiempo (en segundos) que transcurre hasta que se produce el coágulo cuando, en el
tubo de ensayo, se añade ciertos reactivos al plasma (porción líquida de la sangre).
Objetivo
La incubación del plasma con cantidades optimas de fosfolípidos y un activador de superficie conduce a una
activación de los factores del sistema endógeno de la coagulación. Mediante la agregación de iones de calcio
se desencadena el proceso de coagulación, se mide el tiempo transcurrido hasta la formación de un coagulo de
fibrina
Material
• Cl2Ca 0,025 M
• Cefalina activada
• Plasma control
26
• Citrato sódico
• Coagulómetro
• Baño termostatado
• Gradilla
• Tubo ensayo
• Cronometro
• Centrifuga
Técnica (puede hacerse manual o automático)
• Preparar el plasma citratado: mezclar 1 parte de solución de citrato sódico (0,4 mL) con 9 partes de sangre
(3,6 mL), centrifugar 10 minutos a 2500 rpm.
• Una vez obtenido el plasma citratado procedemos a realizar la prueba:
• Automática
• Echamos 100 µL de plasma citratado (en un recipiente del Coagulómetro) junto a 100µL de cefalina
activada, incubamos en el aparato 2minutos a 37ºC.
• Después echamos 100 µL de cloruro cálcico, y el coagulometro empieza a cronometrar el tiempo de
coagulación.
Tiempo: 28, 7 segundos
• Manual
• en un tubo de ensayo precalentado a 37ºC pipeteamos 100µL de plasma citratado, 100 µL de cefalina
activada, incubamos en el baño a 37ºC 2 minutos. Cuando echemos el cloruro cálcico ponemos en
marcha el cronometro, y medimos hasta que aparezcan signos de coagulación.
Tiempo: 1minuto 26 segundos
Interpretación de los resultados
Valores normales de TTPa pueden indicar una función normal de la coagulación; sin embargo, no puede
descartarse algún déficit aislado de algún factor. Si este fuera el caso, es posible que no quede reflejado en el
TTPa hasta que la disminución sea del 30 al 40% del valor normal. Puede suceder que existan anticoagulantes
lúpicos que interfieran en la prueba. Si se sospechara de un anticoagulante lúpico (AL), se puede utilizar una
prueba TTPa sensible al AL para ponerlo de manifiesto.
Un TTPa prolongado significa que la coagulación tarda más en producirse de lo esperado y puede ser debido a
múltiples razones (ver tabla). A menudo sugiere que puede existir un déficit de un factor de la coagulación o
un inhibidor específico o inespecífico que interfiere en la capacidad del organismo para formar coágulos. Las
deficiencias de los factores de la coagulación pueden ser hereditarias o adquiridas. Muchos factores son
Vitamina K dependientes. Si una persona sufre, por ejemplo, una enfermedad hepática, o más raramente un
déficit de vitamina K, es posible que presente un déficit de uno o más factores. Las deficiencias hereditarias
de factores de coagulación pueden afectar a la cantidad y/o la función del factor implicado.
Los inhibidores pueden ser anticuerpos que atacan específicamente ciertos factores de la coagulación, como
sucede con los anticuerpos anti−Factor VIII, o bien pueden ser inhibidores específicos como el anticoagulante
lúpico o los anticuerpos anticardiolipina que se unen a moléculas conocidas como fosfolípidos presentes en la
superficie de las plaquetas. Puesto que los fosfolípidos participan en el proceso de la coagulación, y dado que
los reactivos (productos químicos para realizar las pruebas) utilizados en la prueba TTPa contienen
fosfolípidos, estos anticuerpos pueden prolongar el TTPa, aunque normalmente se asocien más bien a
27
trombosis que a sangrados.
La administración de heparina también causa una prolongación del TTPa, tanto si la heparina está presente en
la muestra debido a un tratamiento anticoagulante como si es debido a una contaminación. La heparina es un
medicamento que se administra por vía intravenosa (IV) o por inyección (subcutánea) para prevenir y para
tratar los tromboembolismos (coágulos que bloquean los vasos sanguíneos). Cuando se administra a dosis
terapéuticas debe monitorizarse (si hay demasiada heparina, el paciente sangrará excesivamente; si hay poca,
el paciente seguirá formando coágulos). El TTPa se utiliza para monitorizar el tratamiento con heparina y
ocasionalmente para monitorizar el tratamiento con otros anticoagulantes como la bivalirudina, o el
argatroban.
