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sDEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR,
FISIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
Papel de la AD(P)H:quinona
oxidorreductasa 1 (QO1) en el control del
crecimiento de las células animales.
Laura Jódar Montilla
Córdoba 2010
TITULO: Papel de la NAD(P)H: quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) en el control
del crecimiento de las células animales
AUTOR: Laura Jodar Montilla
© Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. 2010
Campus de Rabanales
Ctra. Nacional IV, Km. 396
14071 Córdoba
www.uco.es/publicaciones
[email protected]
ISBN-13: 978-84-693-8930-0
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR,
FISIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
Papel de la AD(P)H:quinona
oxidorreductasa 1 (QO1) en el control del
crecimiento de las células animales.
Memoria de Tesis Doctoral presentada por Laura Jódar Montilla,
Licenciada en Biología, para optar al grado de Doctora en Ciencias.
Los Directores
Dr. Jose Manuel Villalba Montoro
Catedrático de Biología Celular
Universidad de Córdoba
Dr. Jose Antonio González Reyes
Catedrático de Biología Celular
Universidad de Córdoba
En Córdoba, a 13 de octubre de 2010
D. Jose Manuel Villalba Montoro, Doctor en Ciencias y Catedrático de
Universidad del Área de Biología Celular del Departamento de Biología
Celular, Fisiología e Inmunología de la Universidad de Córdoba,
INFORMA
Que Laura Jódar Montilla, Licenciada en Biología, ha realizado bajo su
dirección el trabajo titulado “Papel de la AD(P)H:quinona
oxidorreductasa 1 (QO1) en el control del crecimiento de las células
animales”, que a su juicio reúne los méritos suficientes para optar al Grado
de Doctora en Ciencias
Y para que conste, firmo el presente INFORME en Córdoba, a 13 de
octubre de 2010
Jose Manuel Villalba Montoro
D. Jose Antonio González Reyes, Doctor en Ciencias y Catedrático de
Universidad del Área de Biología Celular del Departamento de Biología
Celular, Fisiología e Inmunología de la Universidad de Córdoba,
INFORMA
Que Laura Jódar Montilla, Licenciada en Biología, ha realizado bajo su
dirección el trabajo titulado “Papel de la AD(P)H:quinona
oxidorreductasa 1 (QO1) en el control del crecimiento de las células
animales”, que a su juicio reúne los méritos suficientes para optar al Grado
de Doctora en Ciencias
Y para que conste, firmo el presente INFORME en Córdoba, a 13 de
octubre de 2010
Jose Antonio González Reyes
Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en el Departamento de Biología
Celular, Fisiología e Inmunología de la Universidad de Córdoba, bajo
la dirección de los Dres. José Manuel Villalba Montoro y José Antonio
González Reyes. El trabajo ha estado financiado por los Proyectos de
Investigación BFU2005-00137/BMC (Ministerio de Educación y
Ciencia) y BFU2008-00559/BMC (Ministerio de Ciencia e
Innovación). La doctoranda ha estado financiada con un contrato de
investigación con cargo al Grupo PAIDI BIO-276 (Biomembranas,
Antioxiddantes y Estrés Oxidativo, Junta de Andalucía y Universidad
de Córdoba).
RESUME
Introducción.
El control del crecimiento de las células animales depende de la percepción de señales
apropiadas que permiten a las células sobrepasar diversos puntos de control, y de esta
manera progresar a lo largo de las distintas fases del ciclo celular. Para que el
crecimiento celular sea adecuado, debe haber un equilibrio entre sustancias oxidantes
(como las especies reactivas de oxígeno, ROS) y sustancias antioxidantes, fenómeno
que se conoce como “balance de reducción/oxidación” o simplemente “balance redox”.
La pérdida de dicho balance puede tener multitud de consecuencias para la célula, lo
que incluye proliferación aberrante, defectos en la renovación celular, cáncer y
envejecimiento celular.
Las enzimas antioxidantes pueden desempeñar un papel esencial en el control del
crecimiento celular ya que regulan los niveles fisiológicos de ROS. La NAD(P)H:
quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) es una enzima antioxidante que cataliza la
reducción de diversas quinonas hasta sus correspondientes hidroquinonas usando como
donadores tanto NADH como NADPH. La capacidad de NQO1 para catalizar dicha
reducción, es esencial para su papel como antioxidante y en la citoprotección frente a
sustancias tóxicas, ya que evita la generación de intermediarios semiquinónicos, los
cuales presentan una elevada tendencia a reaccionar con el oxígeno dando lugar a
superóxido. La expresión basal e inducida de NQO1 se regula principalmente por el
factor de transcripción Nrf2, el cual se une al ARE presente en el promotor del gen
NQO1.
El conocimiento del papel de NQO1 y de Nrf2 en la regulación del crecimiento celular
puede ser fundamental para entender mejor las causas del cáncer, lo que en un futuro
podría ayudar al desarrollo de nuevas drogas antitumorales y antienvejecimiento.
Objetivo general.
El objetivo principal de esta Tesis es, por tanto, el estudio del papel de NQO1 y Nrf2 en
la regulación del crecimiento en células animales. Para ello se utilizará un abordaje
genético mediante la utilización de fibroblastos embrionarios de ratón a los que se les ha
eliminado el gen NQO1 o el gen Nrf2 (NQO1-/- y Nrf2-/-, respectivamente).
Objetivos específicos.
1. Obtención de líneas celulares de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
knockout para NQO1 o para Nrf2, el principal factor de transcripción
responsable de la expresión de esta reductasa.
2. Estudiar el proceso de senescencia e inmortalización de dichas células respecto a
los controles.
3. Investigar si la ausencia de NQO1 produce una alteración en el crecimiento
celular en MEFs.
4. Estudiar si la falta de NQO1 o de Nrf2 influye sobre los parámetros de estrés
oxidativo y/o a algunas de las enzimas antioxidantes más importantes.
5. Estudiar las modificaciones en la expresión de proteínas como consecuencia de
la falta de NQO1, mediante un abordaje proteómico.
6. Detectar y analizar posibles modificaciones estructurales y ultraestructurales
inducidas por la falta de NQO1 o de Nrf2.
Material y métodos.
Sobre estos tipos celulares, y los correspondientes fibroblastos control, se analizarán
parámetros de proliferación e inmortalización celular, posibles alteraciones en los
patrones de crecimiento, cambios en el comportamiento de las células frente a
situaciones de estrés oxidativo, cambios en la expresión de proteínas mediante abordaje
proteómico, así como posibles alteraciones en la estructura y ultraestructura como
consecuencia de la falta de estos genes.
Resultados y discusión
Los resultados obtenidos muestran que tanto NQO1 como Nrf2 intervienen en la
regulación del crecimiento y de la senescencia celular. En general, la falta de NQO1
resulta en un incremento en el crecimiento celular mientras que la falta de Nrf2 produce
la propensión de las células a la inmortalización al tiempo que disminuyen su capacidad
de proliferación. Además, la falta de NQO1 modificó los niveles de ROS así como la
actividad y expresión de varias enzimas antioxidantes. Por otra parte, el estudio
proteómico reveló que la ausencia de este gen modificaba los patrones de expresión de
varias proteínas relacionadas con el citoesqueleto de actina, así como a otras con
función antioxidante. Finalmente, comprobamos cómo la falta de NQO1 produce
alteraciones en la organización del citoesqueleto de actina y que su ausencia induce
cambios ultraestructurales que conciernen fundamentalmente a aspectos cuantitativos y
cualitativos de las mitocondrias. Las modificaciones estructurales observadas en las
células carentes de NQO1 parecen deberse a efectos indirectos, mientras que las
alteraciones del crecimiento celular pueden estar debidas de manera directa a la falta de
la reductasa, ya que éstas últimas revierten tras la recuperación de su expresión.
Abreviaturas
Por orden alfabético
α-TOH
α-TQH2
ADN
ADNc
α-tocoferol
α-tocoferilhidroquinona
Ácido desoxirribonucleico
Ácido desoxirribonucleico copia
APS
Persulfato amónico
ARE
Elemento de respuesta antioxidante
ARF
Factor de ribosilación de ADP (adenina difosfato)
ARN
Ácido ribonucleico
ARNm
b5R
Ácido ribonucleico mensajero
NADH-citocromo b5 reductasa
BCIP
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
CAT
Catalasa
CDK
Proteína quinasa dependiente de ciclina
CKI
CLAP
CoQ
CoQnH2
CuZnSOD
DCF
DCFH
DCFH-DA
Proteína inhibidora de la CDK
Quimostatina, leupeptina, antipaína, pepstatina A
Coenzima Q
Ubiquinol
Superóxido dismutasa dependiente de cobre y zinc
2’-7’-diclorofluoresceína
2’-7’-diclorodihidrofluoresceína
Diacetato de 2’-7’-diclorodihidrifluoresceína
DMEM
Medio de Eagle modificado de Dubelcco
DMSO
Dimetilsulfóxido
DTT
EDTA
Ditiotreitol
Ácido etilén-diamino-tetraacético
ERK
Proteína quinasa regulada por señales extracelulares
FAD
Flavina adenina dinucleótido
FADH2
Flavina adenina dinucleótido reducido
GPx
Glutatión peroxidasa
GSH
Glutatión reducido
IAA
Iodoacetamida
IEF
Isoelectroenfoque
JNK
LB
MAPK
MEFs
MnSOD
Quinasa del N-terminal de c-Jun
Medio Luria-Bertani
Proteínas quinasas activadas por mitógenos
Fibroblastos embrionarios de ratón
Superóxido dismutasa dependiente de manganeso
NBT
Azul de nitrotetrazolio
NF-kB
Factor nuclear kappa B
NOS
NQO1
Pb
Óxido nítrico sintasa
NAD(P)H: quinona oxidoreductasa 1
Pares de bases
PBS
Tampón fosfato salino
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PI3K
Fosfatidilinositol 3-quinasa
PKC
Proteína quinasa C
PMSF
Rb
RIPA buffer
ROS
RT-PCR
SA-β-Galactosidasa
SDS
SDS-PAGE
SOD
TNF-α
Tris-HCl
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
Retinoblastoma
Tampón de ensayo para Radio Inmuno Precipitación
Especies reactivas de oxígeno
Transcripción reversa – Reacción en cadena de la polimerasa
β-galactosidasa asociada a senescencia
Sodio duodecil sulfato
Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS
Superóxido dismutasa
Factor de necrosis tumoral-α
Tris (hidroximetil) aminometano-HCl
TrxR
Tiorredoxina reductasa
U.A.
Unidades arbitrarias
XRE
Elemento de respuesta a agentes xenobióticos
ÍDICE DE COTEIDOS
Introducción.................................................................................................1
1. Regulación del crecimiento celular…………………………………………5
1.1. Ciclo celular y su regulación……………………………………...…5
1.2. Alteraciones del ciclo celular en células tumorales.
Papel de p53…………………………………………………….…….….8
1.3. Senescencia inducida por oncogenes................................................11
2. El Balance Redox celular. Estrés oxidativo……………………………….14
2.1. Especies reactivas y radicales libres…………………………...…..14
2.1.1. Principales especies reactivas………………………….....16
2.2. Estrategias celulares contra los radicales libres. Sistemas
antioxidantes……………………………………………………….…...18
2.2.1. Antioxidantes enzimáticos…………………………..…...20
2.2.2. Antioxidantes no enzimáticos………………………..…..21
2.3. Papel del balance redox en la regulación del crecimiento
celular……………………………………………………………….…..22
3. RF2………………………………………………………………………...24
3.1. Estructura, localización y mecanismo de acción…………………..24
3.2. Regulación de la función de Nrf2 ……………………………..…..26
3.3. Funciones……………………………………………………….….27
4. AD(P)H:quinona oxidoreductasa 1 (QO1)…………………………....29
4.1. Estructura, localización y mecanismo de reacción………………...29
4.2. Polimorfismos genéticos………………………………………..….30
4.3. Regulación de la expresión………………………………………...30
4.4. Funciones……………………………………………………….….31
4.4.1. Función antioxidante…………………………………......31
4.4.2. Mantenimiento del estado redox intracelular,
regulación de la señalización y expresión génica……………....32
4.4.3. Quimioprevención del cáncer y bioactivación
de moléculas antitumorales…………………..…………………33
4.4.4. Expresión de NQO1, control del crecimiento
celular cáncer……………………….……………………..……34
Objetivos......................................................................................................37
Materiales y Métodos..................................................................................41
1. Obtención y manejo de cultivos primarios de fibroblastos
embrionarios de ratón………………………………………………………...43
2. Obtención de líneas inmortalizadas……………………………………….43
3. Análisis de la viabilidad celular……………………………………………44
4. Determinación del número de duplicaciones de las distintas
líneas celulares…………………………………………..……………………..44
5. Obtención de fracciones citosólicas y membranosas..…………………...45
6. Lisis celular para la determinación de proteínas
mediante inmunoblotting……………………………………………………..45
7. Determinación de la cantidad de proteína………………………………...46
8. Actividad enzimática QO1……………………………………………….46
9. Análisis de expresión génica mediante RT-PCR a tiempo real………….47
10. Análisis de proliferación celular mediante incorporación
de [metil-3H] timidina…………………………………………………………48
11. Análisis de los niveles de ROS……………………………………………49
12. Análisis del ciclo celular…………………………………………………..49
13. Determinación de los marcadores de senescencia p21CIP1 y p53……….50
13.1. SDS-PAGE y electrotransferencia…………………………...…...50
13.2. Inmunotinción y revelado por quimioluminiscencia……………..51
14. Ensayos para determinar la presencia de senescencia celular.
Tinción SA-β-Galactosidasa lisosomal a pH 6.0…………………………..…52
15. Determinación de marcadores de complejo de Golgi y de
endosomas tardíos: GM 130, KDEL R, sintaxin6 y Rab7……………….….53
16. Actividad catalasa…………………………………………………………53
17. Determinación de los niveles de Sirt 1…………………………………...53
18. Determinación de los niveles de expresión de b5R
(citocromo b5 reductasa)……………………………………………...………53
19. Determinación de las ciclinas: A y E……………………………………..54
20. Análisis proteómico………………………………………………………..55
20.1. Solubilización de las proteínas……………………………………55
20.2. Isoelectroenfoque (IEF)……………………………..……………56
20.3. Segunda dimensión o electroforesis en gel en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)………………………...…57
20.4. Tinción con Sypro Ruby…………………………………..……...58
20.5. Análisis de imagen………………………………………….….…58
20.6. Identificación de las proteínas separadas
en geles de poliacrilamida mediante técnicas
de espectrometría de masas……………………………………...……...58
20.7. Validación de proteínas mediante Western blot…………….……59
21. Estudio ultraestructural y estructural…………………………………...61
21.1. Técnicas de microscopía electrónica de transmisión………….….61
21.2. Técnicas de microscopía electrónica de barrido……………….…62
22. Estudio de la arquitectura del citoesqueleto de actina………………….62
23. Transfección de las células QO1-/-……………………………………...63
23.1. Preparación de bacterias competentes……………………….……64
23.2. Transformación de E.coli……………………………………...….65
23.3. Purificación del plásmido…………………………………...…….65
23.4. Transfección de los MEFs…………………………………….......65
Resultados y Discusión...............................................................................67
Capítulo 1: Crecimiento celular………………………………………...69
1. ¿Afecta la falta de QO1/fr2 a la senescencia e
inmortalización de los MEFs?..........................................................................71
2. Recuperación de QO1 mediante transfección………………..…………82
3. Efecto del estatus de QO1 sobre la detención del crecimiento
dependiente de la densidad y la respuesta celular a la retirada de
suero……………………………………………………………………………84
3.1. Incorporación de timidina………………………………………….85
3.2. Análisis de la distribución en el ciclo celular mediante
citometría flujo………………………………………………………….86
3.3. Ciclinas: A y E……………………………………………………..89
4. Sirt 1…………………………………………………………………………91
Capítulo 2: Estrés oxidativo y enzimas antioxidantes…………………93
5. Especies reactivas de oxígeno………………………………………………95
6. Actividad Catalasa………………………………………………………….98
7. Actividad enzimática QO1…………………………………………...…100
8. Citocromo b5 reductasa……………………………………..……………103
Capítulo 3: Alteraciones celulares producidas por la falta
de QO1: Estudio Proteómico.……………..…………………………105
9. Análisis proteómico………………………………………………………..107
10. Cambio en la organización del citoesqueleto de actina
en las células carentes de QO1………………………………….…………117
Capítulo 4: Análisis Ultraestructural…………………………………121
11. Microscopia Electrónica de Barrido (MEB)……………...……………123
12. Microscopia Electrónica de Transmisión (MET)………………..….…126
Conclusiones.............................................................................................131
Bibliografía...............................................................................................135
Índice de Figuras y Tablas
Introducción
Figura I-1. Las distintas fases del ciclo celular: fase M, G1, S, G2 y G0…………………………………....6
Figura I-2. Intervención de las distintas ciclinas a lo largo del ciclo celular……………………………….8
Figura I-3. Esquema de cómo la proteína p53 bloquea el ciclo celular en respuesta
a un daño en el ADN para evitar alteraciones que puedan provocar una lesión irreversible……………...10
Figura I-4. Esquema de actuación de p53 con Mdm2…………………………………………………….11
Figura I-5. Dominios de interacción entre Keap1 y Nrf2………………………………………………....25
Figura I-6. Resumen del mecanismo de activación de la expresión génica y
de las defensas celulares mediadas por Nrf2……………………………………………………………...26
Material y métodos
Figura M-1. Demostración de que las células NQO1-/- son knockouts para NQO1………………………48
Tabla M-1. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados………………………………………...……59
Figura M-2. Vector comercial pRc/CMV…………………………………………………………………63
Resultados y Discusión
Capítulo 1
Figura R-1. Senescencia e inmortalización en MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/-………………….....…..72
Figura R-2. Determinación de los supresores de tumores p53 y p21…………………...……………..…75
Figura R-3. Número de duplicaciones en los MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/- inmortalizados……..…..77
Figura R-4. Tinción histoquímica de la actividad SA-β-galactosidasa……………………..……………78
Figura R-5. Determinación mediante western blot de las proteínas GM 130,
KDEL- receptor, Sintaxin 6 y Rab 7……………………………………………………………...……….79
Figura R-6. A) PCR de las células NQO1-/- transfectadas 48 horas, 1 y 2 semanas.
B) Cuantificación densitométrica de los geles de RT-PCR………………………………………….……82
Figura R-7. Número de duplicaciones de las células NQO1-/- transfectadas con el
gen NQO1 a las 48 horas, 6 días y 9 días post-transfección…………………………………….………...83
Figura R-8. Síntesis de DNA en MEFs control y NQO1-/- cultivados en medio
completo o sin suero, y a alta o baja densidad celular………………………………………...…………..86
Figura R-9. Efecto de la ausencia de NQO1 o Nrf2 y de la retirada de suero en
la distribución celular en las fases del ciclo………………………………………………………….……87
Figura R-10. Niveles de expresión de ciclinas A y E en células MEFs control,
NQO1-/- y Nrf2-/- inmortalizadas………………………………………………………..…………………89
Figura R-11. Determinación de la proteína Sirt1 mediante western blot…………………………….......92
Capítulo 2
Figura R-12. Niveles de ROS intracelulares en los MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/- inmortalizados…...96
Figura R-13. Actividad catalasa………………..………………………………...………………………98
Figura R-14. Actividad NQO1 en fracciones citosólicas de MEFs control,
NQO1-/- y Nrf2-/- obtenidos de distintos pases……………………………………………...……………100
Figura R-15. Niveles de expresión de b5R en MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/- inmortalizados….....…103
Capítulo 3
Figura R-16. Imágenes representativas de geles 2-DE…………………………………….……………111
Figura R-17. Imágenes representativas de los spots que fueron identificados con éxito
y que mostraron diferencias estadísticamente significativas en el análisis de las células
carentes de NQO1………………………………………………………………………….…………….112
Tabla R-1. Lista de manchas proteicas alteradas en células NQO1-/- comparadas con los controles…...113
Figura R-18. Inmunodetección de Elfin, GRP75 y Transgelina en extractos
proteicos de células carentes de NQO1 y MEFs control……………………………………..………….114
Figura R-19. Inmunodetección de Elfin, GRP75 y Transgelina en células
MEFs, NQO1-/- y en NQO1-/- transfectadas con plásmido vacío y con
plásmido con NQO1……………………………………………………………………………………..116
Figura R-20. Micrografías de los cultivos celulares tomadas con el microscopio
invertido, que permite observar cambios morfológicos y de disposición
de los dos tipos celulares……………………………………………………………………………...….117
Figura R-21. Alteración de los filamentos de actina en ausencia de NQO1………………………..…..118
Figura R-22. Filamentos de actina en células transfectadas con el gen NQO1…………….……...……120
Capítulo 4
Figura R-23. Imágenes representativas de células MEFs, NQO1-/- y Nrf2-/observadas con el microscopio electrónico de barrido…………………………………………………..124
Figura R-24. Imágenes que muestran el aspecto ultraestructural de los tres
tipos celulares estudiados……………………………………………………………………………...…127
Figura R-25. Diagramas que muestran la porción de célula (arriba) y citoplasma
(abajo) ocupada por mitocondrias en los tres tipos celulares……………………………………...…….128
Figura R-26.- Diagrama que muestra variaciones en el diámetro medio mitocondrial
en los tres tipos celulares………………………………………………………………………………..129
ITRODUCCIÓ
______________________________________________________________________
Se desconoce con exactitud cuándo o cómo comenzó la existencia de la célula viva. Las
evidencias disponibles sugieren que los precursores de las primeras células surgieron de
forma espontánea, mediante el autoensamblaje de moléculas simples. El primer
conjunto de hipótesis contrastables acerca del origen de la vida fue propuesto por
Oparin y Haldane, quienes postularon que la aparición de la vida fue precedida por un
período de evolución química. Probablemente no había o había muy poco oxígeno libre
y los elementos mayoritarios que forman parte de todos los seres vivos (hidrógeno,
oxígeno, carbono y nitrógeno) estaban disponibles en al aire o en el agua. Una vez
surgidos los primeros compuestos orgánicos, éstos pudieron combinarse entre sí hasta
dar lugar a una molécula con capacidad de copiarse a sí misma, posiblemente ARN, y
posteriormente aparecerían el ADN y las proteínas. Estas moléculas se rodearon de
membrana y establecieron el control sobre su replicación: ¡Las primeras células vivas!
INTRODUCCIÓN
1. Regulación del crecimiento celular.
El control del crecimiento de las células animales depende de la percepción de señales
apropiadas que permiten a las células el sobrepasar diversos puntos de control, y de esta
manera progresar a lo largo de las distintas fases del ciclo celular. Este control se basa
en un balance entre factores que inhiben la superación de estos puntos de control
(supresores tumorales) y aquellos que estimulan la progresión a lo largo del ciclo celular
(proto-oncogenes). Las alteraciones tanto en los supresores tumorales como en los
proto-oncogenes pueden conducir al estado de proliferación desenfrenada relacionado
con la aparición del cáncer. Cuando se ven expuestas a señales de crecimiento
inapropiadas, las células de mamífero inician mecanismos complejos que suponen
destinos celulares alternativos para prevenir la tumorogénesis. Estas defensas incluyen
la apoptosis y la senescencia, que protegen frente a la proliferación desenfrenada. Los
tumores surgen cuando dichas defensas intrínsecas se ven sobrepasadas.
La progresión a lo largo del ciclo celular requiere la actuación coordinada de una
compleja red de proteínas reguladoras que funcionan como interruptores bioquímicos
que controlan sus principales fases e integran señales intracelulares y del medio
extracelular, mitogénicas o antiproliferativas, para adecuar la división celular a las
necesidades celulares. Un exceso en la estimulación o un defecto en la inhibición de la
proliferación celular, independientemente de las causas que lo originen, puede tener
como consecuencia un crecimiento incontrolado que desemboque en cáncer.
1.1. Ciclo celular y su regulación.
El ciclo celular es un proceso complejo y muy organizado; cuya función primordial es la
de duplicar el ADN y segregar las copias de forma precisa a dos células hijas
genéticamente idénticas. A pesar de que este proceso es continuo, se puede considerar
dividido en diversas fases (Figura I-1), siendo las principales la fase S, o de replicación
del ADN, y la mitosis o fase M. Entre estas fases hay unos lapsos de tiempo (“gaps”)
que se denominan G1 y G2. En el periodo G1, situado entre las fases M y S, la célula es
sensible a los estímulos de crecimiento positivo o negativo. En G2, tras la fase S, la
5
INTRODUCCIÓN
célula se prepara para entrar en mitosis, para lo cual deberá duplicar su masa proteica y
sus orgánulos. Podemos considerar una quinta fase conocida como fase de quiescencia o
G0, en la que las células entran en determinadas condiciones (Lukas and Bartek 2004),
permaneciendo en dicha fase hasta que las condiciones externas favorezcan su entrada
de nuevo en el ciclo. Para asegurar la progresión a través del ciclo, las células han
desarrollado una serie de puntos de control que evitan que se pase a una nueva fase
antes que la anterior haya sido completada con éxito (Martin 2003; Kastan and Bartek
2004; Lukas, Lukas et al. 2004).
Figura I-1. Las distintas fases del ciclo celular: fase M, G1, S, G2 y G0.
La transición de una fase a otra del ciclo celular es el resultado de la integración de
diferentes señales. Por una parte, señales externas que llegan desde el entorno celular
como son los factores de crecimiento, citoquinas y hormonas, los contactos
intercelulares y la adhesión a la matriz extracelular, y por otra parte, las señales
intracelulares, que constituyen los mecanismos de control o vigilancia (checkpoints) de
que dispone la célula para evitar el iniciar una fase si la anterior está incompleta o mal
realizada.
El control del ciclo celular está regulado por la acción de al menos tres familias de
proteínas altamente especializadas: las ciclinas, las proteínas quinasas dependientes de
ciclinas (CDKs), y las CKIs, proteínas que actúan como inhibidores de CDKs.
Las ciclinas, llamadas así porque sufren un ciclo de síntesis y degradación en el
transcurso de cada división celular (Evans, Rosenthal et al. 1983; Pines 1995), se unen a
las CDKs y controlan su capacidad para fosforilar las proteínas dianas. Pueden
6
INTRODUCCIÓN
clasificarse en cuatro tipos: ciclinas G1 que son las que ayudan al paso a través del punto
de restricción, ciclinas G1/S que se unen a las CDKs al final de G1 y determinan que la
célula se vea comprometida a replicar el ADN, ciclinas S que son necesarias para la fase
de replicación y las ciclinas M que promueven la mitosis.
Las CDKs son las quinasas que se activan mediante la unión a ciclinas. Los complejos
CDK/ciclina activados fosforilan proteínas en residuos de serina o treonina, permitiendo
así la progresión a lo largo del ciclo celular. En la mayoría de las células de mamíferos
se expresan al menos 5 CDKs: CDK1, CDK2, CDK3, CDK4 y CDK6 (Malumbres and
Barbacid 2009) .
Las CKIs son proteínas que se unen a las CDKs regulando negativamente su actividad.
En función de su estructura y función, las CKIs se clasifican en dos familias: a) La
familia INK (p15Ink4b, p16Ink4a, p18Ink4c y p19Ink4d), caracterizada por inhibir
específicamente las quinasas CDK4 y CDK6; y b) La familia CIP/KIP
(p21Cip1/WAF1, p27Kip1 y p57Kip2), caracterizada por tener un amplio espectro de
inhibición, aunque son más activas contra la quinasa CKD2 que contra las quinasas
CDK4 y CDK1 (Nabel 2002).
Como se observa en la figura I-2, durante G1 los mitógenos inducen la expresión de
ciclinas de tipo D que se unen a las quinasas CDK4 y CDK6 (Sherr 1993). Por una
parte, estos holoenzimas secuestran CKIs, disminuyendo así los niveles de inhibidor
libre; por otra parte, fosforilan la proteína retinoblastoma (Rb), provocando su
inactivación. Se libera entonces el factor de transcripción E2F, permitiendo así la
activación de genes necesarios para la entrada en fase S, como son la ciclina E y la
ciclina A. Una vez terminada la fase M, las células entran nuevamente en G1,
disminuyen los niveles de los holoenzimas ciclina-CDK, se defosforila y activa la
proteína Rb, que entonces interacciona de nuevo con E2F, lo cual resulta en su
inactivación hasta la llegada de una nueva fuente mitogénica y el comienzo de un nuevo
ciclo de división celular.
7
INTRODUCCIÓN
G0
G1
S
G2
M
Fosforilación por
Ciclina E/Cdk2
Fosforilación por
Ciclina D/Cdk4
P
pRb
E2F
pRb activa inhibe
la proliferación
celular
P
P
pRb
P
Fosfatasa
pRbE2F
pRb
PO4
E2F
Factor de
transcripción
E2F
E2F
ADN
Expresión génica
necesaria para la
progresión del
Ciclo Celular
Figura I-2. Intervención de las distintas ciclinas a lo largo del ciclo celular.
1.2. Alteraciones del ciclo celular en células tumorales. Papel de p53.
Como se ha indicado anteriormente, el ciclo vital de una célula está controlado por dos
clases de genes: los protooncogenes y los genes supresores de tumores, que son los
principales responsables de la proliferación celular incontrolada que se observa en los
tumores (Liebermann, Hoffman et al. 1995). Cuando mutan, los protooncogenes pueden
convertirse en oncogenes carcinogénicos capaces de dirigir una proliferación
descontrolada, por lo cual se describieron como dominantes o positivos (Polsky and
Cordon-Cardo 2003). Los genes supresores de tumores, por el contrario, contribuyen al
cáncer cuando se producen en ellos mutaciones que los silencian, por lo que se han
denominado negativas o recesivas (Polsky and Cordon-Cardo 2003). Un ejemplo de
8
INTRODUCCIÓN
proteína supresora de tumores es p53, la cual se encuentra alterada en la mayoría de los
tumores humanos (Zornig, Hueber et al. 2001).
El gen supresor tumoral p53, regulador negativo del ciclo celular, ha sido considerado
por muchos investigadores como el “guardián del genoma” (Lane 1992), debido a su
importante papel en la reparación del ADN. En respuesta a un daño en dicha molécula,
se produce una activación de p53, que induce el bloqueo del ciclo celular en la fase G1,
y posiblemente también en la fase G2, permitiendo que la reparación del material
genético tenga lugar antes del comienzo de la síntesis de ADN y de la mitosis,
promoviendo también apoptosis si el daño ocasionado es severo. Se han descrito
alteraciones en este gen en diversos tipos de neoplasias, entre ellos en tumores
colorrectales, donde más del 50% de estos tumores presentan p53 mutado (Vogelstein,
Fearon et al. 1989; Iacopetta 2003). El papel de los genes supresores de tumores es
prevenir la división celular cuando hay alteraciones que comprometen la fidelidad de la
división celular. Así, p53 es capaz de unirse a lugares específicos del ADN, regulando
la expresión de otros genes (ente ellos el de p21, un inhibidor de CDKs), que controlan
ciertas funciones celulares esenciales. Tal como se observa en la Figura I-3, p53
interviene en la detención del ciclo celular en la transición G1/S principalmente debido a
la transcripción de p21, que es dependiente de p53. La proteína p21 inhibe los
complejos CDK-ciclina y la fosforilación de pRb, de manera que el factor de
transcripción E2F permanece inactivo, y se impide la progresión de la célula hacia la
fase S. Esta "pausa" en la progresión del ciclo celular proporciona tiempo para reparar
los daños producidos en el ADN. La pRB forma un complejo con los factores de
trascripción de la familia E2F, lo que resulta en la inactivación de E2F. Cuando la pRB
es fosforilada por el complejo CDK-ciclina se libera de E2F, lo que permite que E2F
active la trascripción de genes. En el contexto del ciclo celular, E2F incrementa la
trascripción de las ciclinas de la fase S así como su propia trascripción.
9
INTRODUCCIÓN
p53
p53
p53
p53
p53
p53
p53
p53
p53
El daño en el AD promueve la
agregación de p53
p21
p21
AD polimerasa
Ciclina Cdk2
Ciclina Cdk2
PCNA
PCNA
Fosfatasa
P
P
pRb
E2F
pRb activa inhibe
la proliferación celular
P
pRb
P
pRb
pRb
E2F
PO4
E2F
Factor de
transcripción
E2F
Expresión génica
E2F
ADN
necesaria para la
progresión del
Ciclo Celular
Figura I-3. Esquema de cómo la proteína p53 bloquea el ciclo celular en respuesta a un daño en el
AD2 para evitar alteraciones que puedan provocar una lesión irreversible.
Esta es la razón de la conexión del gen p53 con procesos como la carcinogénesis
química, la vírica, la genética del cáncer, el ciclo celular, la activación de la apoptosis,
etc. La proteína mdm2, codificada por el gen MDM2, corresponde a uno de los factores
nucleares que regulan el ciclo celular en la transición de las fases G1 a S. La proteína
mdm2 puede unirse a p53 e inhibir su capacidad de activar la transcripción génica,
impidiendo así la detención del ciclo celular dependiente de p53 en la fase G1 y
anulando las propiedades antiproliferativas y pro-apoptóticas (Chen, Chen et al. 1994).
Tal como se observa en la Figura I-4 la proteína mdm2 aparece como producto de la
transactivación del gen MDM2 por la proteína p53, siendo entonces capaz de unirse a
esta proteína para su degradación vía ubiquitinas en el citoplasma (Haupt, Maya et al.
1997). El sitio de unión de mdm2 en la proteína p53 está situado en una pequeña región
de la zona aminoterminal de p53 (Picksley, Vojtesek et al. 1994). Sólo dos aminoácidos,
leucina 22 y triptófano 23, críticos para la interacción de p53 con la maquinaria
transcripcional, están relacionados con la unión a mdm2 (Lin, Chen et al. 1994; Kussie,
Gorina et al. 1996).
10
INTRODUCCIÓN
Figura I-4. Esquema de actuación de p53 con Mdm2. En células normales, el nivel de la proteína p53
es bajo porque se encuentra asociada a Mdm2, lo cual induce su ubiquitinación y destrucción por el
proteosoma. Los daños en el ADN y otras señales de estrés pueden hacer que p53 no se una a Mdm2 e
incrementar su concentración, permitiendo que realice su función como factor de transcripción.
1.3. Senescencia inducida por oncogenes.
En la célula se puede activar un proceso denominado “senescencia”; en ella se produce
un estado caracterizado por la parada permanente del ciclo celular y por cambios
específicos en la morfología y expresión génica que distinguen a la senescencia del
proceso de “quiescencia” (parada reversible del ciclo celular) (Campisi 2001; Shay and
Roninson 2004).
Hace varias décadas Hayflick y Moorhead (Hayflick and Moorhead 1961) describieron
por primera vez el fenómeno de “senescencia replicativa” como el proceso que se daba
en células estables con ciclo celular detenido, estado al que han llegado tras un número
finito de divisiones celulares. Las células que sufren este fenómeno se describen por
Hayflick y Moorhead como células alargadas, con grandes vacuolas y asociadas a la
actividad de la β-galactosidasa acídica, la cual parece corresponderse con la enzima βgalactosidasa lisosomal (Dimri, Lee et al. 1995; Lee, Han et al. 2006). La actividad de la
β-galactosidasa se visualiza mediante una reacción citoquímica (Gary and Kindell
11
INTRODUCCIÓN
2005), siendo por ello un marcador de senescencia muy utilizado. La senescencia de
Hayflick es resultado aparentemente de la replicación del ADN, por ello se denominó
“senescencia replicativa”.
En la mayoría de las células humanas, los telómeros se van acortando de 25 a 200 pares
de bases cada vez que el cromosoma se replica durante la fase S del ciclo celular. Ello
es debido a que las ADN polimerasas sintetizan las nuevas hebras de ADN en el sentido
5’-3’ y necesitan un primer de ARN para empezar, y, por lo tanto, no pueden copiar los
extremos de los cromosomas. Cuando la disminución de los telómeros sobrepasa cierta
longitud crítica, las células inician la fase de senescencia y dejan de dividirse. Si las
células hacen caso omiso de esta señal, la progresión en el acortamiento de los
telómeros dispara la crisis, ya que el excesivo acortamiento de los telómeros provoca
que los cromosomas se fusionen unos con otros, o se rompan, generando un caos
genético fatal para la célula (Harley 1994). Sin embargo, estas defensas genéticas se
pierden en la mayoría de las células cancerosas debido a la activación de un gen que
codifica una telomerasa (Lundblad and Szostak 1989). Esta enzima de naturaleza
ribonucleoproteica, virtualmente ausente en la mayoría de células sanas, pero presente
en casi todas las células cancerosas, reemplaza sistemáticamente los segmentos
teloméricos que se pierden en cada ciclo celular. La telomerasa mantiene así la
integridad de los telómeros y permite que las células se repliquen indefinidamente
(Kim, Piatyszek et al. 1994; Feldser and Greider 2007).
Mientras que la senescencia “replicativa” se dispara por la erosión de telómeros durante
las divisiones celulares, un fenotipo similar puede ocurrir en células jóvenes como
respuesta a oncogenes, daño en el ADN o estrés oxidativo (Campisi 2001; Shay and
Roninson 2004). La senescencia no replicativa se inicia mediante señales inducidas por
productos proteicos de oncogenes, acompañadas de la activación de una red de
supresión tumoral (Mooi and Peeper 2006). Un ejemplo de ello lo podemos encontrar
en el oncogén de la proteína Ras, que promueve la senescencia en células murinas y
humanas dependiendo de los productos de los genes I!K4a/ARF que codifican las
proteínas p16 y ARF [factor de ribosilación de ADP (adenina difosfato)] (Sherr 2001;
Lowe and Sherr 2003). La cascada de señalización de la proteína MAPK (proteína
quinasa activada por mitógenos) es la principal responsable en la ruta de Ras de la
12
INTRODUCCIÓN
senescencia celular, ya que induce p16 y ARF y finalmente activa Rb y p53
respectivamente (Lowe and Sherr 2003; Shay and Roninson 2004).
Es difícil obtener evidencias directas de éste fenómeno in vivo. Sin embargo, estudios
recientes aportan indicios que señalan que este tipo de senescencia es un mecanismo
que in vivo contribuye a la protección contra el cáncer (Braig, Lee et al. 2005;
Michaloglou, Vredeveld et al. 2005).
En términos generales, tanto la senescencia como la apoptosis parecen perseguir los
mismos fines en la supresión tumoral. Ambos fenómenos representan una respuesta
irreversible de inhibición del crecimiento celular que actúa como una barrera potente
para la evolución a una célula neoplásica. De hecho, muchas de las señales que
promueven la apoptosis en un tipo celular, inducen senescencia en otros. Por ejemplo,
tanto E2F como Myc pueden ser pro-apoptóticos o pro-senescentes dependiendo del
tipo celular, de sus niveles de expresión y de la ausencia de otras señales proapoptóticas
o de señales que promueven la proliferación (Dimri, Itahana et al. 2000).
13
INTRODUCCIÓN
2. El Balance Redox celular. Estrés oxidativo.
La formación de cierta cantidad de radicales libres en las células es un proceso normal e
inevitable (Slater 1984) ya sea como producto de desecho de una reacción química
dada, o como producto con una función bioquímica en el organismo. Las células
contrarrestan la producción de estos radicales libres por medio de gran cantidad de
mecanismos antioxidantes. El balance de reducción/oxidación (redox) de la célula se
mantiene gracias al equilibrio entre los oxidantes (como las especies reactivas de
oxígeno, ROS) y los antioxidantes. Este balance determinará finalmente el estado redox,
determinando una “homeostasis redox” o estado de equilibrio de las condiciones de
oxidación-reducción.
El estrés oxidativo se define como una alteración del equilibrio entre las especies
prooxidantes y las antioxidantes, a favor de las primeras (Chance, Sies et al. 1979). Así
pues, el estrés oxidativo puede originarse por un exceso de sustancias prooxidantes, una
deficiencia de agentes antioxidantes, o por ambos factores a la vez. Cuando se produce
este desequilibrio a favor de los prooxidantes, el resultado es un daño oxidativo que
puede afectar a diversas moléculas, y que puede reflejarse en sus funciones fisiológicas.
Numerosas enfermedades han sido vinculadas al estrés oxidativo (Enns 2003). En la
actualidad, se tienen evidencias de que el desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes
está asociado a la fisiopatología de, entre otras enfermedades, cáncer, enfermedad de
Parkinson, diabetes, artritis, enfermedades autoinmunes e inflamaciones crónicas. Así
mismo, el proceso biológico del envejecimiento se acelera en relación directa con la
magnitud del estrés oxidativo.
2.1. Especies reactivas y radicales libres.
Un radical libre, por definición, es una molécula o un único átomo que posee un
electrón desapareado. Desde el punto de vista químico, se trata de pequeñas moléculas
que se producen por diferentes mecanismos entre los que se encuentran la cadena
respiratoria mitocondrial, la cadena de transporte de electrones a nivel microsomal y en
14
INTRODUCCIÓN
los cloroplastos y diversas reacciones de oxidación, por lo que producen daño celular
(oxidativo) al interactuar con las principales biomoléculas del organismo.
Los radicales libres están implicados en numerosos procesos degenerativos, que
incluyen el envejecimiento, el cáncer, enfermedades cardiovasculares, arteriosclerosis,
enfermedades neurológicas, procesos irritativos de la piel, e inflamaciones. En los
sistemas biológicos, los radicales libres son habitualmente moléculas de oxígeno o
formadas en parte por éste, lo cual hace que a este conjunto se les denomine en general
comúnmente como especies reactivas del oxígeno (ROS) (Beckman and Koppenol
1996).
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son un conjunto de moléculas producidas en
algunos procesos metabólicos en los que participa el oxígeno. Las ROS, entre las que se
encuentran iones de oxígeno, radicales libres y peróxidos, son muy reactivas. Su gran
reactividad se debe a que poseen electrones desapareados que les hace reaccionar con
otras moléculas orgánicas en procesos de oxido-reducción. Las distintas ROS pueden
participar en distintos tipos de reacciones en las que pueden sufrir procesos de
oxidación o reducción. De menor a mayor grado de reducción encontramos: el anión
superóxido O2 - que es un potente agente oxidante muy reactivo con el agua; el peróxido
.
de hidrógeno (H2O2); y el radical hidroxilo OH-, que es el más reactivo. Aceptando un
electrón más, el radical hidroxilo da lugar a una molécula de agua. También pertenece al
grupo de los radicales libres el óxido nítrico, el cual tiene una elevada tendencia a
reaccionar con el superóxido para formar diversas especies reactivas de nitrógeno.
Debido a su naturaleza reactiva las ROS pueden producir daños sobre moléculas tales
como lípidos, proteínas y ADN, así como otras lesiones inducidas por reacción con
metales tales como el hierro y el cobre. El daño producido sobre estas macromoléculas
se resume brevemente a continuación:
1. Lípidos. Es aquí donde se produce el daño mayor en un proceso que se conoce como
peroxidación lipídica, afectando a las estructuras ricas en ácidos grasos poliinsaturados
(Cheeseman and Slater 1993). Las modificaciones oxidativas de los lípidos alteran la
permeabilidad de la membrana celular produciéndose edema y muerte celular.
15
INTRODUCCIÓN
2. Proteínas. Todos los aminoácidos presentes en las proteínas tienen residuos
susceptibles de ser atacados por los radicales libres, sobre todo por el radical hidroxilo
(Stadtman 1990). Dentro de los aminoácidos esenciales, la tirosina, la fenilalanina, el
triptófano, la histidina, la metionina y la cisteína son los más susceptibles a los procesos
oxidativos (Davies 1987). En general, la oxidación puede dar lugar a un cambio
conformacional de la proteína y, por tanto, a una pérdida o modificación de su función
biológica. Además se forman entrecruzamientos de cadenas peptídicas, fragmentación
de la proteína y formación de grupos carbonilo (Cabiscol, Tamarit et al. 2000).
3. Ácido desoxirribonucleico (AD!). El ADN también es susceptible de daño oxidativo
en todos sus componentes. Ocurren fenómenos de mutaciones y carcinogénesis, hay
pérdida de expresión o síntesis de proteínas por daño a genes específicos,
modificaciones oxidativas en las bases nitrogenadas, deleciones, fragmentaciones,
interacciones estables ADN-proteínas, reordenamientos cromosómicos y desmetilación
de citosinas que activan genes. El daño se puede realizar por la alteración de algunos
genes supresores de tumores, que pueden conducir a la iniciación o progresión de la
carcinogénesis. Los genes supresores de tumores pueden ser modificados por un simple
cambio en una base crítica de la secuencia del ADN (Fraga, Shigenaga et al. 1990;
Wiseman and Halliwell 1996; Cadet, Berger et al. 1997).
Por otra parte, además de provocar daños celulares, el estrés oxidativo influye también
en la regulación de ciertos genes, habiéndose involucrado en la aceleración de los
procesos de envejecimiento, en la activación de rutas de apoptosis y en la activación de
distintas respuestas de defensa frente a esta situación de estrés (Harman 1956; Li, Ito et
al. 1999; Masoro 2006; Simpson and Raubenheimer 2007).
2.1.1. Principales especies reactivas.
Existen muchas clases de especies reactivas. Algunas de las más importantes son:
A) Anión superóxido (O2·-). Se trata de una especie relativamente poco reactiva, pero
potencialmente tóxica, ya que puede iniciar reacciones que den lugar a otras ROS que a
su vez sí son muy reactivas.
16
INTRODUCCIÓN
B) Peróxido de hidrógeno (H2O2). El peróxido de hidrógeno no es un radical libre, pero
se debe tener en cuenta por su facilidad para difundir a través de las membranas. En los
medios biológicos se forma por dos vías: tras la reducción directa del oxígeno por dos
electrones; y por la dismutación del anión superóxido. Muchas enzimas producen agua
oxigenada a partir de oxígeno: xantina oxidoreductasa, superóxido dismutasa, glucosa
oxidasa, D-aminoácido oxidasa, uricasa, etc. (Janolino and Swaisgood 1975).
Finalmente, también puede producirse por reacciones químicas como la autooxidación
del ácido ascórbico catalizada por cobre (Korycka-Dahl and Richardson 1980). La
catalasa la transforma en agua.
C) Radical hidroxilo (.OH). Es probablemente el radical libre más potente y devastador.
Se estima que más del 50% del daño que producen los radicales libres puede ser
atribuido al .OH. Su alta reactividad hace que su acción química quede reducida al lugar
de producción. A nivel biológico, el proceso de formación del radical hidroxilo más
importante es la reacción de Fenton:
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + .OH
También a partir de agua oxigenada y del radical superóxido puede formarse el radical
hidroxilo, por la reacción de Haber-Weiss: (Halliwell 1989)
H2O2 + O2·- → O2 + OH- + .OH
Esta reacción es catalizada por metales como el hierro o el cobre.
D) Radical peroxilo (ROO.). Los radicales peroxilos son probablemente los más
abundantes en los sistemas biológicos, aunque no son tan reactivos como otras ROS. Se
originan a partir de la adición de oxígeno a prácticamente cualquier radical
hidrocarbonado.
E) Oxígeno singlete (1O2). Es una forma excitada del oxígeno molecular. No es un
radical libre y se forma in vivo por acción de la luz sobre las moléculas de oxígeno en
presencia de fotoactivadores como la riboflavina.
17
INTRODUCCIÓN
F) Óxido nítrico (.NO). En los últimos años se ha prestado particular atención a esta
especie reactiva del nitrógeno. Se forma enzimáticamente a partir de la arginina,
reacción catalizada por la óxido nítrico sintasa (NOS). Puede reaccionar con ácidos
nucleicos dando lugar a mutaciones y roturas del ADN. También puede producir
necrosis, entre otros fenómenos (Bonfoco, Krainc et al. 1995).
G) Peroxinitrito (ONOO-.). El óxido nítrico puede generar anión peroxinitrito al
reaccionar con el anión superóxido (Gryglewski, Palmer et al. 1986; Miles, Bohle et al.
1996). En soluciones neutras, es un potente agente oxidante, capaz de oxidar grupos
tioles o tioéteres, así como de nitrar residuos de tirosina, de nitrar y oxidar guanosina,
de degradar carbohidratos, de iniciar peroxidación lipídica y de fragmentar ADN
(Beckmann, Ye et al. 1994; Beckman and Koppenol 1996).
2.2. Estrategias celulares contra los radicales libres. Sistemas antioxidantes.
La formación de cierta tasa de radicales libres es un proceso normal e inevitable (Slater
1984), ya que son producto de infinidad de reacciones químicas imprescindibles para la
vida celular. Estas especies tan reactivas no causan daño oxidativo en condiciones
normales debido a que la célula está provista de gran cantidad de mecanismos
antioxidantes. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, cuando la capacidad de
los mecanismos antioxidantes se ve superada por las agresiones oxidativas, nos
encontramos ante una situación de estrés oxidativo.
Una sustancia antioxidante es aquella que, a concentraciones relativamente bajas, es
capaz de competir con otros sustratos oxidables y, por tanto, retrasar o inhibir la
oxidación de los mismos. En esta definición se engloban tanto los antioxidantes
enzimáticos como los no enzimáticos. Los antioxidantes enzimáticos impiden la
formación de radicales libres a partir de otras moléculas. Si los radicales libres ya
existen, estos antioxidantes se encargan de convertirlos en moléculas menos dañinas
para el organismo. Los antioxidantes no enzimáticos son aquellos compuestos que
donan sus electrones a los radicales libres, neutralizándolos y evitando reacciones en
cadena.
18
INTRODUCCIÓN
Si los mecanismos de prevención antioxidante, que a continuación estudiaremos, no son
del todo eficaces será necesaria la reparación de las moléculas dañadas, y en aquellas
ocasiones en las que no sea posible, se procederá a su degradación. El daño oxidativo en
los ácidos nucleicos es reparado por enzimas específicas (Cheeseman and Slater 1993),
como las ADN glicosilasas, las cuales pueden ser de dos tipos, unas capaces de
hidrolizar enlaces N-glicosílicos entre una base dañada o inapropiada base y el azúcar
desoxirribosa, y otras que, además de presentar la función anteriormente mencionada,
presentan actividad β-liasa, eliminando los sitios azúcares-fósforo resultantes por βeliminación. También encontramos endonucleasas de varios tipos. Las proteínas
oxidadas son eliminadas por sistemas proteolíticos, mientras que los lípidos de
membrana oxidados son eliminados por peroxidasas, lipasas y aciltransferasas, por
ejemplo la fosfolipasa A2, que se encarga de liberar los ácidos grasos oxidados de los
fosfolípidos de membrana, para que puedan actuar sobre ellos los sistemas antioxidantes
correspondientes (Cheeseman and Slater 1993). Se ha observado que la fosfolipasa A2
aumenta en la membrana interna mitocondrial y otras membranas en respuesta a
condiciones asociadas a un incremento de ROS (Malis, Weber et al. 1990; Hatch, Vance
et al. 1993).
Principales mecanismos antioxidantes
Enzimáticos
o enzimáticos
Superóxido dismutasa (SOD)
Glutatión (GSH)
Catalasa (CAT)
Vitamina C
Glutatión peroxidasa (GPx)
Vitamina E
Tiorredoxina reductasa (TrxR)
Ácido lipoico
Ubiquinona
Quelantes de metales
de transición
Carotenoides
Polifenoles
Tiorredoxina
19
INTRODUCCIÓN
2.2.1. Antioxidantes enzimáticos.
Las células disponen de enzimas específicas para la neutralización de diversas especies
reactivas, como son la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutatión
peroxidasa (GPX). Además, las óxidoreductasas de grupos tioles y disulfuros, como la
tiorredoxina y la glutaredoxina, están adquiriendo importancia en la prevención del
estrés oxidativo.
a) Superóxido dismutasa (SOD). La primera defensa contra el radical superóxido es la
SOD, que lo transforma en agua oxigenada (Fridovich 1978).