El TTPa puede estar disminuido si el Factor VIII de la coagulación está elevado. Esto puede acontecer durante
una reacción de fase aguda, una situación originada por una inflamación tisular aguda o por un traumatismo.
Esta condición suele suponer un cambio temporal que no necesita ser monitorizado con el TTPa. Cuando se
resuelve la causa de la reacción de fase aguda, el TTPa vuelve a sus valores normales.
A continuación se indican las condiciones que pueden llevar a TTPa prolongados:
• Problemas preanalíticos. Pueden ser debidos a:
♦ Muestra insuficiente. La sangre obtenida ha de ser en cantidad suficiente. La relación entre
anticoagulante y sangre ha de ser de 1 a 9 (10% del total de la muestra).
♦ Pacientes con valores de hematocrito elevados o disminuidos pueden tener un TTPa alterado.
♦ Contaminación por heparina. Este constituye el problema más común, especialmente cuando
se ha obtenido la sangre a partir de una vía intravenosa, que con la finalidad de que no se
obture, se va limpiando con heparina.
♦ Muestras de sangre coagulada. El proceso de la coagulación va consumiendo algunos de los
factores.
• Deficiencias adquiridas o hereditarias de factores de la coagulación. Algunas deficiencias originan
sangrados, otras −factores de contacto− prolongan el TTPa in vitro pero no causan sangrados y por
ello presentan poco significado clínico. Los TTPa debidos a deficiencias de factores suelen corregirse
después de mezclarlos con plasma normal.
• Un inhibidor inespecífico como el anticoagulante lúpico (AL). Si el AL prolonga el TTPa o el TTPa
sensible al AL, no se normalizará al mezclarlo con plasma normal pero sí que se corregirá si se añade
a la muestra un exceso de fosfolípido.
• Un inhibidor específico. Aunque relativamente poco frecuentes, se trata de anticuerpos que atacan a
un factor en particular. Pueden aparecer en individuos con trastornos de la coagulación que reciben
tratamiento sustitutivo con algún factor (como el Factor VIII utilizado para tratar la hemofilia A) o
bien espontáneamente como autoanticuerpos. El inhibidor específico prolongará el TTPa y no se
normalizará al mezclarlo con plasma normal.
• Tratamiento anticoagulante con heparina (el TTPa que se desea alcanzar suele ser entre 1.5 y 2.5
veces mayor que el nivel previo al tratamiento).
Tratamiento con Sintrom® (acenocumarol). El TTPa no se utiliza para monitorizar este tipo de
tratamiento pero puede verse afectado por el mismo.
• Pueden observarse niveles elevados de TTPa en leucemias y en la enfermedad de Von Willebrand.
PRÁCTICA Nº 32: TIEMPO DE TROTOMBINA O TIEMPO DE QUICK
Material:
• Baño.
• Tubo.
28
• Reactivo: Tromboplastina cálcica Tromborel®s
• Gradilla.
• Pipeta automática.
• PPP.
Técnica:
• Reconstituir la Tromboplastina cálcica.
• Depositar el volumen de Tromborel®s que se va a necesitar en un tubo de ensayo debidamente rotulado.
• Atemperar a 37ºC.
• Introducir un trocito de acero en una cubeta del coagulómetro.
• Añadir 100 µl. de la M en la cubeta e incubar a 37ºC. durante 5 min.
• Colocar la cubeta en la celda de medida del coagulómetro y añadir 200 µl. de Tromborel®s.
• Cuando se forme el coágulo, el cronómetro finaliza la lectura y nos da el tiempo transcurrido desde la
adicción del Tromborel®s.
Resultados:
Valores normales 11 − 15 seg.
Si se expresa en % de actividad: 70 − 100%
Tp muestra
Posición o tasa de Protombina: −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
Tp control
123
456
+
_
+
_
29