2 O2·- + 2 H+ H2O2 + O2
Cabe destacar que el radical superóxido es inestable en medio acuoso y dismuta
espontáneamente formando H2O2. Sin embargo, la velocidad de dismutación espontánea
no enzimática es relativamente baja. La catálisis de la reacción de dismutación llevada a
cabo por la enzima SOD incrementa esta velocidad del orden de 10.000 veces
(Fridovich 1974).
En el ser humano y otros mamíferos existen tres isoenzimas: la CuZn-SOD, la Mn-SOD
y la ecSOD. La primera se localiza en el citosol y en el espacio intermembrana
mitocondrial, mientras que la segunda se ubica en la matriz mitocondrial (Grisham,
Hernandez et al. 1986). La tercera, que también es una CuZn-SOD, es extracelular
(Stralin, Karlsson et al. 1995).
b) Glutatión peroxidada (GPX). Esta enzima reduce el agua oxigenada o el
hidroperóxido orgánico a agua y alcohol respectivamente, y para ello utiliza en ambos
casos el glutatión reducido (GSH) como donante de electrones (Maiorino, Chu et al.
1991):
2GSH + H2O2 2GSH + ROOH 20
GSSG + 2H2O
GSSG + ROH
INTRODUCCIÓN
La presencia de GPX tanto en el citosol como en la mitocondria y en la membrana
plasmática, la convierte en un potente mecanismo de protección celular frente al daño
producido a lípidos de membrana, proteínas y ácidos nucleicos (Ji 1995).
c) Catalasa. Su función es la descomposición del agua oxigenada, tal y como se muestra
en la siguiente reacción, dando lugar a agua y a oxígeno molecular (Chance, Sies et al.
1979):
2H2O2 2H2O + O2
Aunque realiza la misma función que la GPX, ésta última tiene mayor afinidad por el
H2O2; es decir, a bajas concentraciones, la GPX juega un papel más importante que la
catalasa. La catalasa se distribuye en toda la célula, aunque se encuentra en grandes
concentraciones en los peroxisomas y en las mitocondrias.
2.2.2. Antioxidantes no enzimáticos.
A) Agentes quelantes de iones metálicos. Dentro de las proteínas que ligan metales se
pueden
mencionar
ferritina,
transferrina,
ceruloplasmina,
albúmina
y
las
metalotioneínas. En el plasma sanguíneo la mayor acción protectora es efectuada por la
transferrina y la ceruloplasmina. La ferritina es una proteína intracelular que evita la
acumulación de hierro libre, mientras que la ceruloplasmina es la encargada de captar
aproximadamente el 90% del cobre extracelular. Su actividad más importante reside en
inactivar el radical superóxido (Solomons 1979). La albúmina, que es la proteína más
abundante del plasma, presenta propiedades antioxidativas. Se le considera la
responsable de captar entre el 10 y el 50% del total de radicales peroxilo que se generan
en el plasma humano. Además, presenta capacidad de unirse al cobre, y de esta manera
inhibe la formación del radical hidroxilo que se forma a partir del peróxido de
hidrógeno (Wayner, Burton et al. 1987).
B) Moléculas pequeñas antioxidantes. Los organismos aeróbicos disponen de una serie
de moléculas antioxidantes que juegan un papel importante en la eliminación de ROS y
en la regeneración de otros antioxidantes. Algunas de ellas son sintetizadas por los
organismos, mientras que otras suponen un componente esencial en la dieta. Entre ellas
se encuentran moléculas hidrosolubles como el ácido úrico, glutatión y ácido ascórbico
21
INTRODUCCIÓN
(vitamina C) y moléculas liposolubles como los carotenoides, flavonoides, α-tocoferol
(α-TOH), α-tocoferilhidroquinona (α-TQH2) y ubiquinol (CoQnH2).
2.3. Papel del balance redox en la regulación del crecimiento celular.
La función de las ROS en el crecimiento celular es compleja, dependiendo del tipo
celular, de la concentración de las ROS, y del sitio donde éstas son generadas. La
modificación de la expresión génica por ROS tiene efectos directos sobre la
proliferación celular y la apoptosis. Las ROS también pueden funcionar como segundos
mensajeros involucrados en la activación del factor de necrosis tumoral NF-κ B y de las
citoquinas (Klaunig and Kamendulis 2004).
La pérdida del balance redox puede tener multitud de efectos celulares, incluyendo una
proliferación aberrante, defectos en la renovación celular, cáncer y envejecimiento
celular (Sarsour, Venkataraman et al. 2008). La acumulación de ROS en las células
conduce a un daño inducido por estrés oxidativo, lo que resulta en un incremento de la
tumorigénesis (Frohlich, McCabe et al. 2008; Seng, Avraham et al. 2009).
Las enzimas antioxidantes pueden desempeñar un papel esencial en el control del
crecimiento celular ya que regulan los niveles fisiológicos de ROS. Los estudios que
relacionan las enzimas antioxidantes con la proliferación celular se han enfocado
principalmente sobre la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutation
peroxidasa (GPX) (Li and Oberley 1998; Teoh, Sun et al. 2007). Entre ellas, se ha
prestado un interés especial a la MnSOD mitocondrial, la cual podría actuar como un
supresor tumoral ya que su sobreexpresión en las células tumorales inhibe el
crecimiento celular (Ough, Lewis et al. 2004; Ridnour, Oberley et al. 2004;
Venkataraman, Jiang et al. 2005; Sarsour, Venkataraman et al. 2008).
Los ROS han sido implicados como importantes mediadores patológicos en un gran
número de trastornos clínicos (Cross, Halliwell et al. 1987; van Haaften, Haenen et al.
2003); sin embargo, esta implicación no significa que estos radicales desempeñen
siempre un papel directo en el desarrollo de la enfermedad. Uno de los procesos
fisiopatológicos más importante en el que se ha implicado a los ROS es el
envejecimiento. Éste es un proceso multifactorial para el que se han propuesto
22
INTRODUCCIÓN
numerosas teorías, siendo la teoría de los radicales libres una de las más consolidadas.
Según esta teoría, formulada por Harman (Harman 1956) los ROS se generan
continuamente en las células aeróbicas causándoles un daño que conduce a un deterioro,
asociado al envejecimiento, de las funciones fisiológicas, tanto a nivel celular como del
organismo. Esta teoría sugiere la posibilidad de la administración de antioxidantes para
disminuir el daño asociado a la edad.
Cada vez está más aceptado que el estrés oxidativo juega un papel importante en
diversas situaciones clínicas, como las enfermedades malignas, la diabetes, la
arterosclerosis, inflamación crónica, infección viral, y la lesión por isquemiareperfusión (Behrend, Henderson et al. 2003; Apel and Hirt 2004; Bergamini, Gambetti
et al. 2004; Reddy and Clark 2004; Shah and Channon 2004; Willner 2004). Las ROS
pueden causar daño en el ADN y en proteínas, daño a los genes supresores de tumores y
el aumento de expresión de los proto-oncogenes (Wei 1992; Cerutti 1994; Bohr and
Dianov 1999). También se ha encontrado que el estrés oxidativo induce la
transformación de algunos tipos de cultivos celulares (Weitzman and Gordon 1990).
Enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, como la diabetes mellitus y el
cáncer, se asocian con cambios en el estado redox celular. El aumento de la producción
de ROS o los cambios en los niveles intracelulares de glutatión se asocian a menudo con
cambios patológicos indicativos de una desregulación de las cascadas de transducción
de señales o de la expresión génica (Droge 2002). Las ROS son potenciales agentes
cancerígenos, ya que facilitan la mutagénesis y progresión tumoral. Se ha encontrado
incluso que las células normales tienen una mayor capacidad de proliferación y una
mayor expresión de genes relacionados con el crecimiento si se exponen a
concentraciones bajas de H2O2. Las células de ciertos tipos de cáncer también producen
cantidades significativas de ROS. Así , se ha propuesto que la desconexión del estímulo
oxidante con la respuesta apoptótica celular constituye un mecanismo por el cual
muchas células tumorales se adaptan a sobrevivir y proliferar con elevadas
concentraciones de ROS intracelulares (Dolado, Swat et al. 2007). Por último, es
importante indicar que el estrés oxidativo ha sido implicado como uno de los primeros
eventos en la enfermedad de Alzheimer (Barja 2004).
23
INTRODUCCIÓN
3. RF2.
3.1. Estructura, localización y mecanismo de acción.
Las células responden al estrés oxidativo mediante la inducción de enzimas
antioxidantes. Muchas de estas enzimas son controladas por el elemento de la respuesta
antioxidante (ARE), secuencia presente en la región promotora de numerosos genes que
codifican para enzimas antioxidantes y destoxificadoras (Friling, Bensimon et al. 1990;
Itoh, Chiba et al. 1997; Shou, Dai et al. 2001; Yu and Kensler 2005; Yamamoto, Kyo et
al. 2006). El principal regulador de la respuesta antioxidante es el factor de
transcripción Nrf2 (factor-2 relacionado con el factor nuclear E2). Nrf2 pertenece a una
familia de proteínas básicas con una característica cremallera de leucinas (bZip) en la
región C-terminal (Moi, Chan et al. 1994; Itoh, Igarashi et al. 1995; Kensler,
Wakabayashi et al. 2007). La región básica corriente arriba de bZip es la responsable de
la unión al ADN, mientras que la región acídica al parecer se requiere para la activación
transcripcional. Así mismo posee una región altamente conservada cuya función aún se
desconoce.
Nrf2 es crucial para la destoxificación eficiente de metabolitos reactivos y de ROS
(Johnson, Johnson et al. 2008). El sitio de unión en Nrf2 representa un dominio bZip
que es el responsable de la dimerización con otras proteínas (Figura I-5) y de la
interacción con el sitio regulador en el ADN diana, por lo que la unión de Nrf2 al ADN
requiere de otras proteínas que contengan dominios bZip, las cuales incluyen miembros
de la familia de proteínas Maf (Itoh, Igarashi et al. 1995; Motohashi, Katsuoka et al.
2004).
24
INTRODUCCIÓN
Figura I-5. Dominios de interacción entre Keap1 y 2rf2.
2rf2. El dominio Neh2 se ha propuesto como sitio de unión a Keap1 mediante los motivos ETGE y DLG
(Tong, Kobayashi et al. 2006; Hayes and McMahon 2009). Cabe aclarar que el motivo DLG se encuentra
en la región hidrofóbica. En el dominio Neh2 también se encuentran siete residuos de lisina (K) que son
importantes para la ubiquitinación y degradación de Nrf2 (K44, K50, K52, K53,K56, K64, K68).des
Keap1. El dominio DGG provee el sitio de unión a Nrf2 y a actina, mientras que IVR contiene a los
residuos de cisteína (C) capaces de oxidarse y registrar el estado oxidativo de la célula (C151, C257,
C273, C288, C297). Cul3 es la ligasa E3 que sirve de adaptador para unirse al proteosoma.
Nrf2 es esencial para la regulación positiva de muchas enzimas antioxidantes y enzimas
destoxificadoras de fase II que se inducen bajo condiciones de estrés. Tal como se
observa en la Figura I-6, Nrf2 se encuentra asociado con la proteína Keap1 en
condiciones fisiológicas normales (Itoh, Wakabayashi et al. 1999; Tong, Katoh et al.
2006). Hay estudios que han demostrado que la sola interacción de Keap1 con Nrf2 es
insuficiente para mantener a Nrf2 en el citosol y se ha reportado que Keap1 se asocia al
mismo tiempo con el citoesqueleto (Kang, Kobayashi et al. 2004). Al parecer Keap1
forma un multi-complejo estructural en el cual comparte sus láminas-β tanto con Nrf2
como con los filamentos de actina. Todas estas observaciones indican que el complejo
Keap1-Nrf2 se forma y se retiene en el citosol mediante interacciones con el
citoesqueleto. Keap1 secuestra a Nrf2 en el citoplasma formando el complejo Keap1Nrf2, que actúa como sensor celular de estrés oxidativo. El estrés oxidativo o la
exposición a agentes químicos exógenos, hace que Nrf2 se libere de Keap1 (Itoh,
Wakabayashi et al. 1999), se transloque al núcleo y se una al ARE presente en el
promotor. De esta forma se produce la activación de la expresión génica de enzimas
antioxidantes (Itoh, Wakabayashi et al. 1999; Kwak, Wakabayashi et al. 2003; Nguyen,
Sherratt et al. 2003).
25
INTRODUCCIÓN
Actina
Figura I-6. Resumen del mecanismo de activación de la expresión génica y de las defensas celulares
mediadas por 2rf2. Para explicación, véase el texto.
3.2. Regulación de la función de rf2.
Nrf2 no se encuentra libre y activo todo el tiempo, sino únicamente cuando se generan
condiciones de estrés oxidativo. Aun cuando ha sido relativamente sencillo encontrar
niveles constitutivos del ARNm para Nrf2, ha resultado difícil detectar a la proteína
madura, sugiriendo su rápida degradación dentro de la célula. La vida media de Nrf2 es
muy corta y se ha estimado en un tiempo menor de 20 minutos en macrófagos y en
varias líneas celulares. El uso de inhibidores del proteosoma indica que la degradación
de Nrf2 ocurre mediante la vía de ubiquitinación y reconocimiento del proteosoma
(Kobayashi, Kang et al. 2006). Todo parece indicar que la célula sintetiza y degrada a
Nrf2 de manera sistemática, por lo que el control primario de su función radica
principalmente en su estabilización y distribución subcelular, más que en la síntesis de
novo (Kensler, Wakabayashi et al. 2007).
La actividad de la proteína Nrf2 puede ser modulada por modificaciones posttraduccionales como fosforilaciones en serinas y treoninas a través de diversas quinasas
como por ejemplo fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), proteína quinasa C (PKC), la
quinasa del N-terminal de c-Jun (JNK) y la proteína quinasa regulada por señales
extracelulares (ERK). Al parecer, la fosforilación por estas enzimas facilita la
26
INTRODUCCIÓN
disociación de Nrf2 de Keap1 y su posterior translocación. También se ha encontrado
que la proteína quinasa p38 puede tanto activar como inhibir la translocación nuclear de
Nrf2 dependiendo el tipo celular del que se trate (Itoh, Tong et al. 2004). Como
respuesta al estrés oxidativo, la cascada de señalizaciones mediada por PI3K produce la
despolimerización de los microfilamentos de actina, facilitando la translocación nuclear
de Nrf2. Además, PI3K puede también fosforilar a la proteína β de unión al
amplificador CCAAT (C/EBP), que a su vez se transloca al núcleo y se une a la
secuencia CCAAT del elemento de respuesta a xenobióticos (XRE) de manera paralela
a la unión de Nrf2 al elemento ARE, potenciando la respuesta celular (Lee and Johnson
2004). Una vez que Nrf2 ha logrado translocarse al núcleo, puede dimerizar con las
proteínas Maf pequeñas (MafG, MafK y MafF), con las Maf grandes (c-Maf) o con
otras proteínas bZIP tales como c-Fos, Fra1, p45-NF-E2, Bach1 y Bach2.
3.3. Funciones.
La primera evidencia del papel de Nrf2 en la protección contra el estrés oxidativo
proviene del estudio de Venugopal y Jaiswal en 1996 (Venugopal and Jaiswal 1996), en
el que se demostró que la sobreexpresión del ADNc de Nrf2 aumentaba la expresión e
inducción de la NAD(P)H: quinona oxidoreductasa 1 (NQO1) en respuesta a
antioxidantes y xenobióticos. Además, los autores reportaron que Nrf2 regulaba
positivamente a ARE, mientras que c-Fos y Fra1 lo hacían de manera negativa. El papel
de Nrf2 se confirmó cuando se obtuvieron los primeros ratones genéticamente
modificados y carentes de este factor (Nrf2-/-). Estos animales tuvieron un desarrollo
aparentemente normal, por lo que se descartó que Nrf2 fuera esencial para la
eritropoyesis murina, el crecimiento o el desarrollo. No obstante, estos ratones no
podían inducir la expresión de los genes responsables de la destoxificación de agentes
carcinogénicos y de protección contra el estrés oxidativo, en particular los genes de fase
II (Jaiswal 2004). Estudios más recientes han demostrado que Nrf2 también contribuye
a la actividad de proteosoma 26S, con lo cual se confirma la crítica participación de
Nrf2 en la protección contra el estrés oxidativo y los xenobióticos.
Todo el conocimiento generado a partir de la ciencia básica ha convergido en una gran
cantidad de esfuerzos dirigidos a proporcionar nuevas estrategias para prevenir el
27
INTRODUCCIÓN
cáncer. Puesto que las enzimas de fase II, que metabolizan xenobióticos, son las
responsables de la eliminación o inactivación de agentes carcinógenos y otros tóxicos,
una aproximación racional de quimioprotección sería estimular o facilitar la
destoxificación de xenobióticos al aumentar tanto la expresión como la actividad de las
enzimas antioxidantes y de fase II. De esta manera, se ha sugerido que algunos de los
inductores
específicos
de
Nrf2
podrían
funcionar
como
buenos
agentes
quimioprotectores contra ROS y agentes carcinogénicos. Por otra parte, se ha
encontrado una gran cantidad de compuestos, tanto sintéticos como provenientes de la
dieta, que activan de manera eficiente a Nrf2 (Banning, Deubel et al. 2005; Andreadi,
Howells et al. 2006). En este sentido, los inductores endógenos más conocidos que
activan a Nrf2 son las prostaglandinas y el óxido nítrico (NO).
28
INTRODUCCIÓN
4. AD(P)H: quinona oxidoreductasa 1 (QO1).
4.1. Estructura, localización y mecanismo de reacción.
La DT-diaforasa (E.C.1.6.99.2, NAD(P)H: quinona oxidoreductasa; NQO1) (Ernster,
Danielson et al. 1962) es una flavoenzima capaz de reducir quinonas a hidroquinonas a
través de un mecanismo de 2 electrones (Ross, Kepa et al. 2000). NQO1 utiliza
indistintamente NADPH o NADH como donador de electrones y es inhibida
eficientemente por dicumarol (Hosoda, Nakamura et al. 1974). La reducción obligada
de 2 electrones tiene lugar a través de la transferencia de hidruros (H-) desde el
NAD(P)H al FAD y desde el FADH2 a la quinona, no generándose productos
resultantes de la reducción por 1 e-.
La capacidad de NQO1 para catalizar la reducción obligada de las quinonas a través de
un mecanismo de dos electrones hasta las correspondientes hidroquinonas es esencial
para su papel como antioxidante y en la citoprotección frente a sustancias tóxicas, ya
que el mecanismo de reacción de dos electrones evita la generación de intermediarios
semiquinónicos, los cuales son normalmente compuestos inestables con una elevada
tendencia a reaccionar con el oxígeno para producir superóxido (Lind, Cadenas et al.
1990).
NQO1 se encuentra presente en la mayoría de los tejidos de mamíferos, variando sus
niveles de expresión y actividad de unos tejidos a otros y entre las diferentes especies
(Lind, Cadenas et al. 1990; Cadenas, Hochstein et al. 1992; Gutierrez 2000; Jaiswal
2000). Intracelularmente se encuentra localizada principalmente en el citosol, aunque
una pequeña fracción se encuentra asociada a microsomas, mitocondrias, membrana
plasmática y núcleo (Sharkis and Swenson 1989; Lind, Cadenas et al. 1990; Cadenas,
Hochstein et al. 1992; Ross, Kepa et al. 2000; Winski, Koutalos et al. 2002). La fracción
de NQO1 asociada a membranas se incremente ante situaciones de estrés oxidativo, lo
cual podría potenciar la protección antioxidante de estas estructuras (Navarro, Navas et
al. 1998).
29
INTRODUCCIÓN
4.2. Polimorfismos genéticos.
La enzima normal está codificada por el alelo NQO1*1. Un polimorfismo en NQO1,
conocido como NQO1*2, en la posición 609 (C609T) del exón 6 (transición C → T que
conduce a una sustitución prolina por serina en la posición 187 del polipéptido) da lugar
una actividad NQO1 tremendamente disminuida (Traver, Horikoshi et al. 1992). Las
células y tejidos de organismos genotipados como homozigotos para el polimorfismo
NQO1*2 contienen niveles elevados de ARNm de NQO1, pero ninguna actividad o
proteína NQO1 detectable, ya que esta mutación hace que la proteína se degrade
rápidamente por el sistema ubiquitina:proteosoma (Siegel, Anwar et al. 2001). El alelo
NQO1*2 se ha encontrado a frecuencias relativamente elevadas en chinos (0.49),
esquimales (0.46) e indios nativos canadienses (0.40), en comparación con la raza
caucásica (0.16) (Gaedigk, Tyndale et al. 1998).
4.3. Regulación de la expresión.
La expresión basal e inducida de NQO1 se regula principalmente por el factor de
transcripción Nrf2, el cual se une al ARE presente en el promotor del gen !QO1
(Jaiswal 2000). La inducción de su expresión puede deberse a la acción de diversos
genes defensivos en respuesta a situaciones de estrés mediada por xenobióticos,
oxidantes, luz ultravioleta y radiaciones ionizantes (Jaiswal 2004). NQO1 forma parte
de un mecanismo de defensa celular que implica la inducción coordinada de enzimas
destoxificantes como glutatión S-transferasas, UDP-glucuronosil transferasas, etc...
(Lind, Cadenas et al. 1990; Cadenas, Hochstein et al. 1992; Dinkova-Kostova and
Talalay 2000; Jaiswal 2000; Ross, Kepa et al. 2000).
Como se ha mencionado, el ARE es responsable de la expresión basal e inducible de
NQO1 (Favreau and Pickett 1991; Li and Jaiswal 1992), representando un elemento
sensible al H2O2 y antioxidantes fenólicos que sufren reciclado redox. Esta sensibilidad
del ARE a las ROS determina un papel importante en la transducción de señales
involucradas en la respuesta de las células a situaciones de estrés oxidativo (Rushmore,
Morton et al. 1991; Ahlgren-Beckendorf, Reising et al. 1999). Estudios realizados
previamente indican que la regulación de la expresión de NQO1 mediada por ARE tiene
30
INTRODUCCIÓN
lugar por las interacciones entre los factores de transcripción nucleares pertenecientes a
la familia de proteínas bZip: Jun (c-Jun, Jun-B, Jun-D), c-Fos, Fra1, Nrf y Maf, entre
otras, actuando como reguladores positivos o negativos. El papel de la proteína Nrf2 en
la expresión de NQO1 in vivo se ha puesto de manifiesto en los estudios realizados con
ratones mutantes Nrf2-/- donde los niveles constitutivos e inducibles de la
oxidoreductasa fueron inferiores a los presentes en ratones Nrf2+/+ (McMahon, Itoh et
al. 2001).
4.4. Funciones.
NQO1 desempeña funciones tanto antioxidantes como prooxidantes (Lind, Cadenas et
al. 1990; Cadenas, Hochstein et al. 1992; Cadenas 1995; Dinkova-Kostova and Talalay
2000; Gutierrez 2000; Ross, Kepa et al. 2000), además de participar en el
mantenimiento del estado redox intracelular y en otras funciones que comentamos a
continuación (Cross, Deak et al. 1999; Siemankowski, Morreale et al. 2000; Gaikwad,
Long et al. 2001).
4.4.1. Función antioxidante.
El papel antioxidante de NQO1 radica en la capacidad que tiene para reducir quinonas,
mediante la transferencia de dos electrones, generando hidroquinonas. A través de este
mecanismo se evita la formación de semiquinonas y por lo tanto la generación de
radicales superóxido (Lind, Cadenas et al. 1990).
Diversos estudios asignan un papel a NQO1 en la protección antioxidante a través de la
reducción de quinonas endógenas que, en su estado reducido, protegen del daño
oxidativo. Concretamente en liposomas y hepatocitos de rata, cataliza la reducción de
diversos análogos del Coenzima Q (CoQ) para la consecuente generación de ubiquinol
(Beyer, Segura-Aguilar et al. 1996; Landi, Fiorentini et al. 1997). Además, ha sido
postulado un papel adicional en el metabolismo del α- tocoferol (α- TOH), sugiriendo
que NQO1 participa en el mantenimiento de los niveles fisiológicos de este antioxidante
a través de la reducción de α-tocoferonas (Cadenas, Hochstein et al. 1992; Siegel,
Bolton et al. 1997). Este papel de la enzima en la defensa antioxidante se pone de
31
INTRODUCCIÓN
manifiesto en diversos análisis inmunohistoquímicos que muestran cómo la enzima es
expresada en diferentes tejidos humanos en los que es necesaria una protección
antioxidante (Siegel and Ross 2000), así como en individuos que padecen Alzheimer,
una enfermedad asociada a estados de estrés oxidativo, donde se ha detectado un
incremento del número de neuronas que expresan NQO1 (Raina, Templeton et al.
1999). En definitiva, NQO1 juega un papel importante en la respuesta celular a estrés
oxidativo, ya que las ROS inducen la expresión de la proteína NQO1, y esta inducción a
su vez hace que disminuyan las ROS (Jaiswal 2000).
4.4.2. Mantenimiento del estado redox intracelular, regulación de la señalización y
expresión génica.
Diversos estudios realizados sobre la ausencia, sobreexpresión, o inhibición de NQO1
han asignado un papel a este enzima en el mantenimiento del estado redox intracelular.
Así, en estudios realizados con ratones knockout para NQO1 se reveló que la pérdida de
este gen alteraba el estado redox intracelular debido a la acumulación de NAD(P)H, que
es sustrato de NQO1 (Gaikwad, Long et al. 2001). Debido a esta acumulación de
NAD(P)H ocurría una reducción de los niveles de la proteína p53 y un descenso en la
apoptosis. El descenso en la apoptosis, por su parte causó hiperplasia de células
mielocíticas en los ratones carentes de NQO1 (Long, Gaikwad et al. 2002; Iskander,
Paquet et al. 2004; Iskander, Gaikwad et al. 2005).
Por otra parte, se ha demostrado que NQO1 actúa como una chaperona, estabilizando
varias proteínas entre las que se encuentra p53 (Asher, Lotem et al. 2001; Asher, Lotem
et al. 2002; Asher, Lotem et al. 2002; Asher, Lotem et al. 2003; Asher, Lotem et al.
2004; Asher and Shaul 2005; Asher, Tsvetkov et al. 2005). Este fenómeno de
estabilización es dependiente de NAD(P)H (Tsvetkov, Asher et al. 2005). La unión de
NQO1 a p53 ocurre en presencia de NAD(P)H y es inhibida por el dicumarol, un
inhibidor de NQO1, el cual compite con el NAD(P)H (Asher, Tsvetkov et al. 2005). El
dicumarol y otros inhibidores de la actividad NQO1 inducen la degradación de p53
mediante la vía proteosomal e inhiben la apoptosis dependiente de p53 (Asher, Lotem et
al. 2001; Asher, Lotem et al. 2004). Mediante ensayos in vitro se ha encontrado que la
degradación de p53 es debida a la actividad del proteosoma 20S. NQO1 protege la
degradación de p53 por el proteosoma 20S y el dicumarol evita dicha protección (Asher,
32
INTRODUCCIÓN
Tsvetkov et al. 2005). Se ha encontrado que células que sobre expresan NQO1 en
condiciones normales de crecimiento tienen unos elevados niveles de p53 respecto a las
células controles (Asher, Lotem et al. 2002). En concordancia a esto, las células en las
que ha sido silenciado el gen NQO1, reducen sus niveles de p53 (Asher, Lotem et al.
2002). Además, en ratones carentes de NQO1 se ha observado una reducción de los
niveles de la proteína p53 y una disminución de la apoptosis en la médula ósea (Long,
Gaikwad et al. 2002). NQO1 también estabiliza a p53 en diferentes condiciones
fisiológicas. Se sabe que p53 se acumula bajo distintas condiciones de estrés incluyendo
la radiación- γ, estrés oxidativo y bajo exposición a diferentes agentes que dañan el
ADN (Vogelstein, Lane et al. 2000). Se piensa que NQO1 puede jugar un papel
importante en la acumulación de p53 en condiciones de estrés oxidativo. Es más, la
exposición de células al H2O2 hace que se acumule más p53 si estas células
sobreexpresan NQO1 (Asher, Lotem et al. 2002).
NQO1 es requerida para la señalización dependiente de TNFα, ya que la deleción
genética de NQO1 impide la activación de NF-κB, JNK, Akt, p38, y ERK inducida por
TNFα en queratinocitos derivados de ratones en los cuales se ha delecionado el gen
NQO1 (Ahn, Sethi et al. 2006). Este estudio también indicó que la presencia de NQO1
es requerida para la activación del factor nuclear kappa B (NF-kB).
4.4.3. Quimioprevención del cáncer y bioactivación de moléculas antitumorales.
Debido a su participación en la regulación del balance redox intracelular y en el
funcionamiento de rutas de transducción de señales, se ha prestado un gran interés a la
participación de NQO1 en la carcinogénesis. NQO1 tiene una función muy importante
como enzima preventiva contra el cáncer. Además, es una enzima que tiene la
capacidad de destoxificar un gran número de compuestos naturales y sintéticos, aunque
también está implicada en la activación de ciertos agentes anticancerígenos (Benson,
Hunkeler et al. 1980; Talalay and Benson 1982; Talalay, De Long et al. 1988; Talalay,
Fahey et al. 1995).
Se conoce que algunos de los productos metabolizados por NQO1 resultan activados
debido a su inestabilidad química. En algunos casos, las hidroquinonas generadas por la
acción de NQO1 producen, bien por reacción con el oxígeno molecular o por reacciones
33
INTRODUCCIÓN
de dismutación, semiquinonas inestables involucradas en la formación del radical O2.-.
A continuación, dicho radical sirve de especie propagadora para la generación de
nuevas semiquinonas y de H2O2. Además el H2O2 puede originar radicales .OH por
reacción con metales de transición. Tras su oxidación, las quinonas pueden sufrir un
reciclado redox reduciéndose de nuevo a semiquinonas, lo que intensifica el daño
oxidativo provocado por estos compuestos (Lind, Cadenas et al. 1990; Cadenas,
Hochstein et al. 1992; Cadenas 1995; Gutierrez 2000; Ross, Kepa et al. 2000).
4.4.4. Expresión de QO1, control del crecimiento celular y cáncer.
Aunque se han detectado niveles elevados de NQO1 en algunas células tumorales, como
por ejemplo en HeLa, la falta de NQO1 también está asociada con la carcinogénesis
(Bello, Gomez-Diaz et al. 2001; Fagerholm, Hofstetter et al. 2008). Los niveles de
NQO1 son muy elevados en los tumores de la glandula adrenal, colon, pulmón, ovario,
pancreas y tiroides (Siegel and Ross 2000; Strassburg, Strassburg et al. 2002; Lewis,
Ough et al. 2005; Lyn-Cook, Yan-Sanders et al. 2006; Awadallah, Dehn et al. 2008).
Por otra parte, NQO1 se encuentra a niveles muy bajos o incluso nulos en células
leucémica mielocíticas HL-60, así como en algunas células de cáncer de mama, donde
la falta de NQO1 constituye un factor de pronóstico negativo (Beall, Murphy et al.
1995).
Se ha demostrado recientemente que la falta de NQO1 produce una hiperplasia de
células mielocíticas en ratones knockout para este gen (Long, Gaikwad et al. 2002), y su
deleción puede promover la carcinogénesis en la piel (Iskander, Gaikwad et al. 2005) y
una enfermedad mieloproliferativa inducida por radiación (Iskander, Barrios et al.
2008).
En humanos, la deficiencia de NQO1 debida al polimorfismo NQO1*2 se asocia con un
mayor riesgo de leucemia aguda (Smith, Wang et al. 2001). Recientemente, se ha
demostrado que el genotipo NQO1*2 es un fuerte factor predictivo en el cáncer de
mama. El análisis de los mecanismos relacionados con la mayor agresividad de las
células cancerosas de mama que carecen de NQO1 reveló tanto funciones dependientes
34
INTRODUCCIÓN
como independientes de p53. Sin embargo, en este último caso sólo se estudiaron las
funciones bien establecidas de NQO1 como antioxidante y en la regulación de la
señalización dependiente de TNFα (Fagerholm, Hofstetter et al. 2008).
En ratones knockout para NQO1 se ha comprobado que la pérdida de la función de la
proteína está asociada con un incremento en la susceptibilidad de presentar una variedad
de tumores (Long, Waikel et al. 2000; Iskander, Gaikwad et al. 2005; Iskander, Barrios
et al. 2008), estando dicha pérdida acompañada por una reducción de los niveles de p53
(Iskander, Gaikwad et al. 2005; Gong, Kole et al. 2007) y cambios en NF-kB (Ahn,
Sethi et al. 2006).
En el presente trabajo pretendemos abordar el estudio de cómo afecta la falta de NQO1
a los procesos de crecimiento celular, muerte celular, estrés oxidativo y ultraestructura.
A continuación se exponen los objetivos de dicho trabajo.
35
OBJETIVOS
______________________________________________________________________
OBJETIVOS
El objetivo principal del presente trabajo es estudiar el papel de NQO1 y de Nrf2 en la
regulación del crecimiento de células animales mediante abordaje genético (células
obtenidas de animales knockout). Para ello nos planteamos varios objetivos específicos:
-
Obtención de líneas celulares de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) que
sean knockouts para NQO1 o para Nrf2, el principal factor de transcripción
responsable de la expresión de esta reductasa.
-
Estudiar el proceso de senescencia e inmortalización celular de dichas células
respecto a los controles.
-
Investigar si la ausencia de NQO1 produce una alteración en el crecimiento
celular en MEFs.
-
Estudiar si la falta de NQO1 o de Nrf2 afecta al estrés oxidativo y a algunas
enzimas antioxidantes importantes.
-
Estudiar las modificaciones en la expresión de proteínas que se producen como
consecuencia de la falta de NQO1, utilizando un abordaje proteómico.
-
Detectar y analizar posibles modificaciones estructurales y ultraestructurales
inducidas por la falta de NQO1 o de Nrf2.
39
MATERIAL Y MÉTODOS
______________________________________________________________________
MATERIAL Y MÉTODOS
1. Obtención y manejo de cultivos primarios de fibroblastos embrionarios de
ratón.
Los animales fueron mantenidos en el Servicio de Experimentación Animal de la
Universidad de Córdoba (ratones silvestres C57BL/6 o black 6) y en el Laboratory of
Experimental Gerontology (NIA, NIH) (silvestres y “knockouts”). Los cultivos de
fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) normales (wt) y knockouts NQO1-/- y Nrf2-/se obtuvieron a partir de fetos diseccionados de ratones hembra en el día 13 post coito.
Las hembras preñadas se sacrificaron por dislocación cervical, se diseccionó el útero, se
lavó rápidamente en etanol 70% y se puso en una placa de Petri con solución salina de
Hank. Una vez extraídos, los embriones se decapitaron y se les extirparon los órganos
internos; se lavaron para eliminar toda la sangre posible, se trocearon y disociaron en
una solución de tripsina-EDTA (1-2 ml por embrión). Los trozos de tejido sin disgregar
se eliminaron y la suspensión celular se lavó con 2 volúmenes de medio fresco. Después
de centrifugar, la pella celular se resuspendió en medio de cultivo (DMEM
suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 10,000
unidades/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina, 25 µg/ml de anfotericina B y
0.2 % de glucosa) y se sembró un embrión por placa de 10 cm de diámetro. Este se
consideró el pase nº 0. El medio se cambió a las 24 h, siendo los fibroblastos las únicas
células que se adhirieron a la superficie de cultivo. La confluencia se alcanzó a los
pocos días.
2. Obtención de líneas inmortalizadas.
Siguiendo el protocolo de subcultivos para las células 3T3 se desarrollaron las líneas
inmortalizadas de MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/- (Todaro and Green 1963).
Las células fueron mantenidas a 37 ºC en el medio de cultivo descrito anteriormente en
el apartado 1, en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2. Las células fueron
sembradas en botellas de 75 cm2 a 4,000 células viables/cm2 y se hicieron subcultivos
cada 3 días, nunca dejando que las células llegasen a 100 % de confluencia.
43
MATERIAL Y MÉTODOS
La congelación de los MEFs se llevó a cabo en el medio de congelación (10% DMSO
en medio completo de MEFs) en criotubos (1 ml por criotubo). Las células se
congelaron a –80 ºC y al día siguiente se pasaron a nitrógeno líquido.
La descongelación de los MEFs se realizó rápidamente en un baño a 37 ºC.
Inmediatamente tras su descongelación, las células se lavaron con unos pocos ml de
medio de MEFs para eliminar por completo el DMSO y se sembraron en botellas.
3. Análisis de la viabilidad celular.
La viabilidad celular se estudió a través del método de exclusión del azul tripán. El azul
tripán es un colorante de exclusión utilizado en recuentos de viabilidad celular. El
fundamento de este análisis se basa en que las células vivas, que conservan la integridad
de su membrana plasmática, expulsan activamente el colorante, mientras que las células
muertas son totalmente permeables quedando incorporado en su citoplasma. Para
determinar la viabilidad, se mezcló a partes iguales una alícuota procedente del cultivo
celular con una de solución de azul tripán. Posteriormente, se tomó una muestra que fue
depositada en un hemocitómetro y con la ayuda de un microscopio invertido Nikon
TMS se pudo observar que las células muertas aparecían teñidas de azul y las vivas
mantenían su coloración blanco-amarillenta habitual. Para determinar la viabilidad en
los MEFs, fue necesario separarlos previamente de la superficie de las placas
incubándolas durante 5 minutos con una solución de Tripsina-EDTA.
4. Determinación del número de duplicaciones de las distintas líneas celulares.
Las células se sembraron a una densidad de 4,000 células /cm2 y cada tres días se
determinó el número de duplicaciones. El número de duplicaciones con cada pase se
calculó a partir de la fórmula log(Nf/Ni)/log2, donde Nf es el número final de células
tras el pase, y Ni es el número inicial de células viables sembradas.
44
MATERIAL Y MÉTODOS
5. Obtención de fracciones citosólicas y membranosas.
Los MEFs de los distintos genotipos fueron separados de la superficie de la placa con
una solución de Tripsina-EDTA. Para la obtención de estas fracciones inicialmente se
recogieron entre 2 y 10 millones de células mediante centrifugación a 500 x g durante 5
min. A continuación, las células fueron lavadas en las mismas condiciones de
centrifugación previas con Tris (hidroximetil) aminometano-HCl (Tris-HCl) 130 mM,
pH 7.6, ácido etilén-diamino-tetraacético (EDTA) 1mM, ditiotreitol (DTT) 0.1 mM y
fluoruro de fenil-metil-sulfonilo (PMSF) 1 mM. La pella de células se resuspendió en
un volumen de un tampón hipotónico [Tris-HCl 10 mM a pH 7.6, EDTA 1 mM, DTT
0.1 mM, PMSF 1 mM y 20 µg/µl de cada uno de los inhibidores de proteasas:
quimostatina, leupeptina, antipaína y pepstatina A (CLAP)]. La rotura celular se llevó a
cabo a 4 ºC durante 1 min con un homogeneizador vidrio-teflón. Para restablecer la
concentración osmótica, se añadió un volumen del tampón Tris-HCl 250 mM, pH 7.6
conteniendo EDTA 1 mM, DTT 0.1 mM, PMSF 1 mM y 20 µg/µl de cada uno de los
inhibidores de proteasas (CLAP) descritos anteriormente. Los lisados se centrifugaron
de nuevo durante 5 min a 500 x g y la pella, constituida por células enteras y restos
celulares de gran tamaño, fue descartada. El sobrenadante se centrifugó a 100.000 x g
durante 30 min. El resultado fue la obtención de un precipitado correspondiente a la
fracción membranosa donde se determinaron los niveles de expresión de citocromo b5
reductasa (b5R) y un sobrenadante correspondiente a la fracción citosólica para el
estudio de la actividad NQO1. Tanto a la fracción membranosa como al citosol se le
determinó la cantidad de proteína según el método de Bradford que se explica más
adelante, en el apartado 7.
6. Lisis celular para la determinación de proteínas mediante inmunoblotting.
Para la determinación de la expresión de proteínas en los MEFs se usó un protocolo de
rotura celular con el tampón de homogeneización “RIPA buffer” (Tris-HCl 50 mM a pH
8; NaCl 150 mM; deoxicolato al 0.5 %; SDS al 0.1 %; DTT 1 mM; Tritón X-100 al 1 %
y 20 µg/µl de cada uno de los inhibidores de proteasas (CLAP)) de modo que, a partir
de los extractos obtenidos, pudimos determinar tanto proteínas nucleares como de
membrana.
45
MATERIAL Y MÉTODOS
La extracción se realizó a partir de 10 x106 células que fueron centrifugadas a 500 x g
durante 5 min. Posteriormente, las células fueron lavadas con PBS y centrifugadas de
nuevo en las condiciones anteriores. La pella de células fue resuspendida en 250 µl de
“RIPA buffer”. Tras agitar durante 15 segundos, se centrifugó a 10,000 x g durante 15
min a 4 ºC. Al sobrenadante así obtenido, correspondiente al citosol, nucleoplasma y
proteínas de membrana, se le llevó a cabo la determinación de la cantidad de proteína
según el método de Bradford que se explica a continuación en el apartado 7.
7. Determinación de la cantidad de proteína.
Para todas las muestras en las que fue necesario analizar la cantidad de proteína, el
método usado fue el descrito por Stoscheck (1990) (Stoscheck 1990), basado en el
método clásico de Bradford, aunque con ligeras modificaciones. Una alícuota (hasta 20
µl) de la muestra cuya cantidad de proteína queríamos determinar se mezcló con 50 µl
de NaOH 1 N y a continuación se añadió 1 ml de reactivo de Bradford. Transcurridos
10 min de incubación, la densidad óptica se midió a 590 nm en un espectrofotómetro
Beckman DU-640 UV-visible. La cantidad de proteína fue calculada a partir de una
recta patrón realizada previamente con γ- globulina.
8. Actividad enzimática QO1.
La actividad NQO1 se determinó en las fracciones citosólicas libres de material
membranoso obtenidas por ultracentrifugación a 100,000 x g durante 30 minutos (como
se ha explicado en el apartado 5) a partir del método descrito por Lind et al. (1990)
sobre la base de la sensibilidad que muestra la enzima al dicumarol. El ensayo se realizó
a 37 ºC con agitación constante y en presencia de Tris-HCl 50 mM a pH 7.2, 70 µg de
proteína citosólica, Triton X-100 al 0.08 %, menadiona 10 µM, citocromo c 77 µM,
NADH 0.5 mM y FAD 1 µM en un volumen final de 1 ml. Todos los ensayos se
realizaron tanto en presencia como en ausencia de dicumarol 10 µM. La reducción del
citocromo c fue analizada a 550 nm en un espectrofotómetro Beckman DU-640 UVvisible y la actividad fue calculada como la diferencia en la tasa de reducción obtenida
46
MATERIAL Y MÉTODOS
-1
-1
con y sin dicumarol. Un coeficiente de extinción de 18.5 mM cm fue utilizado para el
cálculo de las actividades específicas (Lind, Cadenas et al. 1990).
9. Análisis de expresión génica mediante RT-PCR a tiempo real.
El ARN total de los MEFs control y NQO1-/- se obtuvo utilizando el sistema de
aislamiento de ARN Tripure (Roche), siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Partiendo de 2.5 µg de ARN total y utilizando un kit de PCR y transcripción reversa
(Fermentas) se sintetizó el ADN complementario. De ese ADN complementario se
tomó 1 µl para su amplificación por PCR. Los oligonucleótidos utilizados para detectar
la expresión de NQO1 se describen a continuación:
NQO1- sentido: 5’-CCATTCTGAAAGGCTGGTTTG-3’
NQO1- antisentido: 5’-CTAGCTTTGATCTGGTTGTC-3’
Los productos de la reacción que se producen son de 487 pb para NQO1. Las
condiciones de la PCR fueron las siguientes: 2 minutos a 94 ºC, 40 ciclos de: 15
segundos a 94 ºC, 15 segundos a 57 ºC y 15 segundos a 72 ºC, y finalmente 1 minuto a
72 ºC.
Los productos amplificados se cargaron en un gel de agarosa al 2% (Cambrex) en
tampón TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA1 mM) con 0.5 µg/ml de bromuro de etidio.
También mediante PCR quisimos demostrar que las células NQO1-/- eran konockouts
para NQO1, dicha demostración queda ilustrada en la figura M-1. El genotipo knockout
de las células carentes de Nrf2 utilizadas se verificó por el Dr. R. de Cabo en el
Laboratory of Experimental Gerontology mediante análisis RT-PCR (de Cabo,
comunicación personal).
47
MATERIAL Y MÉTODOS
1
2
3
4
5
Figura M-1. Demostración de que las células 2QO1-/- son knockouts para 2QO1. PCR para
demostrar que las células NQO1-/- son knockouts para NQO1. Calle 1: marcador, calle 3: MEFs control
donde se observa la banda correspondiente a NQO1, calle 5: células NQO1-/- en donde no se observa la
banda correspondiente a NQO1.
10. Análisis de proliferación celular mediante incorporación de [metil-3H]
timidina.
Este método se fundamenta en la incorporación al ADN de la timidina marcada
radiactivamente en aquellas células que se encuentran en la fase S del ciclo celular. Las
células fueron incubadas con [metil-3H] timidina (Amersham Pharmacia Biotech) a una
concentración de 0.25 µCi/ml durante 24 horas. A continuación, las células fueron
lavadas con NaCl 0.9 % y tratadas con ácido tricloroacético al 5 % (Merck) durante 30
minutos a 4 ºC. El sobrenadante fue descartado y las células lisadas con NaOH 0.1 N
(Panreac) durante 1 hora y 30 min en agitación y a temperatura ambiente.
Una alícuota (400 µl) de los lisados fue mezclada con 4 ml de líquido de centelleo
(Cocktail Biogeen 1, Scharlau). La cantidad de [metil-3H] timidina incorporada en el
ADN se determinó en un contador de centelleo líquido Beckman LS 6000TA y fue
referida al número de células (cpm x 1,000-1 células).
48
MATERIAL Y MÉTODOS
11. Análisis de los niveles de ROS.
Las especies reactivas de oxígeno se determinaron mediante citometría de flujo en los
cultivos de MEFs obtenidos de ratones control, NQO1-/- y Nrf2-/-. Para la determinación
de ROS, las células fueron incubadas con la sonda de diacetato de 2’,7’diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) que permitió conocer los niveles intracelulares
de peróxidos (Oyama, Hayashi et al. 1994).
La DCFH-DA es un compuesto no fluorescente que, una vez incorporado por las
células, es hidrolizado por esterasas para generar 2’,7’-diclorodihidrofuoresceína
(DCFH). Este compuesto reacciona con los peróxidos para generar 2’,7’diclorofluoresceína (DCF) que emite fluorescencia verde. Así, para estudiar los niveles
de ROS, las células fueron incubadas con el fluorocromo durante 20 min a 37 ºC y en
oscuridad. La concentración final fue de 10 µg/ml de la sonda DCFH-DA, a partir de la
solución madre (DCFH-DA 10 mg/ml) preparada en dimetilsulfóxido (DMSO, Merck).
Tras la incubación con el fluorocromo, las células fueron separadas de la superficie de
las placas con una solución de Tripsina-EDTA. A continuación, un volumen de 1 ml
procedente de los cultivos fue transferido a un tubo para la determinación de ROS en un
citofluorímetro de flujo Coulter EPICS X L, donde el fluorocromo fue excitado con
láser de argón a 488 nm y la longitud de onda de emisión fue 525 nm.
12. Análisis del ciclo celular.
La determinación del número de células apoptóticas y en las diferentes fases del ciclo
celular (G1, S, G2/M) se realizó por citometría de flujo. Esta técnica se fundamenta en
que el yoduro de propidio se intercala estequiométricamente entre las bases de los
ácidos nucleicos y emite fluorescencia roja proporcional a la cantidad de ADN. De este
modo se pueden identificar cuatro grupos entre las células de la población estudiada: un
primer grupo donde se encuentran las células apoptóticas con un contenido de ADN
sub-diploide, un segundo grupo correspondiente a las células en fase G1 con un
contenido 2c, un tercer grupo donde las células se encuentran en G2/M con el doble de
cantidad de ADN que la población anterior (4c), y por último un cuarto grupo donde las
células se encuentran en fase de replicación y por tanto aparecen en el histograma
49
MATERIAL Y MÉTODOS
ocupando una posición intermedia entre los dos grupos anteriores. Para la realización
del estudio, 5 x 105 células se recogieron por centrifugación a 500 x g durante 5 min.
Las células se fijaron con 1.5 ml de etanol al 70 % (Merck), donde fueron mantenidas
durante al menos 24 h a 4 ºC. Tras la fijación, las células se centrifugaron de nuevo a
500 x g durante 5 min a 4 ºC y se lavaron dos veces con solución salina de Hank
(Sigma) mediante resuspensión y posterior centrifugación a 500 x g (durante 5 min cada
una de ellas y a una temperatura de 4 ºC). Tras los lavados, la pella de células se
resuspendió en 1 ml de tampón de tinción de ADN (PBS 10 mM a pH 7.4, Tritón X-100
al 0.1 %, EDTA 0.1 mM, RNAsa-A (libre de ADNasas) 50 µg/ml y yoduro de propidio
50 µg/ml) durante 30 min en oscuridad y a temperatura ambiente. Finalmente, las
células fueron transferidas a un tubo de citofluorímetro para el análisis de la
fluorescencia tras la excitación con láser de argón a 488 nm. La longitud de onda de
emisión para el yoduro de propidio fue 590 nm.
Para cuantificar el tanto por ciento de la población que se encuentra en cada fase se
utilizó el programa Cyclhred (Universidad de Cardiff), que aplica el algoritmo de
Watson para determinar la distribución (Watson, Chambers et al. 1987).
13. Determinación de los marcadores de senescencia p21CIP1 y p53.
13.1. SDS-PAGE y electrotransferencia.
Se utilizaron extractos celulares totales que se habían obtenido mediante rotura celular
con el “RIPA buffer”, usando 50 µg de proteína para p21CIP1 y 100 µg para p53. Estas
muestras fueron resuspendidas en tampón de carga 5X (SDS al 7.5%, DTT 0.1 M,
EDTA 10 mM, Tris-HCl 0.3 M a pH 6.8, sacarosa al 50% (p/v), Azul de Bromofenol
0.5 mg/ml), con PMSF 100 mM y 20 µg/µl de CLAP. Las muestras se incubaron 5 min
a 100 ºC. La separación de las proteínas se realizó en geles de poliacrilamida al 15 % [5
ml de Sepparating Buffer 2X (18.71 g de Tris, 0.4 g de SDS y se ajusta pH a 8.8), 3.75
ml de acrilamida/bisacrilamida 29:1 40% (w/v), 1.25 ml de agua, 50 µl de persulfato
amónico (APS) al 10%, 10 µl de TEMED] para p21 y para p53, y de 1.5 mm de
espesor.
Para separar las proteínas en función de su tamaño, se realizó una
electroforesis en gel de SDS poliacrilamida (Laemmli, Beguin et al. 1970). Se utilizó el
50
MATERIAL Y MÉTODOS
sistema de electroforesis Miniprotean (BioRad), que nos permite trabajar con pequeños
volúmenes de muestra y manipular con mayor facilidad los geles a la hora de realizar la
transferencia a las membranas.
Posteriormente, las proteínas separadas fueron transferidas a membrana de nitrocelulosa
para proceder a la tinción con anticuerpos específicos. La transferencia se llevó a cabo a
25 V; 0.25 A constantes durante 45 minutos mediante transferencia semiseca. Una vez
finalizada, la membrana de nitrocelulosa se tiñó con una solución de Rojo Ponceau al
0.1% en ácido acético al 1% para comprobar que la transferencia había sido correcta y
para visualizar el conjunto de bandas.
13.2. Inmunotinción y revelado por quimioluminiscencia.
Las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas durante 1 hora (2 x 30 min) con
TTBSL (Tris-HCl 50 mM a pH 7.6, NaCl al 0.85 %, Tween 20 al 0.05 %, Leche en
polvo (BioRad Laboratories) al 5 %). A continuación, fueron incubadas durante 16
horas a 4ºC con los anticuerpos primarios específicos (ver tabla M-1) para cada una de
las proteínas estudiadas diluidos en TTBSL. Previamente a la adición del anticuerpo
secundario, las membranas fueron lavadas (3 x 5 min) con TTBS (Tris-HCl 50 mM a
pH 7’6, NaCl al 0.85 %, Tween 20 (Merck) al 0.05 %) e incubadas durante 1 hora con
un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (Transduction
Laboratories) (ver tabla M-1) diluido en TTBSL. Posteriormente, las membranas se
lavaron 3 x 5 min con TTBS y durante 10 min con TBS (Tris-HCl 50 mM a pH 7.6,
NaCl (Panreac) al 0.85 %). Una vez inmunoteñidas, las membranas fueron incubadas
con ECL + plus (Amersham Pharmacia Biotech) durante 5 min y colocadas en una
casete (HypercassetteTM, Amersham LIFE SCIENCE) para la exposición de placas
radiográficas Kodak X-OMAT. El revelado se realizó usando técnicas de fotografía
convencionales.
Salvo que se indique lo contrario, todos los pasos se realizaron con agitación suave y a
temperatura ambiente.
51
MATERIAL Y MÉTODOS
Los análisis densitométricos utilizados para determinar los niveles de expresión de las
proteínas estudiadas se llevaron a cabo con un densitómetro GS800 y el programa
informático de análisis Quantity One (BioRad).
14. Ensayos para determinar la presencia de senescencia celular. Tinción SA-βGalactosidasa lisosomal a pH 6.0.
La tinción SA-β-Galactosidasa (Senescence Associated β-galactosidase) es un ensayo
histoquímico utilizado para la detección de células senescentes in vivo. Está basado en
la medida de la actividad de la enzima β-galactosidasa lisosomal a pH 6.0 de las células.
La enzima β-galactosidasa ácida, se localiza en los lisosomas de las células eucariotas y
es activo a pH 4.0. La β-galactosidasa lisosomal es capaz de procesar el sustrato X-gal a
pH 4.0, formándose precipitados azules en el interior de las células (Dimri, Lee et al.
1995). Las células senescentes sufren un incremento, tanto en la masa lisosomal como
en la cantidad de enzima β-galactosidasa lisosomal, de modo que son capaces de
procesar el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indoil β-D-galactopiranósido (X-Gal) al pH
subóptimo de 6.0. (Kurz, Decary et al. 2000). La tinción SA-β-gal permite discriminar
células senescentes (positivas para la tinción SA-β-gal a pH 4.0 y 6.0) del resto de
células (únicamente positivas para la tinción a pH 4.0).
Las células obtenidas en los diferentes pases se sembraron en placas “multiwell” de 6
pocillos, se lavaron con PBS estéril, se fijaron con solución de fijación (2% de
paraformaldehído, 0.2% de glutaraldehído, PBS 1X) durante 3 minutos a temperatura
ambiente, y se volvieron a lavar con PBS estéril. A continuación se añadió la solución
de tinción SA-β-gal (1 mg de sustrato X-Gal por cada ml, ferrocianuro potásico 5 mM,
ferricianuro potásico 5 mM, NaCl 150 mM, y Mg2Cl 2 mM, en tampón citrato/fosfato
40 mM, pH 6.0) en un volumen suficiente para cubrir las células. La incubación en la
solución de tinción SA-β-gal se llevó a cabo durante 16 horas a 37 ºC, tras lo cual se
observaron las células en un microscopio de contraste de fases.
Debido a la inestabilidad del sustrato X-Gal y de las soluciones de ferrocianuro y de
ferricianuro potásico, la solución de tinción SA-β-gal se preparó fresca para cada
utilización.
52
MATERIAL Y MÉTODOS
15. Determinación de marcadores de complejo de Golgi y de endosomas tardíos:
GM 130, KDEL R, sintaxin6 y Rab7.
La determinación de estos marcadores se realizó mediante inmunoblot, siguiendo el
protocolo descrito en el apartado 13. Se utilizaron geles al 12.5% de acrilamida para
GM130 y KDEL R y al 15% para sintaxin6 y Rab7. La cantidad de lisado celular
utilizado fueron 50 µg para las 4 proteínas. Los anticuerpos que se utilizaron se pueden
ver en la tabla M-1.
16. Actividad catalasa.
La actividad se determinó en los lisados celulares obtenidos según se ha descrito
anteriormente en el apartado 6. El ensayo (1 ml) se realizó a 37 ºC con agitación
constante en un tampón fosfato potásico 50 mM a pH 7 conteniendo H2O2 10 mM y en
presencia o ausencia de 35 µg de proteína. La tasa de oxidación química mostrada en
ausencia de muestra fue sustraída de la actividad enzimática obtenida. La
descomposición del H2O2 se analizó a 240 nm en un espectrofotómetro Beckman DU640 UV-visible utilizando un coeficiente de extinción de 43.6 mM-1cm-1 para el cálculo
de las actividades específicas.
17. Determinación de los niveles de Sirt 1.
SIRT1 es una enzima que contribuye a la regulación celular (reacción a factores de
estrés y longevidad). La determinación de Sirt1 se realizó mediante inmunoblot,
siguiendo el protocolo del apartado 13. Se utilizaron geles al 7.5 % de acrilamida y se
cargó 50 µg de proteína. El anticuerpo que se utilizó puede verse en la tabla M-1.
18. Determinación de los niveles de expresión de b5R (citocromo b5 reductasa).
A partir de las fracciones membranosas obtenidas según se indica en la sección 5, 40 µg
de proteína fueron resuspendidos en tampón de carga. Para evitar la agregación de las
proteínas de membrana las muestras no se calentaron a 100 ºC durante 5 minutos sino
53
MATERIAL Y MÉTODOS
que, una vez mezcladas con el tampón de carga, se calentaron durante 15 minutos a 40
ºC y fueron separadas en un gel de poliacrilamida al 12.5 % para ser posteriormente
transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Para la visualización de la proteína total
en cada una de las carreras, la membrana se tiñó con Rojo Ponceau. El exceso de
colorante fue retirado lavando con solución de ácido acético al 1 %.
La expresión de la b5R, se estudió a nivel de proteína por inmunotinción y revelado con
fosfatasa alcalina según el protocolo descrito por Navarro (1998) (Navarro, Navas et al.
1998). Una vez visualizada la proteína con Rojo Ponceau, se procedió al bloqueo
durante 1h (2 x 30 min) con tampón TTBSL. Posteriormente añadimos el anticuerpo
policlonal anti-citocromo b5 reductasa desarrollado en conejo frente a la enzima
purificada de la membrana plasmática de hígado de cerdo (Navarro, Villalba et al.
1995), diluido a una concentración 1/1,000 en TTBSL. La incubación se realizó durante
16 h a 4 ºC. A continuación, la membrana se lavó con TTBS (3 x 5 min), y se añadió el
anticuerpo anti-IgG de conejo desarrollado en ratón y conjugado con fosfatasa alcalina a
una concentración 1/5,000. Tras la incubación con el anticuerpo secundario (1 hora), la
membrana se lavó 3 x 5 min con TTBS, 10 min con TBS y 2 x 5 min con tampón para
fosfatasa alcalina (Tris-HCl 0.1 M a pH 9; NaCl 0.1 M; Cl2Mg 5 mM). El revelado se
realizó en oscuridad añadiendo los sustratos correspondientes para fosfatasa alcalina
[6.6 µl de azul de nitrotetrazolio (NBT) al 5 % y 3.3 µl de 5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato (BCIP, Boehringer Mannheim) al 5 % en 1 ml de tampón para fosfatasa
alcalina]. El producto obtenido permitió visualizar y cuantificar la densidad de reacción
obtenida para el polipéptido que fue referida a la densidad de reacción obtenida para el
Ponceau.
Todos los pasos descritos se realizaron con agitación suave y salvo que se indique lo
contrario, a temperatura ambiente.
19. Determinación de las ciclinas: A y E.
La determinación de las ciclinas A y E se realizó mediante inmunoblot, siguiendo el
protocolo del apartado 13. Se utilizaron geles al 10 % de acrilamida y se cargaron 20 µg
54
MATERIAL Y MÉTODOS
para la ciclina A y 50 µg para la ciclina E. Los anticuerpos que se utilizaron se pueden
ver en la tabla M-1.
20. Análisis proteómico.
Este análisis incluyó secuencialmente la preparación de las muestras para análisis
proteómico utilizando tampón de extracción, la separación de proteínas mediante
electroforesis bidimensional, con una primera separación por isoelectroenfoque de alta
resolución, que separaría las proteínas en función de su carga eléctrica (primera
dimensión), seguida de una segunda electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia
de SDS, que separa las proteínas según su masa molecular (segunda dimensión). Tras la
tinción de los geles (Sypro Ruby), procedimos a su análisis densitométrico mediante el
software “PDQuest” (BioRad). Esta tecnología se utilizó para detectar aquellas
proteínas que experimentaron alteraciones en cuanto a sus niveles de expresión en
función del genotipo celular. Finalmente, procedimos a identificar las proteínas de
interés mediante espectrometría de masas. Una vez seleccionadas las proteínas, éstas se
separaron de los geles y se sometieron a fragmentación para obtener péptidos que
fueron analizados por espectrometría de masas (MALDI-TOF) en la Unidad de
Proteómica de los Servicios Centralizados de Apoyo de la Investigación (SCAI) de la
Universidad de Córdoba. Con ello, y tras la correspondiente comparación en las bases
de datos, se consiguió la identificación de las proteínas analizadas. A continuación se
ofrece una descripción más detallada de la metodología empleada para el análisis
proteómico.
20.1. Solubilización de las proteínas.
Se partió de 10 x 106 MEFs, que se centrifugaron a 1,500 rpm a 4 ºC durante 5 minutos
y se lavaron con PBS 1X dos o tres veces. Las proteínas se extrajeron con 600 µl de
solución de solubilización (Urea 5M, Tiourea 2M, DTT 65 mM, CHAPS al 4%, y
anfolitos 3/10 al 0.2%)
en agitación durante 15 segundos. Tras la extracción de
proteínas, los lisados se centrifugaron a 14,300 rpm a 4 ºC durante 8 minutos, se
recogieron los sobrenadantes y se mantuvieron en hielo mientras se llevaba a cabo la
55
MATERIAL Y MÉTODOS
determinación de proteínas mediante el método Bradford. Tras la determinación de
proteína se le añade el azul de bromofenol a una concentración final de 0.0002%.
20.2. Isoelectroenfoque (IEF).
Las proteínas son moléculas anfóteras que en función del pH pueden tener carga neta
positiva o negativa. El punto isoeléctrico (pI) se define como el valor de pH en el cual la
carga neta de la proteína es nula. Al aplicar un campo eléctrico a un extracto de
proteínas, éstas se mueven hacia el electrodo con carga opuesta a la carga neta de la
proteína. Si las proteínas están disueltas en un soporte con un gradiente de pH entre los
electrodos, las proteínas se moverán hasta el punto donde su carga neta sea cero, es
decir se pararán en el punto donde su pH = pI. El isoelectroenfoque (IEF) aprovecha el
carácter anfótero de las proteínas para separarlas en función de su pI en un gradiente de
pH.
El IEF de los extractos totales de proteínas se realizó en tiras de 17 cm de longitud con
un rango de pH 3-10 NL (no lineal). La separación se realizó tras aplicar 300 µg del
extracto de proteína total (contenido en 300 µl de tampón de solubilización con azul de
bromofenol) en los carriles de la cubeta dónde posteriormente se colocó la tira de
acrilamida. Se dejó aproximadamente una hora hasta que la tira hubo absorbido toda la
muestra. A continuación se añadió aceite mineral sobre las tiras y se dejaron
rehidratando toda la noche. A continuación se realizó el IEF a una Tª de 20 ºC con las
siguientes condiciones:
Paso Voltaje (V) Tipo de gradiente Duración Voltios-hora
1
500 V
Subida rápida
1h
2
1,000 V
Subida rápida
1h
3
10,000 V
Subida lineal
30 min
4
10,000 V
Subida rápida
55,000 V/h
5
500 V
Subida rápida
24 h
-
Una vez finalizado el proceso de IEF, las tiras se congelaron a -80 ºC hasta el momento
de la separación de las proteínas en función de su peso molecular.
56
MATERIAL Y MÉTODOS
20.3. Segunda dimensión o electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes
(SDS-PAGE).
Después de IEF, las proteínas se separan en función de su peso molecular mediante el
SDS-PAGE, en lo que se denomina la segunda dimensión. Este proceso requiere de la
polimerización de geles, el equilibrado de las tiras y la separación electroforética. Los
geles de poliacrilamida se prepararon al 12 %.
Para una buena separación de las proteínas según su peso molecular es necesario tratar a
las proteínas enfocadas con agentes desnaturalizantes como el SDS, que al mismo
tiempo que desnaturaliza y despliega las proteínas se une a ellas de forma proporcional
a su peso molecular dotándolas de carga negativa; con agentes reductores como el DTT
que se encarga de reducir los puentes disulfuro; y con agentes alquilantes como la
iodoacetamida (IAA) que alquilará los grupos SH reducidos anteriormente y evitará su
posterior oxidación. Estos tratamientos constituyen la fase de equilibrado de las
muestras (Poon, Castegna et al. 2004).
Después de descongelar las tiras enfocadas, éstas se equilibraron primero durante 15
minutos en agitación con 4 ml de un tampón de equilibrado (50 mM Tris-HCl a pH 8.8,
6M de urea, SDS al 2%, glicerol al 20%) conteniendo 20 mg/ml de DTT y a
continuación se equilibraron durante 15 minutos en agitación con 4 ml del mismo
tampón de equilibrado pero sustituyendo el DTT por 25 mg/ml de IAA.
La separación de las proteínas en función de su PM se realizó con el sistema de BioRad
y la temperatura se mantuvo a 10 ºC. Las tiras equilibradas se lavaron con tampón de
“carrera” o Running Buffer 1X y se situaron sobre la superficie de los geles. A
continuación, en el extremo de la tira se colocó un aplicador impregnado con 4 µl de
marcador de peso molecular (BioRad) que se usó como referencia para determinar la
movilidad electroforética de las proteínas en el gel, y el conjunto se selló con agarosa al
0.5%. Posteriormente, se colocaron los geles en la cubeta de electroforesis y se añadió
el tampón de “carrera” al 1X en la cubeta. La separación electroforética se realizó en
una etapa de 45 minutos a 30V seguida de otra etapa de 70V hasta su finalización.
57
MATERIAL Y MÉTODOS
20.4. Tinción con Sypro Ruby.
La visualización de las proteínas en los geles se realizó mediante la tinción con Sypro
Ruby. El proceso de tinción de los geles consiste en una primera etapa de fijación con
una solución del 10 % de metanol y 7 % de ácido acético glacial durante un período
mínimo de 30 minutos en la cual se inmovilizan las proteínas en los geles y se eliminan
la glicina, el Tris, el SDS y los anfolitos que podrían interferir en el proceso de tinción.
Tras la fijación, se quita el fijador y se le añade el Sypro Ruby. Esta tinción se dejó en
agitación y en oscuridad hasta el día siguiente.
Una vez finalizada la tinción se quitó el Sypro Ruby y se destiñieron los geles con una
solución al 10 % de metanol y 7 % de ácido acético glacial durante un período mínimo
de 30 minutos. Tras la destinción se lavaron los geles con agua en oscuridad y en
agitación durante 2 días.
20.5. Análisis de imagen.
Los geles teñidos se escanearon con el densitómetro GS800 a una resolución de 100 ppi
y se almacenaron en formato tiff. Los geles se guardaron en agua miliQ a 4ºC dentro de
una bolsa para su posterior uso. Para el análisis de imagen se utilizó el programa
informático de análisis PDQuest (BioRad).
20.6. Identificación de las proteínas separadas en geles de poliacrilamida mediante
técnicas de espectrometría de masas.
La identificación de las proteínas fue realizada por el SCAI (Servicio Centralizado de
Apoyo a la Investigación) de la Universidad de Córdoba. La identificación de proteínas
separadas en geles de poliacrilamida consta de varios pasos. En primer lugar las
proteínas se digieren in situ y a continuación los péptidos de digestión se extraen y se
analizan
mediante
MALDI-TOF-TOF
para
determinar
su
peso
molecular.
Posteriormente se realizó la búsqueda en bases de datos utilizando el programa
MASCOT.
58
MATERIAL Y MÉTODOS
20.7. Validación de proteínas mediante Western blot.
Las proteínas para las cuales se observaron cambios significativos, se validaron
mediante western blot tal como se ha explicado en el punto 13 de Material y Métodos.
Estas proteínas fueron: elfin, transgelina y GRP75. Se utilizaron geles al 12.5 % de
acrilamida para Elfin y Transgelina y al 5 % para GRP75. La cantidad de lisados
celulares utilizados fueron 30 µg para Elfin y 20 µg para Transgelina y GRP75. Los
anticuerpos que se utilizaron pueden verse en la tabla M-1.
Anticuerpos Dilución Casa
primarios
de uso
comercial
Características
del anticuerpo
primario
anticuerpo
monoclonal
Mouse IgG
Anti-p53
1/500
Oncogene
Anti-p21
1/600
Santa Cruz
anticuerpo
Biotechnology polyclonal
Rabbit IgG
Anti- Bcl-2
1/800
BD
Pharmigen
Anti-Bax
1/200
Santa Cruz
anticuerpo
Biotechnology monoclonal
Mouse IgG
Anti-GM
130
1/250
BD
Biosciences
anticuerpo
monoclonal
mouse IgG
Anti-KDEL
R
1/250
Stressgen
anticuerpo
monoclonal
mouse IgG
Anti-
1/5000
BD
Biosciences
anticuerpo
monoclonal
mouse IgG
sintaxin6
anticuerpo
polyclonal
Rabbit IgG
Anticuerpo Dilución Casa
secundario de uso
comercial
Antimouse
IgG
conjugado
con
peroxidada
Antirabbit
IgG
conjugado
con
peroxidada
Antirabbit
IgG
conjugado
con
peroxidada
Antimouse
IgG
conjugado
con
peroxidada
Antimouse
IgG
conjugado
con
peroxidada
Antimouse
IgG
conjugado
con
peroxidada
Antimouse
IgG
conjugado
con
peroxidada
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
59
MATERIAL Y MÉTODOS
Anti-rab7
1/200
Santa Cruz
Anticuerpo
Biotechnology polyclonal
Rabbit
Anti-Sirt1
1/200
Santa Cruz
Anticuerpo
Biotechnology polyclonal
Rabbit
AntiCiclina A
1/200
Santa Cruz
Anticuerpo
Biotechnology polyclonal
Rabbit o Goat
AntiCiclina E
1/200
Santa Cruz
Anticuerpo
Biotechnology polyclonal
Rabbit
Anti-CLIM1
o Elfin
1/1000
Abcam
AntiTransgelina
1/1000
Santa Cruz
anticuerpo
Biotechnology polyclonal Goat
IgG
Anti-GRP75
1/900
Abcam
anticuerpo
polyclonal Goat
IgG
Anticuerpo
polyclonal
Rabbit IgG
Antirabbit
IgG
conjugado
con
peroxidasa
Antirabbit
IgG
conjugado
con
peroxidasa
Antirabbit
IgG
conjugado
con
peroxidasa
Antirabbit
IgG
conjugado
con
peroxidasa
Antigoat
IgG
conjugado
con
peroxidada
Antigoat
IgG
conjugado
con
peroxidada
Antirabbit
IgG
conjugado
con
peroxidasa
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
1/2000
Sigma
Tabla M-1. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados. En esta tabla se recogen los anticuerpos
primarios y secundarios utilizados, las concentraciones utilizadas de estos y la casa comercial.
60
MATERIAL Y MÉTODOS
21. Estudio ultraestructural y estructural.
Este análisis se realizó en las distintas líneas de células (MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/) para observar las posibles alteraciones subcelulares ocasionadas por la falta de NQO1
y Nrf2.
21.1. Técnicas de microscopía electrónica de transmisión.
Las células se prefijaron 5 minutos añadiendo glutaraldehido 25% al medio de cultivo
hasta alcanzar una concentración del 2.5 %. Posteriormente se rasparon y se
transfirieron a tubos eppendorfs, se centrifugaron y se descartaron los sobrenadantes.
Tras la prefijación se realizó una fijación con paraformaldehído-glutaraldehído al 2 %2.5 % en tampón cacodilato 0.1 M durante 10 minutos a temperatura ambiente y a
continuación durante 2 horas a 4 ºC. Después de la fijación se hicieron 3 lavados de 5
minutos cada uno con tampón cacodilato 0.1 M. Posteriormente se realizó una
postfijación con tetróxido de osmio al 0.4 % en tampón cacodilato durante 1 hora a 4
ºC. Se realizaron 3 lavados de 5 minutos con tampón cacodilato 0.1 M y luego se llevó a
cabo una deshidratación en una serie ascendente de etanoles (50º, 70º, 90º y 100º),
dejando las células 15 minutos en cada paso, excepto en el ultimo, para el cual se dieron
3 baños de 15 minutos. A continuación las muestras se incluyeron en una resina
sintética EMbed 812 (que sustituye al tradicional Epon 812) para microscopia
electrónica.
La resina completa consta de 4 componentes: el propio EMbed, que es el medio de
inclusión; DDSA, que confiere plasticidad; MNA, que confiere dureza y DMP-30, que
actúa como acelerador de la polimerización. Las proporciones de cada uno fueron las
aconsejadas por el fabricante (EMS, U.K.).
Antes de la infiltración las muestras se lavaron 2 veces durante 15 minutos con óxido de
propileno y posteriormente fueron incubadas en una mezcla de resina-óxido de
propileno (1:1) durante 2 horas y con resina-óxido propileno (2:1) toda la noche a 4ºC.
Tras esto se renovó la resina y las muestras se introdujeron en una estufa a 60-65 ºC
hasta la polimerización (entre 24 y 48 horas).
61
MATERIAL Y MÉTODOS
Una vez obtenidos los bloques se obtuvieron cortes ultrafinos (40-80 nm de grosor) con
un ultramicrotomo (Ultracut, Reichter), que fueron contrastados con acetato de uranilo
al 2% durante 5 minutos y citrato de plomo de Reynold durante 5-8 minutos. Las
secciones fueron observadas y fotografiadas en un microscopio electrónico de
transmisión Philips CM-10 en las instalaciones del SCAI de la Universidad de Córdoba.
21.2. Técnicas de microscopía electrónica de barrido.
Para esta técnica se sembraron las células sobre cubreobjetos estériles. Las células se
lavaron con tampón cacodilato 0.1 M y se fijaron durante 1 hora con una solución de
glutaraldehído al 2.5 % y paraformaldehído al 2 % en tampón cacodilato 0.1M a pH 7.2.
Tras la fijación fueron lavadas 3 veces con el tampón cacodilato 0.1 M y luego lavadas
con agua estéril. Se realizó una deshidratación con concentraciones crecientes de
acetona: 50º, 70º, 90º y 100º durante 10 minutos en cada una de ellas. A continuación en
el SCAI se realizó el desecado al punto crítico, colocación de las muestras sobre
soportes de microscopio de barrido utilizando cemento conductor y el recubrimiento
metálico con oro en atmósfera de Argón. Por último se visualizaron y fotografiaron las
células en un microscopio electrónico de barrido (JEOL JSM 6300) en las instalaciones
del SCAI de la Universidad de Córdoba.
22. Estudio de la arquitectura del citoesqueleto de actina.
Para este estudio se utilizó el marcado con faloidina conjugada con el fluoróforo verde
Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Las células, sembradas sobre cubreobjetos estériles en
placas multiwells de 6 pocillos, se lavaron tres veces con PBS, se fijaron con
formaldehído al 3.7 % durante 10 minutos, se volvieron a lavar dos veces con PBS y se
dejaron 15 minutos con Tritón X-100 al 0.3%. Tras su permeabilización con este
detergente, las células se volvieron a lavar tres veces con PBS y en cada pocillo de 9
cm2 se añadieron 5µl de una solución stock de faloidina (el contenido del vial disuelto
en 1.5 ml de metanol según las indicaciones del fabricante) en 200 µl de PBS durante
20 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Pasada la incubación se lavaron las
células de nuevo con PBS y se procedió al montaje de las muestras. En cada
cubreobjetos se añadió una gota de medio de montaje (glicerol:PBS en proporción 1:1),
62
MATERIAL Y MÉTODOS
se colocó el cubre sobre el porta, se le retiró el exceso de medio y se procedió con el
sellado con laca de uñas. Una vez montadas las muestras se procedió a observarlas en
un Microscopio confocal Espectral TCS-SP2-AOBS, Leica en el SCAI de la
Universidad de Córdoba. Se empleó un láser de Argón emitiendo a 488-514 nm. Las
imágenes obtenidas en el microscopio confocal fueron procesadas para su observación
seriada utilizando el software ImagenJ (N-I-H-H, USA).
23. Transfección de las células QO1-/-.
Las células NQO1-/- fueron transfectadas con el vector pRC/CMV-NQO1, cedido por el
Dr. Sartorelli (Yale University School of Medicine, New Haven), elaborado a partir del
vector comercial pRC/CMV de Invitrogen (el cual se observa en la figura M-2). Este
vector contiene el origen de replicación del virus SV40 y un gen de resistencia a
neomicina para posterior selección de células transfectadas. El ADNc de NQO1 de rata
fue cedido por el Dr. Gerald L. Forrest (Beckman Research Institute) y fue clonado
entre dos sitios Hind III (Robertson, Chen et al. 1986; Forrest, Qian et al. 1990).
La amplificación del plásmido se realizó en bacterias E.coli competentes que fueron
transformadas con el plásmido pRC/CMV-NQO1.
Figura M-2. Vector comercial pRc/CMV.
63
MATERIAL Y MÉTODOS
23.1. Preparación de bacterias competentes.
Lo primero fue inocular las células de Escherichia coli DH5α en una placa de Petri con
medio PSI-a, procediéndose entonces a incubarse toda la noche a 37 ºC. Al día siguiente
se inocularon 5 ml de medio PSI-b con una colonia aislada y se incubó a 37 ºC hasta
alcanzar una densidad óptica de 0,3 a 600 nm. Tras esto, se usó el cultivo anterior para
inocular 100 ml de medio PSI-b en un matraz de 1 litro precalentado a 37ºC y se incubó
a 37 ºC hasta alcanzar una densidad óptica de 0,48 a 550 nm. Después se enfrió el
matraz durante 5 minutos en hielo y posteriormente se recogieron las células por
centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 ºC. Tras la centrifugación se
resuspendió el pellet en 40 ml de TFB-1 frío y se incubó 5 minutos en hielo. Las células
se recogieron entonces por centrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 ºC, se
resuspendieron en 4 ml de TFB-2 y se mantuvieron en hielo durante 15 minutos. Tras
esto, se distribuyeron en fracciones alícuotas, que se congelaron a –80 ºC o en nitrógeno
líquido.
Las soluciones usadas para el proceso de preparación de células competentes son:
Soluciones
Composición
Medio PSI-a Extracto de levadura 5 g/l
Triptona 20 g/l
MgSO4 5 g/l
Ajustar el pH a 7.6 con KOH.
Añadir 14 g/l de agar.
Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
Medio PSI-b Medio PSI-a sin agar.
TFB-1
TFB-2
64
Acetato potásico 30 mM
KCl 100 mM
CaCl2 10 mM
MnCl2 50 mM
Glicerol 15% v/v
Ajustar el pH a 5.8 con ácido acético 0.2 M, esterilizar
por filtración y almacenar en frío.
MOPS 10 mM
CaCl2 75 mM
KCl 10 mM
Glicerol 15% v/v
Ajustar el pH a 6.5 con KOH, esterilizar por filtración y
Almacenar en frío.
MATERIAL Y MÉTODOS
23.2. Transformación de E.coli.
Se transformaron 100 µl de bacterias competentes añadiendo 5 µl de ADN plasmídico e
incubando durante 20 min en hielo, 90 seg a 42 ºC y por último 2 min en hielo. Una vez
las bacterias habían sido transformadas, se añadió 4 volúmenes de medio LB sin
antibiótico respecto al volumen de células competentes utilizadas. Transcurridos 1 hora
en agitación a 37 ºC, se centrifugaron las bacterias y se sembraron 40 µl de bacterias en
placas de LB Agar con el antibiótico ampicilina. Se incubaron las placas a 37 ºC toda la
noche para permitir el crecimiento de las colonias de células transformadas.
23.3. Purificación del plásmido.
Una colonia de E.coli fue diluida en 2.5 ml de medio LB líquido con ampicilina.
Después de crecer en agitación durante 16 horas a 37 ºC, finalmente, se procedió a la
purificación del plásmido según el protocolo descrito en Plasmid Extraction Kit
(Bioneer), siguiendo las recomendaciones del fabricante. La concentración y pureza de
la preparación de plásmido se determinó con un espectrofotómetro midiendo la
absorbancia de la muestra a 260 nm y a 280 nm.
23.4. Transfección de los MEFs.
El método de transfección utilizado para las células knockouts NQO1-/- fue el kit
Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se sembraron en placas multiwells de 12
pocillos y crecieron durante 24 horas en medio sin antibiótico. A continuación se
lavaron las células con PBS. La mezcla final de la transfección se preparó en dos
mezclas iniciales (solución A y solución B). Para preparar la solución A se añadió 1.6
µg de ADN en 100 µl de opti-MEM. Paralelamente, la solución B se preparó añadiendo
4 µl de Lipofectamina en 100 µl de opti-MEM. Tanto la solución A como la B se
incubaron por separado durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se
mezclaron y se incubó durante 20 minutos. Finalmente se añadió la mezcla a las células
y se incubaron durante 6 horas en el incubador a 37 ºC en una atmósfera humidificada
con un 5 % de CO2. Al cabo de 6 horas, se cambió el medio de transfección por DMEM
completo con antibiótico. Como control se realizó una transfección con el plásmido
vacío paralelamente a la transfección con el plásmido con el gen NQO1 inserto.
65
MATERIAL Y MÉTODOS
Transcurridas 48 horas, se seleccionaron aquéllas que habían incorporado el plásmido
mediante la adición del antibiótico G418 sulfato (geneticina) (Calbiochem), análogo de
la neomicina. Las células se mantuvieron con medio selectivo por la adición de
antibiótico a una concentración final de 350 µg/ml. A las 48 horas, una semana y dos
semanas de transfección se recogieron las células para los correspondientes
experimentos.
66
RESULTADOS Y DISCUSIÓ
______________________________________________________________________
Capítulo 1: Crecimiento celular
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
Además de su bien conocida función antioxidante, NQO1 es una enzima que interviene
en el mantenimiento del estado redox intracelular, habiéndose implicado también en el
control del crecimiento y la muerte celular (Cross, Deak et al. 1999; Siemankowski,
Morreale et al. 2000; Asher, Lotem et al. 2001). Debido a esto, se inició una línea de
trabajo para investigar el mecanismo por el cual NQO1 participa en la regulación del
crecimiento celular, en la proliferación y en la regulación del ciclo, así como su posible
participación en la regulación del establecimiento de la senescencia replicativa. Para
ello hemos trabajado con fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) control, así como
con dos líneas de MEFs knockouts para NQO1 y Nrf2, respectivamente. Los cultivos se
realizaron siempre en condiciones de alta densidad celular, excepto cuando se indique lo
contrario.
1. ¿Afecta la falta de QO1/fr2 a la senescencia e inmortalización de los MEFs?
En primer lugar, quisimos determinar, si la falta de NQO1 o de Nrf2 afectaba el patrón
de senescencia e inmortalización de los MEFs sometidos a un protocolo de subcultivos
3T3. Para ello determinamos el número de duplicaciones en los distintos pases de los
cultivos, tal como explicamos en el apartado 4 de “Material y Métodos”.
Como se observa en la figura R-1A, el crecimiento de los MEFs control fue estable
durante los primeros cuatros pases, situándose alrededor de una duplicación por pase. A
continuación, entre los pases 5 y 8 encontramos una detención del crecimiento. A partir
del pase 8 la tasa de crecimiento se incrementó de nuevo, llegando a duplicarse el
cultivo alrededor de 3 veces por pase a partir del 20, indicando la inmortalización de la
línea celular. Para nuestro estudio, consideramos como células inmortalizadas las
obtenidas a partir del pase 15. La aparición de la senescencia entre los pases 5 y el 8, y
la inmortalización a partir del 15-20, concuerda con los resultados obtenidos por otros
autores en el mismo tipo celular (Debidda, Williams et al. 2006; Kilbey, Blyth et al.
2007; Leal, Fominaya et al. 2008).
71
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
Nº duplicaiones [log(Nf/Ni)/log(2)]
3,5
A
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
-0,5 0
5
10
-1
15
20
MEFs control
Pases
-1,5
NQO1-/-
Nº duplicaiones [log(Nf/Ni)/log(2)]
NRF2-/5
B
4
3
2
1
0
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
Pases
Figura R-1. Senescencia e inmortalización en MEFs control, 2QO1-/- y 2rf2-/-. El número de
duplicaciones (eje Y) se representa en función de los pases (eje X). El número de duplicaciones se
determinó mediante la fórmula log(Nf/Ni)/log(2) (ver apartado 4 del “Material y Métodos”). Los
resultados corresponden a la media ± SD de tres cultivos independientes cómo mínimo, llegando algunas
a realizarse hasta con 8 cultivos independientes. A) Los fibroblastos NQO1-/- muestran una inhibición
temprana del crecimiento, pero una inmortalización normal. Sin embargo, las células Nrf2-/- muestran una
activación temprana del crecimiento, con una inhibición aparente de la senescencia. B) Las células
NQO1-/- morían sobre el pase 80, los MEFs control sobre el pase 65 y los Nrf2-/- sobre el pase 55.
Tanto en las células NQO1-/- como en las Nrf2-/- se observó una peor respuesta a la
descongelación, observándose una disminución del crecimiento en el pase 1. La
eliminación genética de NQO1 provocó un período prolongado de menor crecimiento,
aunque la inmortalización del cultivo tuvo lugar de manera normal. Sin embargo, los
MEFs Nrf2-/- recuperaron rápidamente su capacidad de crecimiento en el pase 2
mostrando una activación temprana del crecimiento y una inhibición aparente de la
senescencia. Ello podría indicar que Nrf2 es necesario para el establecimiento de la
senescencia replicativa en los MEFs.
72
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
De acuerdo con los resultados publicados por otros autores, el efecto de la deficiencia
de Nrf2 sobre el crecimiento de cultivos celulares primarios, parece depender del
contexto celular. Así, se ha observado que la falta de Nrf2 afectó a la progresión de
células epiteliales alveolares tipo II a lo largo del ciclo celular (Reddy, Kleeberger et al.
2007). Por otra parte, se ha observado que las células epiteliales de riñón carentes de
Nrf2 eran capaces de proliferar, aunque su velocidad de crecimiento fue más baja que la
de los controles (Reddy, Kleeberger et al. 2007). Así mismo, resultan llamativas las
observaciones de Reddy et al (2007a), quienes mostraron que, a diferencia de las células
alveolares de tipo II aisladas de animales Nrf2-/- (las cuales mostraron una disminución
del crecimiento, comparado con los controles), los cultivos de MEFs de los mismos
animales proliferaban más rápido que sus correspondientes células control. Aunque
estos autores no ofrecen información sobre los pases en los cuales fueron obtenidas las
células utilizadas, sus resultados podrían estar en concordancia con nuestra observación
de que los MEFs Nrf2-/- crecen más rápido que los controles sobre los pases 5-10.
Otro hecho llamativo que observamos a partir de los resultados mostrados en la figura
R-1B, es que los MEFs control tenían un crecimiento regular hasta el pase 62, con más
de 3 duplicaciones por pase. Sin embargo, el límite de proliferación de los controles se
encontró en el pase 64, a partir del cual el cultivo no pudo continuar su crecimiento. En
cambio, las células NQO1-/- tuvieron un límite de proliferación más tardío, en el pase
80, y las Nrf2-/- un límite más temprano, en el pase 55. Por tanto, la falta de NQO1
alargó la vida de los cultivos, mientras que la falta de Nrf2 la acortó.
Además de su propensión a la inmortalización, las células Nrf2-/- mostraron un
acortamiento de la vida a lo largo del tiempo del cultivo, indicando que la función de
Nrf2 es necesaria para el mantenimiento de la viabilidad celular después de largas
exposiciones a factores de estrés. Se conoce que el factor de transcripción Nrf2
constituye uno de los más importantes mecanismos de defensa celular contra el estrés
oxidativo. Por ello, es razonable pensar que el cultivo Nrf2-/- muere antes que los
controles debido a que experimenta un mayor estrés oxidativo de manera sostenida, que
trae consigo una acumulación de mutaciones que, al final, hace inviable la duplicación
celular. Este proceso de acumulación de mutaciones debidas a dicho estrés y que afecta
a la inviabilidad de la duplicación celular también ocurre en los controles, pero tiene
lugar con más rapidez en los MEFs Nrf2-/- debido a su defecto en los mecanismos de
73
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
defensa contra el estrés, como se ha mencionado. De hecho, en cultivos primarios de las
células epiteliales obtenidas de ratones knockout Nrf2-/- la disrupción genética de Nrf2
induce estrés oxidativo y lesiones en el DNA, lo cual se ve acompañado de defectos en
la progresión a lo largo del ciclo debido a la inhibición de la señalización inducida por
GSH (Reddy, Kleeberger et al. 2008).
Al contrario de lo observado en los MEFs Nrf2-/-, las células NQO1-/- mostraron un
alargamiento de la vida a lo largo del tiempo del cultivo. Este hecho, en principio
inesperado, podría ser debido a una diferencia a nivel de metabolismo celular que afecte
a la longevidad del cultivo. Como veremos más adelante, las mitocondrias están
afectadas en los MEFs NQO1-/- y según nuestro estudio proteómico (ver capítulo 3 de
resultados), se observan incrementos en la proteína glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
(que puede estar relacionada con la protección antioxidante). Es posible que las células
NQO1-/- estén usando menos la respiración mitocondrial, y más un metabolismo
glicolítico, que genera menos especies reactivas (Nohl, Kozlov et al. 2003). Este efecto
ha sido observado en muchas células tumorales (“glucolisis aerobia” o “efecto
Warburg”), y está considerado como un mecanismo protector que permite una elevada
tasa de duplicación celular con menor estrés oxidativo (Dang and Semenza 1999;
Semenza, Artemov et al. 2001; Cuezva, Krajewska et al. 2002; Cuezva, Chen et al.
2004; Isidoro, Martinez et al. 2004). De acuerdo con esta idea, se ha publicado
recientemente que la eliminación genética de la glutatión transferasa mGSTA4, una
enzima clave en la destoxificación de productos derivados de la peroxidación lipídica,
paradójicamente resulta en el incremento de la longevidad de los correspondientes
ratones knockout (Singh, Niemczyk et al.). Aunque los mecanismos implicados en esta
extensión de la longevidad no hayan sido aún caracterizados completamente, se ha
observado que en estos animales tiene lugar una activación de Nrf2, en una especie de
respuesta “hormética”, a través de la cual un estímulo oxidante (en este caso la falta de
mGsta4) desencadena una respuesta antioxidante de mayor envergadura que, en última
instancia, supone una mejora en la protección celular (Singh, Niemczyk et al.). El
mecanismo a través del cual la eliminación genética de NQO1 resulta en una extensión
de la longevidad celular de los MEFs podría estar basado en un concepto similar.
Como se ha indicado anteriormente, el aumento de los niveles de p53 y de la expresión
de genes dependientes de este supresor tumoral son marcadores de senescencia en los
74
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
MEFs, habiéndose establecido firmemente que la senescencia replicativa de las células
de ratón se basa en una respuesta al daño en el ADN dependiente de p53 y relacionada
con una situación de estrés oxidativo (Sherr and DePinho 2000). También está
demostrado que la inmortalización de los MEFs se debe principalmente a una pérdida
de la función de p53 (Sherr and DePinho 2000; Dirac and Bernards 2003). Debido a
esto nos pareció interesante analizar varios marcadores de senescencia como p53 y p21
en las tres líneas celulares objeto de nuestro estudio.
Como puede observarse en la figura R-2, en los MEFs control observamos una fuerte
inducción de p53 en el pase 9, coincidiendo con la detención del crecimiento. A partir
de ahí, la expresión se perdió en el pase 16, coincidiendo con la inmortalización del
cultivo. Los niveles de p21 también alcanzaron los niveles máximos en el pase 9 y
decrecieron en el pase 16. En los MEFs NQO1-/- los niveles de p53 y de p21
permanecieron altos durante los primeros pases y luego se redujeron sensiblemente en el
16. Estos resultados podrían explicar el período de menor crecimiento y la
inmortalización normal. Por su parte, en los MEFs Nrf2-/- se observaron unos niveles
muy bajos de p53 en todos los pases, estando también considerablemente disminuidos
los de p21 en comparación con los controles. Esto podría indicar que la eliminación
genética de Nrf2 puede estar directamente relacionada con una función defectuosa de
p53 lo cual explica la temprana inmortalización de las células Nrf2-/-.
U n id ad es A rb itrarias (A .U .)
p53
Rojo Ponceau
2
66 KDa
1,5
45 KDa
36 KDa
1
29 KDa
24 KDa
0,5
20 KDa
0
P.4
P.9
P.16
MEFs control
P.4
P.9
NQO1 -/-
P.16
P.4
P.9
P.16
Nrf2 -/-
75
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
p21
Rojo Poncea u
Unidades Arbitrarias (A.U.)
12
66 KDa
45 KDa
36 KDa
10
8
29 KDa
24 KDa
6
20 KDa
4
2
0
P.4
P.9
P.16
MEFs control
P.4
P.9
NQO1 -/-
P.16
P.4
P.9
P.16
Nrf2 -/-
Figura R-2. Determinación de los supresores de tumores p53 y p21. Se determinaron los niveles de
dichas proteínas mediante western blot (ver apartado 13 de “Material y Métodos”) utilizando como
control de carga proteica la tinción con rojo Ponceau. Ambas proteínas tuvieron una fuerte inducción en
el pase 9 en las células control, disminuyendo a partir del pase 16. En las células NQO1-/- se observó una
inducción de ambas proteínas en los pases más tempranos, disminuyeron igualmente a partir del pase 16.
Por su parte, en las células Nrf2-/- se observaron unos niveles muy bajos de ambas proteínas en todos los
pases.
Se ha sugerido que la senescencia replicativa puede ser un mecanismo celular de
respuesta al estrés relacionada con la supresión de tumores (Campisi 2000), y con el
deterioro fisiológico asociado al envejecimiento (Smith and Pereira-Smith 1996). De
este modo, la senescencia replicativa puede haberse seleccionado (al menos en
mamíferos) para proteger al organismo contra neoplasias en etapas tempranas de la
vida, antes y durante la reproducción. Se sabe que p53 regula una respuesta celular
como punto de control frente a las señales oncogénicas y que muta con una alta
frecuencia en muchos tipos de tumores, lo que implica que su acción es crucial en el
desarrollo tumoral (Harris and Hollstein 1993). La inactivación de un supresor de
tumores como p53 produce transformación celular, evitando de esta manera los
mecanismos de control que inducen senescencia. El papel de p53 como supresor
tumoral quedó demostrado por el hecho de que ratones que carecían de este gen se
desarrollaban de forma normal, pero presentaban tumores a una temprana edad (Irwin
and Kaelin 2001). En este trabajo hemos observado que los MEFs Nrf2-/- no presentan
una senescencia aparente, o que este período es anormalmente breve, lo que sugiere que
los mecanismos intracelulares que regulan la respuesta a las señales oncogénicas están
alterados en estas células.
Otro hecho que nos llamó la atención fue que las células NQO1-/- inmortalizadas crecían
más y las Nrf2-/- menos rápidamente respecto a los controles, tal como se puede
76
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
observar en la figura R-3. Estos datos se obtuvieron con células inmortalizadas a partir
del pase 20. Aunque la inmortalización de las células NQO1-/- tuvo lugar de manera
normal, observamos una desregulación significativa del crecimiento de las células
inmortalizadas. Los MEFs NQO1-/- mostraron un leve pero estadísticamente
significativo aumento en la tasa proliferativa, caracterizado por un mayor número de
duplicaciones en cada pase. En cambio los MEFs Nrf2-/- mostraron una leve pero
también significativa disminución del número de duplicaciones.
***
N º d u p licaio n es [lo g (Nf/N i)/lo g (2)]
*
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
MEFs control inmortalizados
NQO1-/- inmortalizados
NRF2-/- inmortalizados
Figura R-3. 2úmero de duplicaciones en los MEFs control, 2QO1-/- y 2rf2-/- inmortalizados. Se
siguió un control del crecimiento celular de los 3 cultivos durante el período de inmortalización. Este
experimento corresponde a la media ± SD utilizando una n=142 para las células MEFs control, una n=118
para las NQO1-/- y una n=94 para los Nrf2-/-. Cuando se comparan los MEFs NQO1-/- con los controles se
observa cómo la falta de NQO1 hace que el crecimiento sea significativamente mayor (p < 0.05). Cuando
comparamos los MEFs Nrf2-/- con los controles se observa lo contrario: los Nrf2-/- tienen un crecimiento
menor ( p < 0.001).
Ya que la tinción histoquímica para la actividad SA β-galactosidasa se considera un
marcador bien establecido de senescencia (ver anteriormente), procedimos a realizar un
estudio comparativo de este parámetro en los MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/- obtenidos
de distintos pases. Además de asociarse con unos niveles mayores de p53 y de p21
(Figura R-2), la detención del crecimiento de los MEFs control en los pases 5-8
coincidió con la inducción de la SA β-galactosidasa (Figura R-4).
77
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
MEFs P.8
MEFs P.30
NQO1
-/-
NQO1
P.2
-/-
P.39
Nrf2
-/-
Nrf2
P.12
-/-
P.39
Figura R-4. Tinción histoquímica de la actividad SA-β-galactosidasa. La tinción SA-β-Gal permite
discriminar las células senescentes del resto de células. En el cultivo de MEFs Nrf2-/- se observaban
células teñidas de azul en todos los pases, incluso en el período de inmortalización, a diferencia de los
cultivos de MEFs control y NQO1-/- en los cuales se observaban células teñidas de azul sólo en el período
de senescencia pero no en el período de inmortalización.
Al realizar el ensayo de la SA-β-galactosidasa, tanto en los cultivos de MEFs control
como en los NQO1-/-, observamos células teñidas de azul en los pases correspondientes
a la senescencia, mientras que en los pases correspondientes al período de
inmortalización no se observó dicha tinción. Sorprendentemente, en los MEFs Nrf2-/observamos que las células se teñían en azul en todos los pases, incluso en aquellos
posteriores al 20.
Ya que la actividad de la SA-ß-galactosidasa se deriva del aumento del contenido
lisosomal de las células senescentes, nos propusimos estudiar varias proteínas que
intervienen a distintos niveles en el proceso de transporte de vesículas del complejo de
Golgi, con la hipótesis de que la falta de Nrf2 podría estar afectando al compartimento
lisosomal. Se ha establecido que Nrf2 regula la expresión de varias subunidades
proteosomales en ratón (Kapeta, Chondrogianni et al.). Por ello, la existencia de una
deficiencia en la degradación proteosomal en las células carentes de Nrf2 podría estar
relacionada, al menos parcialmente, con la posible inducción de enzimas hidrolíticas
lisosomales, lo que explicaría los incrementos de la SA-β-galactosidasa en los MEFs
78
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
Nrf2-/-proliferantes como hemos observado en nuestro estudio. De acuerdo con esta
idea, determinamos mediante western blot los niveles de las proteínas GM 130, KDELR, Sintaxin 6 y Rab 7 (Figura R-5) en las células MEFs control y Nrf2-/-. Como se puede
observar en la figura R-5, los niveles de todas estas proteínas marcadoras estaban
disminuidas en los MEFs Nrf2-/- respecto a los controles.
En nuestros experimentos de determinación de niveles de expresión mediante western
blot hemos utilizado siempre como control de carga la tinción de los blots con el rojo
Ponceau. Aunque la determinación de los niveles de β-actina es bastante usada como
control de carga, se ha demostrado que la medición de una proteína abundante puede no
ser fiable para este tipo de análisis (Dittmer and Dittmer 2006).
KDEL R
GM 130
9
Densidad de
reacción específica
Densidad de
reacción específica
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
Densidad de
reacción específica
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Densidad de
reacción específica
Rab 7
Sintaxin 6
0,16
0,14
0,12
MEFs
Nrf2-/-
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Figura R-5. Determinación mediante western blot de las proteínas GM 130, KDEL-receptor,
Sintaxin 6 y Rab 7. Como control de carga se utilizó el rojo Ponceau y las condiciones son las descritas
en el apartado 15 de material y métodos. Se observó una fuerte disminución de las proteínas GM 130 ,
KDEL-R, Sintaxin 6 y Rab 7 en las células Nrf2-/- respecto a los controles. Los resultados son
representativos de al menos dos experimentos independientes.
79
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
GM130 es una proteína del complejo de Golgi, localizada en la región cis. Esta proteína
interviene en el transporte vesicular y en el mantenimiento de la estructura del Golgi, en
la glicosilación de proteínas, así como en el ciclo, polaridad y migración celular. Se ha
demostrado que una menor expresión de la proteína GM 130 lleva a una disminución
del ratio de proliferación, afectando a la progresión del ciclo celular en G2-M de manera
dependiente de p53. También se sabe que GM 130 juega un papel importante en la
formación del eje bipolar durante la mitosis (Kodani and Sutterlin 2008). La
disminución de GM 130 observada en los MEFs Nrf2-/- coincide con que estas células
presentan menor proliferación que los controles. Sin embargo, en nuestro caso los
mecanismos implicados deben ser independientes de p53 ya que, como hemos indicado
anteriormente, la función de este supresor tumoral se pierde con la inmortalización
celular de los MEFs, particularmente en aquéllos carentes de Nrf2.
KDEL-receptor es una proteína transmembrana localizada en el complejo de Golgi que
tiene una función básica en la regulación del tráfico vesicular entre este orgánulo y el
retículo endoplásmico (Lewis and Pelham 1990; Girod, Storrie et al. 1999). Se ha
mostrado que KDEL-receptor participa en la respuesta al estrés en el retículo
endoplasmático aumentando la activación de las MAPK, lo cual afecta al éxito de esta
respuesta (Yamamoto, Hamada et al. 2003). La disminución de expresión de esta
proteína en las células Nrf2-/-, podría indicar fallos en la respuesta frente al estrés. Este
hecho es consistente con la hipótesis de que los MEFs Nrf2-/- pueden no poseer un buen
mecanismo de respuesta al estrés, acumulando más mutaciones, e incidiendo por tanto a
largo plazo en una menor longevidad del cultivo.
Sintaxin 6 es una proteína integral de membrana tipo II localizada en la red trans Golgi
(TGN) y parcialmente junto con la AP-1 en las membranas recubiertas de clatrina. Esta
proteína media el tráfico vesicular desde la TGN hacia los endosomas (Bock,
Klumperman et al. 1997). Se ha demostrado que la existencia de unos niveles bajos de
Sintaxin 6 inhibe intensamente la proliferación e induce la muerte celular. Más aún, se
ha postulado que Sintaxin 6 es un efector de la familia de p53 en la regulación de la
adhesión celular y la supervivencia. (Zhang, Shu et al. 2008). Estos resultados son
compatibles con la disminución del crecimiento en células Nrf2-/- descrita en la Figura
R-3 aunque, al igual que lo indicado anteriormente para GM130, los mecanismos
implicados deben ser independientes de p53.
80
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
Rab7 (Chavrier, Parton et al. 1990) es una proteína de la familia de las GTPasas que se
localiza en los endosomas tardíos y está involucrada en la regulación del transporte
entre endosomas tardíos y lisosomas. Rab7 controla varios aspectos de la endocitosis
tardía en células de mamíferos (Feng, Press et al. 1995; Press, Feng et al. 1998; Fan,
Lapierre et al. 2003). Además, ha sido demostrado que Rab7 tiene un papel fundamental
en la regulación de factores de crecimiento celulares y apoptosis (Snider 2003). Por otra
parte, se ha comprobado que una mutación o disfunción de Rab7 resulta en un desorden
del tráfico, lo cual está relacionado con varias enfermedades, como neuropatías, cáncer
y enfermedades del metabolismo lipídico. La inhibición de la función de Rab7 produce
fragmentación lisosomal, promoviendo la transformación in vitro (Edinger, Cinalli et al.
2003). Ya que Rab7 regula factores de crecimiento celulares y la apoptosis, su
disminución en los MEFs Nrf2-/- podría estar también relacionada con su menor
velocidad de crecimiento.
En resumen, la disminución en los marcadores de compartimentos intracelulares
estudiados es acorde con la menor velocidad de crecimiento de los MEFs Nrf2-/-, y
apunta hacia una significativa alteración del sistema de endomembranas en estas células
lo cual posiblemente está relacionado con la tinción anómala para la SA-ßgalactosidasa.
81
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
2. Recuperación de QO1 mediante transfección.
Para comprobar si las alteraciones observadas en los MEFs NQO1-/- eran debidas
directamente a la falta de la reductasa, procedimos a recuperar la expresión de NQO1
mediante la transfección de los MEFs con un vector de expresión que contenía el gen
NQO1 de rata (ver “Material y Métodos”).
1
2
3
4
5
6
7
A
B
Unidades Arbitrarias (A.U.)
70
60
50
40
30
20
10
0
MEFs
NQO1
NQO1+P. vacio NQO1-/- + P.
1 semana
con NQO1 48h
NQO1-/- + P.
con NQO1 1
semana
NQO1-/- + P.
vacio 2
semanas
NQO1-/- + P.
con NQO1 2
semanas
Figura R-6. A) PCR de las células 2QO1-/- transfectadas 48 horas, 1 y 2 semanas. Calle 1: MEFs
control, donde se observa la banda correspondiente a NQO1, calle 2: células NQO1-/- en donde no se
observa la banda correspondiente a NQO1, calle 3: células NQO1-/- transfectadas con el plásmido vacío (1
semana post-transfección), calle 4: células NQO1-/- transfectadas con el plásmido con el gen NQO1 (48
horas post-transfección), calle 5: células NQO1-/- transfectadas con el plásmido con el gen NQO1 (1
semana post-transfección), calle 6: células NQO1-/- transfectadas con el plásmido vacío (2 semanas posttransfección), calle 7: células NQO1-/- transfectadas con el plásmido con el gen NQO1 (2 semanas posttransfección. B) Cuantificación densitométrica de los geles de RT-PCR.
82
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
Como puede observarse en la Figura R-6, la transfección con este vector resultó en unos
niveles de expresión a las 48 h comparables a los de las células control (91% de
expresión). Sin embargo, pudimos comprobar cómo el efecto de la transfección fue
disminuyendo a lo largo del tiempo. Así, la expresión de NQO1 fue del 79% a la
semana de la transfección y del 47% a las dos semanas, con lo que podemos concluir
que la transfección es efectiva a las 48 horas, pero termina perdiéndose con el
transcurso del tiempo.
Una vez confirmado el éxito de la transfección con el vector que contenía el gen NQO1
procedimos a estudiar su efecto sobre el crecimiento celular, observando que a las 48
horas post- transfección las células transfectadas con el vector de NQO1 crecían menos
que las que habían sido transfectadas con el vecrtor vacío (Figura R-7). Esto nos apunta
a que el mayor crecimiento de las células carentes de NQO1 es un efecto directo de la
falta de esta reductasa. A los 6 días post-transfección, las células transfectadas con el
vector de NQO1 presentaron una tendencia a crecer menos que los controles
transfectados con el plásmido vacío, aunque la diferencia no fue estadísticamente
significativa. A los 9 días, no se observó disminución del crecimiento de las células
transfectadas con el gen NQO1 en comparación con las transfectadas con el plásmido
vacío.
***
Nº duplicaciones [log(Nf /Ni)/log(2)]
8
P. vacio
P. NQO1
7
6
5
4
3
2
1
0
48 h transf ección
6 días transf ección
9 días transf ección
Figura R-7. 2úmero de duplicaciones de las células 2QO1-/- transfectadas con el gen 2QO1 a las 48
horas, 6 días y 9 días post-transfección. El crecimiento mayor de las células carentes de NQO1 es
debido a un efecto directo de NQO1. El efecto de la transfección a las 48 h es estadísticamente muy
significativo (p < 0.001).
83
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
3. Efecto del estatus de QO1 sobre la detención del crecimiento dependiente de la
densidad y la respuesta celular a la retirada de suero.
Se ha demostrado que cambios en la expresión de NQO1 están relacionados con la fase
de crecimiento en distintos tipos de células. Así, en células de adenocarcinoma humano
HeLa, se observó que los niveles de actividad NQO1 se incrementan notablemente a
medida que la densidad celular aumenta y la velocidad de división disminuye (Bello,
Gomez-Diaz et al. 2001). Del mismo modo, se ha demostrado un incremento de la
actividad NQO1 en células BALB/c 3T3 cultivadas a alta densidad, aunque no en
células transformadas derivadas de esta línea (Schlager, Hoerl et al. 1993). Phillips et al
(Phillips, de la Cruz et al. 1994) mostraron que los cultivos estacionarios de la línea
celular de adenocarcinoma HT-29 mostraron un modesto incremento de 2-3 veces en la
actividad NQO1. Finalmente, Collin et al (Collin, Lomri et al. 2001) mostraron también
un incremento de NQO1 dependiente de la densidad celular en células osteoblásticas.
Nuestros datos concuerdan con los obtenidos por estos autores, ya que los MEFs
carentes de NQO1 crecen más que sus respectivos controles.
Sin embargo, en la línea de hepatoblastoma humano HepG2, la expresión de NQO1 en
función de la densidad celular tiene lugar de manera inversa a HeLa. Así, las células
HepG2 mostraron unos niveles máximos de expresión a baja densidad (CordobaPedregosa Mdel, Villalba et al. 2006).
De acuerdo con estos antecedentes, se ha propuesto que el incremento de actividad
NQO1 que tiene lugar en tipos celulares como HeLa o 3T3 puede estar relacionada con
el menor crecimiento de estas células cuando alcanzan una densidad elevada (Schlager,
Hoerl et al. 1993; Bello, Gomez-Diaz et al. 2001). Sin embargo, hasta el momento esto
no ha podido ser demostrado de manera directa e inequívoca. Por ello, usando nuestro
modelo genético con MEFs control y NQO1-/- hemos estudiado la capacidad
proliferativa de estas células en función de la densidad celular, así como su respuesta a
la retirada de suero, condiciones que conducen a una menor tasa proliferativa en los
fibroblastos primarios debido a la falta de factores requeridos para sostener el
crecimiento celular.
84
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
3.1. Incorporación de timidina.
La técnica de incorporación de timidina tritiada se usa para estudiar la capacidad de
proliferación celular. Hemos usamos esta técnica para comprobar si las células que
carecían de NQO1 presentaban alguna alteración en su capacidad de proliferación
celular, ya que en el apartado 1 de resultados mostramos diferencias en el crecimiento
de estas células en comparación con los controles.
Como se puede observar en la figura R-8, cuando las células se cultivaron en medio
completo (con 10% de suero) detectamos una mayor incorporación del isótopo en los
MEFs NQO1-/- tanto en cultivos a baja densidad celular, como en cultivos densos,
aunque la diferencia fue especialmente llamativa a alta densidad, condiciones en las
cuales se produjo un descenso significativo en la incorporación de timidina por parte de
las células control, por no en las NQO1-/-. Estos resultados son de gran importancia, ya
que constituyen la primera prueba directa de que NQO1 es requerida, al menos
parcialmente, para la detención del crecimiento dependiente de la densidad celular.
Cuando estudiamos el comportamiento de las células control en medio sin suero,
encontramos que en estas condiciones se produjo un descenso significativo en cuanto a
la incorporación de timidina tanto en baja como en alta densidad, aunque las diferencias
fueron especialmente llamativas a baja densidad (disminución de aproximadamente el
80%). En células carentes de NQO1 la retirada de suero en baja densidad sólo supuso un
descenso moderado en la incorporación de timidina (aproximadamente el 25% de la
incorporación con 10% de suero). Cuando las determinaciones se llevaron a cabo con
células cultivadas a alta densidad, el descenso fue de aproximadamente el 60%. En
cualquier caso, la capacidad de incorporar timidina fue muy superior a la de las células
control cultivadas en las mismas condiciones (alta densidad y sin suero). Estos
resultados nos indican que NQO1 es también requerida para la detención del
crecimiento ante la retirada de suero.
85
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
Alta densidad
(cpm/pocillo x 10-3)
Incorporación de timidina
Baja densidad
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
MEFs + 10 % FCS
MEFs + 0 % FCS
NQO1-/- + 10 % FCS
NQO1-/- + 0 % FCS
0
10% FCS
0% FCS
10% FCS
0% FCS
Figura R-8. Síntesis de AD2 en MEFs control y 2QO1-/- cultivados en medio completo o sin suero,
y a alta o baja densidad celular. Los cultivos de células confluentes fueron tratados con [metil-3H]
timidina 0.5 µCi/ml durante 8 h. Los resultados corresponden a la media ± SD de 3 experimentos
independientes. Para baja densidad: p < 0.001 cuando comparamos los MEFs con 10% de suero con los
MEFs con retirada de suero, células NQO1-/- con 10% de suero con NQO1-/- con retirada de suero y
MEFs con retirada de suero con NQO1-/- y retirada de suero. Para alta densidad, p < 0.001 en todos los
casos.
3.2. Análisis de la distribución en el ciclo celular mediante citometría de flujo.
Además de la medida de incorporación de timidina tritiada hemos estudiado mediante
citometría de flujo la distribución en las distintas fases del ciclo de los MEFs control,
NQO1-/- cultivados a baja densidad, y en presencia o en ausencia de suero. En estos
experimentos incluimos también el análisis de los MEFs Nrf2-/-.
La cuantificación del contenido de ADN permite determinar la distribución de una
población celular a lo largo de las distintas fases del ciclo. Los estudios de ciclo celular
tienen gran relevancia en varias áreas de la Biología Celular y la Biomedicina. Para
determinar la distribución de la población celular utilizamos yoduro de propidio (IP)
como marcador de ADN.
86
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
0% SUERO
G1
G1
MEFs
S
G2 /M
G1
100
90
% Células
10% SUERO
S G2 /M
80
70
60
50
40
30
20
10
0
16
-/-
QO1
MEFs
G1
S
14
12
G1
10
8
6
S G2 /M
S G2 /M
4
2
0
20
18
16
G1
G1
14
rf2 -/MEFs
12
G 2/M
MEFs+ 10%
MEFs - suero
NQO1 +10%
NQO1 - suero
Nrf2 +10%
Nrf2 -suero
10
8
6
S G2/M
S
G2/M
4
2
0
Figura R-9. Efecto de la ausencia de 2QO1 o 2rf2 y de la retirada de suero en la distribución
celular en las fases del ciclo. Los MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/- fueron cultivados y procesados tal
como se describe en el apartado 12 de “Material y Métodos”.
Como se puede observar en la figura R-9, en condiciones normales de cultivo (en
presencia de 10% de suero), la población celular en fase S fue superior en los MEFs
NQO1-/- y menor en los MEFs Nrf2-/-. Tras la retirada de suero durante 24 horas, los
MEFs control detuvieron el crecimiento en G0/1, aunque un número significativo de
células NQO1-/- se encontraron en las fases S y G2/M en estas condiciones. Tras la
retirada de suero, las células Nrf2-/-, al igual que los controles, detuvieron su
crecimiento en fase G0/1.
En la Figura R-9 se observa también la existencia de un porcentaje relativamente alto de
células en apoptosis en condiciones normales de cultivo (10% de suero) en el caso de
las células Nrf2-/- (población sub-G0/1). Este porcentaje se incrementa notablemente en
condiciones de retirada de suero durante 24 horas. Se ha demostrado que Nrf2 juega un
papel importante en la protección frente a la apoptosis debida a los ROS en células
normales (Schafer, Dutsch et al.). Los MEFs están expuestos continuamente a efectos
deletéreos de los ROS, por lo que un incremento en la muerte celular sería esperado en
87
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
las células carentes de Nrf2, lo cual podría explicar su menor tasa proliferativa y su
corta vida respecto de los controles.
En su conjunto, nuestros datos apoyan la idea de que la expresión de NQO1 es
requerida para un funcionamiento adecuado del sistema de control del ciclo responsable
de la transición G1/S y de la detención del ciclo en G0/1 en ausencia de suero. La
presencia de un mayor número de células en fase S en las células carentes de NQO1
coincide con el mayor crecimiento de éstas y con su mayor incorporación de timidina
(ver anteriormente). Por su parte, en el caso de los MEFs Nrf2-/-, el menor número de
células en fase S, así como el mayor número de células apoptóticas, es consistente con
su menor crecimiento respecto a los controles.
88
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
3.3. Ciclinas: A y E.
Las transiciones entre las distintas fases del ciclo celular dependen de la síntesis y
degradación de las ciclinas. Por tanto, procedimos a estudiar mediante Western blot los
niveles medios en la población celular de ciclina E, principal determinante de la
superación del punto de restricción G1, y de ciclina A, implicada en el inicio de la fase S
y la mitosis.
Como se muestra en la Figura R-10, los niveles de ciclina E se observaron disminuidos
respecto a los controles tanto en las células NQO1-/- como en las Nrf2-/-. En el caso de
las células Nrf2-/- esta disminución estaría acorde con su menor capacidad proliferativa.
Sin embargo, la disminución observada en las células NQO1-/- resulta discrepante con
su mayor proliferación. En todo caso, nuestros resultados son indicativos de la
importancia del balance redox celular para el control de los niveles adecuados de ciclina
E en los MEFs, aspecto que será objeto de futuras investigaciones.
En lo referente a la ciclina A encontramos unos niveles similares de esta proteína en los
cultivos de los tres genotipos estudiados en este trabajo. Como es de esperar, cuando las
células se sometieron a retirada de suero los niveles de esta ciclina se redujeron
considerablemente. En este caso, y de acuerdo con el mayor número de células en fase
S, mayores niveles de ciclina A fueron detectados en los MEFs NQO1-/- en comparación
con los controles.
Unidades Arbitrarias (A.U)
Ciclina E
Rojo Ponceau
45
75 KDa
50 KDa
40
37 KDa
35
25 KDa
30
25
20 KDa
20
15
10
5
0
MEFs
NQO1-/-
Nrf2-/-
89
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
Ciclina A
Rojo Ponceau
Unidades Arbitrarias (A.U)
35
75 KDa
50 KDa
30
37 KDa
25
25 KDa
20
20 KDa
15
15 KDa
10
5
0
MEFs
+ 10%
suero
MEFs
- suero
NQO1-/+ 10%
suero
NQO1-/- suero
Nrf2-/+ 10%
suero
Nrf2-/- suero
Figura R-10. 2iveles de expresión de ciclinas A y E en células MEFs control, 2QO1-/- y 2rf2-/inmortalizadas. La densidad de reacción específica fue calculada como el cociente entre la densidad de
reacción del polipéptido inmunomarcado (U.A.) y la densidad de reacción de la membrana teñida con rojo
Ponceau (U.A). Los resultados son representativos de varios experimentos independientes.
90
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
4. Sirt 1.
Sirt1 es la sirtuina de mamíferos a la que hasta el momento se ha prestado una mayor
atención. Interactúa con diversas moléculas, entre las que se encuentran p53, Ku70, NFkβ y FOXO, estableciendo una relación con la resistencia celular al estrés. Sirt1 es una
desacetilasa que participa en una amplia gama de procesos que incluyen la
diferenciación celular, la apoptosis, así como el metabolismo en general y el
envejecimiento. Se ha demostrado que Sirt1 desacetila la proteína supresora de tumores
p53, desregulando su estabilidad y actividad (Luo, Nikolaev et al. 2001; Prives and
Manley 2001; Tissenbaum and Guarente 2001; Vaziri, Dessain et al. 2001; Langley,
Pearson et al. 2002; Cheng, Mostoslavsky et al. 2003). Sirt1 también inhibe la apoptosis
y promueve la reparación del DNA por desacetilación del factor de transcripción FOXO
(Brunet, Sweeney et al. 2004; Daitoku, Hatta et al. 2004; Motta, Divecha et al. 2004;
van der Horst, Tertoolen et al. 2004). Debido a todos esos factores y al relevante papel
que juega Sirt1 en el mantenimiento de la estabilidad genómica (Oberdoerffer, Michan
et al. 2008), nos propusimos estudiar si la ausencia de NQO1 o de Nrf2 afectaba a sus
niveles en las células.
En el caso de los MEFs control observamos que los niveles de Sirt1 aumentan
considerablemente con la inmortalización celular, manteniéndose unos niveles altos en
las células inmortalizadas. En los MEFs Nrf2-/- los niveles de Sirt1 se incrementaron
sensiblemente durante los primeros pases del cultivo. Sin embargo, en las células Nrf2-/no se mantuvo una expresión elevada en las células inmortalizadas. Resulta muy
llamativo el hecho de que Sirt1 se mantuvo a unos niveles muy bajos en las células
NQO1-/- en todos los pases.
Sirt1 reprime el ADN repetitivo y un grupo funcionalmente diverso de genes a lo largo
del genoma del ratón. En respuesta al daño en el ADN, Sirt1 se disocia de estos loci y se
relocaliza en los puntos de rotura del ADN para promover su reparación. De este modo,
una mayor expresión de Sirt1 favorece la supervivencia en un modelo murino de
inestabilidad genómica, suprimiendo cambios transcripcionales dependientes de la edad
(Oberdoerffer, Michan et al. 2008). Por tanto, unos niveles reducidos de Sirt1 en los
MEFs inmortalizados (que carecen completamente de p53) puede resultar en una mayor
inestabilidad genómica.
91
RESULTADOS: CAPÍTULO 1
Sirt1
8
7
6
97 KDa
66 KDa
5
4
45 KDa
3
2
29 KDa
1
0
p4
p7
p42
MEFs control
p4
p9
NQO1 -/-
p36
p4
p9
p36
Nrf2 -/-
Figura R-11. Determinación de la proteína Sirt1 mediante western blot. Como control de carga se
utilizó el rojo Ponceau y las condiciones son las descritas en el apartado 17 de “Material y Métodos”. Los
resultados son representativos de varios experimentos independientes. Se observó una disminución de la
proteína en las células NQO1-/- y en las Nrf2-/- inmortalizadas respecto a los controles. Ya en los primeros
pases, tanto en los controles como en las células NQO1-/-, los niveles de expresión son bajos; en cambio,
en las células Nrf2-/- en los primeros pases los niveles son más altos aunque disminuyen drásticamente en
las células inmortalizadas.
La sobreexpresión de Sirt1 previene el estrés oxidativo que induce senescencia,
mientras que su inhibición conduce a la senescencia prematura (Ota, Akishita et al.
2007). Los altos niveles de Sirt1 en los primeros pases de las células Nrf2-/-, son
compatibles con la ausencia de senescencia aparente y la inmortalización rápida de estas
células. Por su parte, los bajos niveles encontrados en las células Nrf2-/- inmortalizadas,
nos induce a pensar que quizá en estas células hay una acumulación de daños en el
ADN, lo cual hace que la vida del cultivo sea más corta, tal y como mostramos
anteriormente. Finalmente, en células NQO1-/- se observan unos niveles bajos de Sirt1
en los pases correspondientes a la senescencia, lo que coincide con un período
prolongado de menor crecimiento. En cambio a pases correspondientes con la
inmortalización los niveles de esta proteína son muy bajos. Ello parece indicar que el
mayor crecimiento de estas células no es debido a Sirt1.
92
Capítulo 2: Estrés oxidativo y enzimas
antioxidantes
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
Como se ha indicado en la Introducción, Nrf2 es crucial para la destoxificación eficiente
de metabolitos reactivos y de ROS, al regular la expresión de numerosas enzimas
antioxidantes, entre las que se incluye NQO1 (Johnson, Johnson et al. 2008). La
capacidad de NQO1 para catalizar la reducción obligada de las quinonas a través de un
mecanismo de dos electrones hasta las correspondientes hidroquinonas es esencial para
su papel como antioxidante y en la citoprotección frente a sustancias tóxicas, ya que el
mecanismo de reacción de dos electrones evita la generación de intermediarios
semiquinónicos, los cuales son normalmente compuestos inestables con una elevada
tendencia a reaccionar con el oxígeno para producir superóxido (Lind, Cadenas et al.
1990). Más aún, la proteína NQO1 has sido reconocida como un scavenger del anión
superóxido (Siegel, Gustafson et al. 2004). Por ello, en este capítulo analizamos la
generación y/o acumulación de ROS, así como posibles cambios en algunas de las
principales enzimas antioxidantes, tanto en células carentes de NQO1 (células NQO1-/-)
como del factor de transcripción Nrf2 (células Nrf2-/-).
5. Especies reactivas de oxígeno.
Teniendo en cuenta el papel demostrado para Nrf2 y NQO1 en la defensa antioxidante,
es razonable suponer que los niveles de ROS endógenos podrían verse alterados en las
células NQO1-/- o Nrf2-/-, ya que al disminuir las enzimas antioxidantes sería normal
encontrar los niveles de ROS altos.
Como primera aproximación, analizamos los posibles cambios en la concentración de
ROS en los distintos tipos celulares mediante citometría de flujo y utilizando el
fluorocromo DCFH-DA como sonda para peróxidos. Como se muestra en la figura R12, los niveles de esta especie descendieron en células NQO1-/- y en Nrf2-/inmortalizadas comparadas con el control.
95
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
**
***
4
Fluorescencia (U.A)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
MEFs
NQO1-/-
Nrf2-/-
Figura R-12. 2iveles de ROS intracelulares en los MEFs control, 2QO1-/- y 2rf2-/- inmortalizados.
Los resultados se muestran como fluorescencia emitida (en U.A.) y corresponden a la media ± SD de 3
experimentos independientes, cada uno por triplicado, siendo p < 0.001 en NQO1-/- y p < 0.01 en Nrf2-/frente a las células control.
La disminución de ROS podría estar relacionada con el aumento del crecimiento en
células NQO1-/-, ya que unos niveles bajos de ROS pueden resultar en una acción
protectora frente a la apoptosis. Además, como se señaló en el capítulo 1, existe la
posibilidad de que las células NQO1-/- están usando menos la respiración mitocondrial,
y más un metabolismo glicolítico, que genera menos especies reactivas. Por otra parte,
la falta de NQO1 podría también resultar en la activación de sistemas antioxidantes
alternativos que, a la larga, resultaran en una disminución de las ROS a través de un
mecanismo hormético, como ya se ha indicado en el apartado anterior.
No obstante, en las células Nrf2-/-, que habían mostrado una menor proliferación que las
células control, también se encontraron unos niveles disminuidos de ROS, resultado que
llamó poderosamente nuestra atención. Nrf2 es, un factor de transcripción que regula
muchas enzimas antioxidantes, por lo que cabría esperar la existencia de niveles
elevados de ROS en este tipo celular. A pesar de ello, otros autores tampoco han
encontrado dicho aumento en las células Nrf2-/- (Reddy, Kleeberger et al. 2007). Sin
embargo, sí se ha encontrado que la eliminación genética de la función de Nrf2
exacerba la letalidad embrionaria y el estrés oxidativo en dobles knockout Nrf1-/- y
96
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
Nrf2-/- (Leung, Kwong et al. 2003). Por tanto, una posible hipótesis para explicar estos
resultados se basaría en la existencia de redundancia en cuanto a las funciones de Nrf2 y
Nrf1 para controlar los niveles intracelulares de ROS, de modo que sólo en el doble
knockout se manifiesta el incremento esperado en las ROS.
Hay muchos ejemplos que muestran que bajos niveles de actividad Nrf2 predisponen a
las células a carcinogénesis química, lo cual ha sido generalmente interpretado en base a
la pobre destoxificación en animales nulos o deficientes para Nrf2. De igual forma, se
ha demostrado que una sobrerregulación de Nrf2 protege frente diferentes tipos de
cáncer (Giudice and Montella 2006; Jeong, Jun et al. 2006; Iida, Itoh et al. 2007).
El hecho de que las células Nrf2-/- tengan un límite de proliferación menor que los
controles parece indicar una falta de correlación entre proliferación y elevados niveles
de ROS. Probablemente, la falta de este factor afecta a muchas rutas de transcripción
que resultaría en la acumulación de mutaciones que, a la larga, afectan a la viabilidad
del cultivo.
97
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
6. Actividad Catalasa.
La actividad catalasa se determinó en lisados de MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/inmortalizados con el objetivo de analizar si la falta de alguno de estos factores afectaba
a dicha actividad. Los resultados se muestran en la Figura R-13.
*
6
Actividad catalasa
(nmoles/min/mg)
5
4
3
2
1
0
MEFs
NQO1 -/-
Nrf2 -/-
Figura R-13. Actividad catalasa. La actividad catalasa se estudió en los lisados de MEFs control,
NQO1-/- y Nrf2-/- inmortalizados La actividad específica (nmoles min-1 mg-1) se calculó tomando como
referencia la cantidad de proteína presente en el ensayo (35 µg). Los resultados corresponden a la media ±
SD de tres experimentos independientes como mínimo (p < 0’05 en NQO1-/- respecto al control; en las
células Nrf2-/- no se encontraron cambios significativos).
Como se observa en la figura R-13, la actividad catalasa se encontró disminuida en las
células NQO1-/-, mientras que en las Nrf2-/- no se observaron cambios en comparación
con los controles. Por tanto, la ausencia de NQO1 está afectando a la actividad catalasa,
mientras que la ausencia de Nrf2 no parece tener ningún efecto. Aunque el factor de
transcripción Nrf2 interviene en la regulación de algunas enzimas antioxidantes como
NQO1, esta enzima se sintetiza en las células Nrf2-/- aunque en menor cantidad (ver más
adelante). De acuerdo con nuestros resultados, se ha demostrado que los niveles basales
de mensajero de la catalasa resultaron invariables en hígado de ratones Nrf2-/- en
98
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
comparación con los correspondientes controles Nrf2+/+. No obstante, la expresión
dependiente de la estimulación con el agente quimiopreventivo 3H-1,2-dithiole-3 thione
(un inductor de la señalización mediada por Nrf2) se anuló en los ratones Nrf2-/- (Kwak,
Itoh et al. 2001).
En todo caso, podemos indicar que no existe correspondencia entre actividad catalasa y
niveles de peróxidos en los MEFs. Ello no es sorprendente, ya que la catalasa presenta
baja afinidad por el H2O2; es decir, necesita altas concentraciones de peróxido para una
acción catalítica rápida (Mittler 2002). Por ello es de esperar que esta enzima sea de
gran importancia frente a la defensa celular frente a situaciones de estrés oxidativo
severo. Por ejemplo, la adaptación de células HL-60 al peróxido de hidrógeno exógeno
(100 µM) conlleva el incremento sustancial en los niveles celulares de catalasa (Bello
2003). Sin embargo, no es esperable que la catalasa tenga un papel predominante en la
regulación de los niveles fisiológicos de ROS.
99
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
7. Actividad enzimática QO1.
Los niveles de actividad NQO1 se analizaron en las fracciones citosólicas obtenidas de
MEFs confluentes siguiendo el método descrito por Lind et al (1990) sobre la base de la
elevada sensibilidad que muestra esta enzima al dicumarol (Lind, Cadenas et al. 1990).
Para detectar posibles cambios en la actividad NQO1 en los cultivos primarios de
fibroblastos, y teniendo en cuenta que NQO1 es uno de los mejores marcadores de
expresión mediada por Nrf2 (Thimmulappa, Mai et al. 2002), se determinó la actividad
en los diferentes pases y en los tres tipos celulares (MEFs control, NQO1-/- y Nrf2-/-).
MEFs control
120
NQO1-/-
Actividad específica
(nmoles/min/mg)
100
Nrf2-/-
80
60
40
20
0
-20
5
10
15
20
-40
Pases
Figura R-14. Actividad 2QO1 en fracciones citosólicas de MEFs control, 2QO1-/- y 2rf2-/obtenidos de distintos pases. La actividad específica (nmoles min-1 mg-1) fue calculada tomando como
referencia la cantidad de proteína presente en el ensayo (70 µg). Los resultados de los MEFs control
corresponden a la media ± SD de tres experimentos independientes donde p < 0.0001, considerándose
extremadamente significativa. En esta figura también se observa, cómo las células NQO1-/- no presentan
esta actividad, mientras que en las células Nrf2-/- la actividad es baja y relativamente constante a lo largo
de los pases.
Como se muestra en la figura R-14, a partir del pase 5 tuvo lugar un aumento de la
actividad de NQO1 en los MEFs control, coincidiendo con la disminución del número
de duplicaciones celulares indicado en la figura R-1. La máxima actividad NQO1 se
observó en el intervalo comprendido entre los pases 10 y 15, lo cual coincide con el
período de la senescencia y el inicio de la inmortalización celular. A continuación se
observó cómo la actividad NQO1 empezó a disminuir de forma simultánea al nuevo
incremento de las duplicaciones que llevaron a la obtención de la línea inmortal. Resulta
100
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
muy interesante el aumento en los niveles de p53 en los MEFs en el pase 9 y que a
partir de ahí se pierda la expresión en el pase 16 al mismo tiempo que la actividad
NQO1. Ello nos podría indicar que, efectivamente, la evolución de NQO1 se relaciona
con la senescencia replicativa, ya que tiene lugar siguiendo un patrón similar al de p53.
En otros modelos celulares se ha observado que la pérdida de NQO1 está acompañada
de una reducción de los niveles de p53 (Iskander, Gaikwad et al. 2005; Gong, Kole et
al. 2007) y se acepta también un papel de NQO1 en la estabilización de supresores de
tumores como p53, p73 y p33. Asher et al (2001) demostraron que NQO1 inhibía la
degradación de p53 en células de cáncer de colon humano (HCT-116) exponiendo las
células a dicumarol (potente inhibidor de NQO1) y observando un aumento en la
degradación proteosomal de p53 (Asher, Lotem et al. 2001).
Por otra parte, se ha propuesto que la función de NQO1 en la estabilización de p53
podría ejercerse también a través de un mecanismo independiente de Mdm2/ubiquitina
que implica la asociación directa de ambas proteínas (Asher, Lotem et al. 2001; Asher,
Lotem et al. 2002; Anwar, Dehn et al. 2003; Asher, Lotem et al. 2003). Es muy
interesante el hecho de que NQO1 puede estabilizar las formas mutantes de p53 más
comunes en los cánceres humanos, protegiendo la proteína de la degradación dependiente
de Mdm2/ubiquitina (Asher, Lotem et al. 2003).
Como era de esperar, la actividad NQO1 fue indetectable en las células NQO1-/-, y baja
y constante en todos los pases en las Nrf2-/-. La baja inducción de NQO1 y de otras
enzimas antioxidantes y destoxificantes cuya expresión está regulada por Nrf2, puede
hacer que la pérdida de este factor tenga como consecuencia un aumento del estrés
oxidativo y del daño genético durante los pases iniciales del cultivo, resultando en una
rápida inmortalización de las células. De acuerdo con esta idea, la falta de Nrf2
ocasionó estrés oxidativo y lesiones en el ADN en cultivos primarios de células
alveolares tipo II aisladas de ratones Nrf2-/-, que afectó la progresión del ciclo celular
(Reddy, Kleeberger et al. 2008). Más aún, se ha publicado recientemente que la pérdida
de Nrf2 trae consigo mayor estrés oxidativo y daño en el ADN en la iniciación de la
transformación celular en cáncer de próstata (Frohlich, McCabe et al. 2008). Este efecto
se perdería tras el sometimiento de las células a pases sucesivos, ya que hemos
observado que en el caso de las células inmortlaizadas los niveles de ROS se
101
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
encontraban disminuidos tanto en los MEFs Nrf2-/- como en los NQO1-/- en
comparación con los controles.
Por otra parte, en hígado de rata se ha observado que la restricción calórica induce una
acumulación de NQO1 en la membrana plasmática (De Cabo, Cabello et al. 2004).
Estos resultados sugieren que la expresión de NQO1 puede ser un factor regulador en la
senescencia replicativa mediante la regulación del balance redox y/o la estabilización de
p53, pudiéndose además modularse mediante restricción calórica.
102
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
8. Citocromo b5 reductasa.
Para la determinación de los niveles de expresión de la proteína citocromo b5 reductasa
(b5R), se utilizaron fracciones membranosas de los tres tipos celulares que fueron
sometidas a electroforesis (SDS-PAGE) y electrotransferencia. La determinación de los
niveles de dicha proteína se realizó por inmunotinción y revelado con fosfatasa alcalina
tal como se explicó en el apartado 18 de “Material y Métodos”.
Como se observa en la figura R-15 la expresión de la proteína b5R se encontró
disminuida tanto en las células carentes de NQO1 como en las carentes de Nrf2 en
comparación con los controles.
Rojo Ponceau
Citocromo
75 KDa
b5 R
50 KDa
25
37 KDa
.)
A.U 20
Unidades arbitrarias (
25 KDa
15
20 KDa
10
5
0
MEFs
NQO1-/-
Nrf2-/-
Figura R-15. 2iveles de expresión de b5R en MEFs control, 2QO1-/- y 2rf2-/- inmortalizados. La
densidad de reacción específica fue calculada como el cociente entre la densidad de reacción del
polipéptido inmunomarcado (U.A.) y la densidad de reacción de la membrana teñida con rojo Ponceau
(U.A). Los resultados son representativos de varios experimentos independientes.
Estudios recientes asignan a la b5R un papel en la acción antioxidante a través de la
regeneración de pequeñas moléculas antioxidantes. Así, en células animales la b5R
participa en un sistema de transferencia de electrones de la membrana plasmática donde
reduce al coenzima Q el cual, a su vez, actúa en la regeneración de las formas
antioxidantes del α-tocoferol (en el interior de la membrana) y del ascorbato (en el
medio extracelular) (Navarro, Villalba et al. 1995; Villalba, Navarro et al. 1995;
103
RESULTADOS: CAPÍTULO 2
Villalba, Navarro et al. 1997; Navarro, Navas et al. 1998). Más recientemente, se ha
demostrado que NQR1, una forma de b5R localizada en la membrana plasmática de
Saccharomyces cerevisiae, interviene en el mantenimiento de los niveles de coenzima Q
reducido, y su sobre-expresión extiende la longevidad celular (Jimenez-Hidalgo,
Santos-Ocana et al. 2009).
Por otra parte, es importante tener en cuenta que la b5R puede actuar como una quinona
reductasa que dona dos electrones secuencialmente generándose semiquinonas
(Nakamura and Hayashi 1994). Estos compuestos reaccionan rápidamente con
moléculas de oxígeno generando superóxido y otras especies reactivas de oxígeno que
pueden causar estrés oxidativo y daño en estructuras celulares (Joseph and Jaiswal
1994). Existen evidencias que muestran que las quinonas reductasas pueden actuar
como reguladoras de cascadas de señalización implicadas en el control del crecimiento
y muerte celular en diversas líneas celulares (Cross, Deak et al. 1999; Siemankowski,
Morreale et al. 2000; Asher, Lotem et al. 2001; Collin, Lomri et al. 2001; Gaikwad,
Long et al. 2001).
Todos estos datos sugieren que ambos tipos celulares, NQO1-/- y Nrf2-/-, no están
protegidos frente al estrés oxidativo y presentan alteraciones en el crecimiento y en la
muerte celular. La disminución de los niveles de b5R podría estar relacionada con la
desregulación del crecimiento en comparación con los controles.
104
Capítulo 3: Alteraciones celulares producidas por
la falta de QO1: Estudio Proteómico.
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
Como se ha desarrollado en los apartados anteriores la falta de NQO1 produce un estado
de desregulación del crecimiento celular, respondiendo los MEFs de forma defectuosa a
estímulos que suponen una ralentización o detención del crecimiento, como son la
retirada de suero, o el cultivo a alta densidad celular. Estas alteraciones pueden deberse
a cambios en la expresión de otras proteínas. Como una primera aproximación al
conocimiento de estas modificaciones hemos llevado a cabo un estudio protéomico
comparativo de los MEFs control y NQO1-/-. No hemos desarrollado un estudio similar
sobre las células Nrf2-/- debido a que, por su papel como factor de transcripción, son
abundantes los estudios sobre las proteínas reguladas por Nrf2, incluyendo la utilización
de técnicas ómicas (Kwak, Itoh et al. 2001; Thimmulappa, Mai et al. 2002). Más aún,
precisamente por su función como factor de transcripción, la comparación del perfil de
expresión proteica entre los MEFs control y Nrf2-/- puede revelar numerosos cambios
que no estén directamente relacionados con la falta de Nrf2, sino más bien con los
defectos en la expresión de algunas enzimas reguladas por Nrf2, o incluso por cambios
en las concentraciones de metabolitos como el GSH cuya síntesis depende también de
Nrf2, como se ha demostrado recientemente (Reddy, Kleeberger et al. 2007).
9. Análisis proteómico.
Análisis comparativo de los geles bidimensionales.
Con objeto de determinar qué proteínas concretas podrían presentar alteraciones al
comparar MEFs control y NQO1-/-, analizamos y comparamos los patrones de expresión
proteica en ambos tipos celulares sobre geles bidimensionales. El experimento se realizó
haciendo triplicados de cada condición como se ha explicado en el apartado 20 de
“Material y Métodos”. Las imágenes digitalizadas de los geles teñidos con Sypro Ruby
se procesaron mediante el programa PDQuest 2-D Analysis Software, y tras la
detección automática de puntos o “spots”, se procedió al emparejamiento de los mismos
en todos los geles y a una revisión manual. El mismo programa realizó el análisis
densitométrico de los spots, la normalización de los datos y el análisis de la expresión
diferencial entre ambos grupos. Finalmente los datos se analizaron estadísticamente,
considerándose sólo aquellos spots cuya expresión se veía significativamente alterada.
Siguiendo estas premisas se encontraron 75 spots con cambios significativos en las
107
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
células NQO1-/-, de los cuales 51, además de ser estadísticamente significativos,
suponían alteraciones de más del doble o menos de la mitad que los controles. De estos
51 spots, 30 estaban aumentados y 21 estaban disminuidos en las células carentes de
NQO1. Para proseguir con la identificación de proteínas, de los 51 spots se
seleccionaron aquellos que presentaran condiciones óptimas para su manipulación, bien
por el tamaño del spots, bien por su buena separación en los geles bidimensionales.
Identificación de proteínas.
Todas las manchas
proteicas cuyos niveles de expresión resultaron estar
significativamente alterados en las células carentes de NQO1 respecto a los controles
fueron escindidas de los geles, digeridas con tripsina y analizadas mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF. Para realizar las identificaciones, los
espectros adquiridos se introdujeron en el programa “MASCOT”. Las identificaciones
se aceptaron cuando el score C.I.% era entre 80-100%. El análisis de los mapas
proteicos de las células, mostró alteraciones estadísticamente significativas en los
niveles de expresión de 51 manchas proteicas, de las que nueve pudieron ser
identificadas con éxito mediante espectrometría de masas y cuyas características
aparecen resumidas en la tabla R-1. En la figura R-16 se pueden observar los cambios
debidos a la falta de NQO1 y en la figura R-17 se muestran esos mismos cambios a
mayor resolución. Como se ha indicado, se identificaron con éxito 9 manchas proteicas,
que pudimos agrupar en 3 categorías funcionales:
a) Proteínas estructurales: Chaperonina, PLOD3, dihidropirimidinasa 3, Elfin y
Transgelina.
b) Proteínas de estrés: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y Superóxido dismutasa
mitocondrial dependiente de Magnesio (Sod2).
c) Proteínas implicadas en la diferenciación y proliferación celular: Trap1 y
GRP75.
La función de nuestras 9 proteínas de interés se describe de manera resumida a
continuación:
-
Trap 1 juega un papel relevante en la progresión del ciclo y en la diferenciación
celular.
108
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
-
Chaperonina está implicada en la organización del citoesqueleto.
-
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa tiene función de protección frente a las
especies reactivas de oxígeno.
-
Superóxido dismutasa mitocondrial dependiente de Magnesio (SOD2) juega un
papel importante en la protección frente al estrés oxidativo mitocondrial.
-
PLOD3 es esencial en la estabilidad de los puentes de colágeno
intermoleculares.
-
Dihidropirimidinasa 3 juega un papel importante en la organización del
citoesqueleto.
-
GRP75, o mortalina interviene en la respuesta al estrés, en la regulación de la
glucosa, en la proliferación celular, en la diferenciación y en la tumorogénesis.
-
Elfin es una proteína crítica en la formación de fibras de estrés y en la
organización de los filamentos de actina.
-
Transgelina es una proteína de unión a la actina.
Aunque a continuación pasamos a comentar brevemente estos resultados, las proteínas
GRP75 o mortalita, Elfin y Transgelina fueron objeto de un estudio más detallado que
incluía su validación mediante inmunodetección, resultados que mostraremos y
discutiremos más extensamente al final de esta parte.
De las proteínas alteradas en células NQO1-/-, cinco están implicadas en la organización
del citoesqueleto, y son: Chaperonina, PLOD3, Dihidropirimidinasa 3, Elfin y
Transgelina. La primera de ellas estaba aumentada en las células NQO1-/- y las otras
cuatro disminuidas. Esta alteración de los niveles de proteínas relacionadas con la
organización del citoesqueleto nos aportó la idea de estudiar en más profundidad este
componente en las células carentes de NQO1 como veremos en el apartado 10 de
resultados.
Trap 1, que encontramos aumentada en las células carentes de NQO1, interacciona con
varias proteínas involucradas en la progresión del ciclo, diferenciación celular y
respuesta inmune (Heller and Kronke 1994; Song, Dunbar et al. 1995; Felts, Owen et al.
2000). Los cambios en una proteína que interviene en la progresión del ciclo celular es
consistente con los resultados expuestos en el capítulo 1, donde se mostró un aumento
en la proliferación de células carentes de NQO1 con respecto a los controles.
109
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
La Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) está también aumentada en las células
carentes de NQO1. Esta proteína se ha implicado en funciones de protección frente a las
ROS, lo que puede explicar los bajos niveles de ROS que presentan estas células en
comparación con las controles. Por otra parte, se ha comprobado que la deficiencia de
G6PD o una disminución de su actividad, reduce considerablemente la edad media de
los glóbulos rojos ocasionando anemia hemolítica. En cultivos primarios de hepatocitos
de rata adulta, por su parte, se ha descrito una inducción de la G6PD en condiciones
proliferativas (Yoshimoto, Nakamura et al. 1983). Estos resultados parecen indicar una
relación entre longevidad, proliferación y G6PD. En este sentido, el aumento del enzima
en células carentes de NQO1 podría explicar tanto la extensión de la vida del cultivo
como la mayor proliferación que presentan en comparación con sus respectivos
controles.
Como en los casos anteriores, la Superóxido dismutasa mitocondrial dependiente de
Magnesio (SOD2), cuyo papel en la protección frente al estrés oxidativo es crucial,
estaba aumentada en las células carentes de NQO1. Se ha mostrado que la
sobreexpresión de SOD2 extiende significativamente el ciclo de vida en moscas (Sun,
Folk et al. 2002) y ligeramente en ratones (Hu, Cao et al. 2007). Por el contrario, los
ratones carentes de SOD2 no son viables (Li, Huang et al. 1995). Estos datos son
compatibles, como ocurría en el caso de la G6PD, con el aumento de expresión de
SOD2 y la mayor longevidad que presentan las células carentes de NQO1.
110
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
pH
KDa
3
200
116
97
10
7
5
1
6
66
3
66
2
45
45
8
36
29
4
24
9
20
A
14
KDa
pH
3
200
116
97
10
7
1
5
6
66
3
66
KDa
2
45
45
36
8
29
4
29
24
9
20
B
14
Figura R-16. Imágenes representativas de geles 2-DE (pH 3-10 NL, 12% acrilamida) sobre las que
aparecen señaladas las 9 manchas proteicas que pudieron ser identificadas con éxito y que mostraron
diferencias estadísticamente significativas en el análisis de las células carentes de NQO1. A) Células
controles y B) células NQO1-/-.
111
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
A.U
A.U
NQO1-/-
1200
1000
800
600
400
200
0
*
NQO1-/-
NQO1-/-
*
Control
Control MEFs
2100
1800
1500
1200
900
600
300
0
1200
1000
800
600
400
200
0
NQO1-/- MEFs
*
Control
NQO1-/-
*
NQO1-/-
Control
6: Dihydropyrimidinase-like 3
NQO1-/- MEFs
Control MEFs
NQO1-/-
8: PDZ and LIM domain protein 1 (Elfin)
A.U
A.U
7: Stress-70 protein, mitochondrial
precursor (GRP75)
NQO1-/- MEFs
Control MEFs
Control
Control
5: Procollagen-lysine 2 Oxoglutarate 5-dioxygenase 3
(PLOD3)
Control MEFs
NQO1-/- MEFs
*
5600
4800
4000
3200
2400
1600
800
0
*
A.U
NQO1-/- MEFs
Control MEFs
Control
29
NQO1-/-
4: Mitochondrial Mn-superoxide dismutase (Sod2)
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
3: Glucose-6-phosphate dehydrogenase X-linked
Control MEFs
NQO1-/- MEFs
A.U
*
Control
NQO1-/- MEFs
Control MEFs
700
600
500
400
300
200
100
0
*
Control
9: Transgelin
Control MEFs
A.U
1200
1000
800
600
400
200
0
2: Chaperonin containing TCP1, subunit 6A
A.U
A.U
1: Tumor necrosis factor receptor-associated
protein 1 (TRAP1)
Control MEFs
NQO1-/- MEFs
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
NQO1-/-
NQO1-/- MEFs
*
Control
NQO1-/-
Figura R-17. Imágenes representativas de los spots que fueron identificados con éxito y que
mostraron diferencias estadísticamente significativas en el análisis de las células carentes de 2QO1.
Esta figura es un aumento de los 9 spots que están señalados en la figura R-16.
112
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
Protein name
Spot
Accession no
Protein
Protein
Pep.
(MS DB)
Score
score
Count
C.I. %
Tumor necrosis factor
PI
Protein
MW
(Da)
1
gi/13879408
191
100
20
6.25 80369.6
2
gi/74198471
216
100
14
6.46 58522.9
3
gi/6996917
173
100
17
6.06 59680.9
4
gi/17390379
72
99.772
6
8,67 24241.3
5
gi/12850403
235
100
18
5.84 85478.9
6
gi/148678069
85
99.988
12
6.39 73747.9
7
gi/3122170
422
100
26
5.87 73969.9
8
gi/74196535
118
100
9
6.38 36178.1
9
gi/6755714
96
99.999
6
8.85 22618.4
receptor associated
protein 1 (TRAP1)
Chaperonin containing
TCP1, subunit 6A
Glucose-6-phosphate
dehydrogenase Xlinked
Mitochondrial Mnsuperoxide dismutase
(Sod2)
Procollagen-lysine 2
oxoglutarate 5dioxygenase 3
(PLOD3)
Dihydropyrimidinaselike 3
Stress-70 protein,
mitochondrial
precursor (75KDa
glucose-regulated
protein) (Hspa 9mortalin) (GRP75)
PDZ and LIM domain
protein (Elfin)
Transgelin
Tabla R-1. Lista de manchas proteicas alteradas en células 2QO1-/- comparadas con los controles.
En la primera columna aparece el nombre de la proteína identificada. A continuación nº de spot, nº de
acceso asignado por la base de datos, el score, el score I.C., el número de péptidos, el punto isoeléctrico
de la proteína y la masa molecular. En verde se muestran las proteínas que aumentan en ausencia de
NQO1 respecto a los controles y en rojo las proteínas que disminuyen.
113
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
Validación de los resultados mediante inmunodetección.
Para confirmar los resultados obtenidos en el estudio proteómico, se analizaron las
proteínas CLIM1 o Elfin, GRP75 y Transgelina mediante inmunodetección y utilizando
para ello extractos proteicos de ambos tipos celulares (véase en el aparatado 20.7 de
“Material y Métodos”). Como se puede observar en la figura R-18 las tres proteínas
presentaron bajos niveles de expresión en las células carentes de NQO1, resultado
consistente con el obtenido en el análisis proteómico.
MEFs
NQO1-/-
Elfin
A
75 KDa
Unidades Arbitrarias (A.U.)
25
50 KDa
37 KDa
25 KDa
20 KDa
20
15
10
5
0
Rojo ponceau
MEFs
MEFs
NQO1-/-
NQO1-/-
B
GRP75
250 KDa
Unidades Arbitrarias (A.U.)
16
150 KDa
100 KDa
75 KDa
14
12
10
8
6
4
2
0
Rojo ponceau
MEFs
114
NQO1-/-
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
MEFs
-/-
NQO1
C
Transgelina
160
Unidades Arbitrarias (A.U.)
75 KDa
50 KDa
37 KDa
25 KDa
20 KDa
Rojo ponceau
140
120
100
80
60
40
20
0
MEFs
NQO1-/-
Figura R-18. Inmunodetección de Elfin, GRP75 y Transgelina en extractos proteicos de células
carentes de 2QO1 y MEFs control. (A) Elfin muestra una banda de 38 KDa, que disminuye en las
células carentes de NQO1. (B) En el caso de GRP75 aparece una banda de 74 KDa que también
disminuye en las células carentes de NQO1. (C) La proteína transgelina aparece como una banda de unos
25 KDa y también disminuye en las células carentes de NQO1. En los geles teñidos con rojo Ponceau el
primer carril corresponde con el marcador, el segundo con los MEFs control y el tercero con las células
carentes de NQO1.
Se ha comprobado que Elfin se asocia a los filamentos de actina y a las fibras de estrés
en plaquetas humanas y en células endoteliales (Bauer, Kratzer et al. 2000) y otros
estudios han demostrado que el ARNm de CLP36 (también conocido como Elfin,
CLIM1 y PSLIM1) está ampliamente distribuido en tejidos no musculares (Wang,
Harrison-Shostak et al. 1995; Vallenius, Luukko et al. 2000; Vallenius, Scharm et al.
2004). En el caso de las células carentes de NQO1, los bajos niveles encontrados para
esta proteína pueden indicar alteraciones en el citoesqueleto de actina, posibilidad que
analizamos más adelante.
GRP75, también denominada mortalina, es una proteína que interviene en la respuesta
al estrés, en la proliferación y diferenciación celular y en la tumorogénesis (Mizukoshi,
Suzuki et al. 1999; Mizukoshi, Suzuki et al. 2001), demostrándose además que inactiva
a p53 (Wadhwa, Takano et al. 1998), por lo que presenta la propiedad de extender la
vida proliferativa en fibroblastos humanos y promover la inmortalización. Se ha
encontrado un aumento de mortalina en muchos tejidos de tumores, aunque algunos no
presentan dicho incremento; incluso existen líneas celulares tumorales cuyos niveles de
mortalina son bajos (Wadhwa, Ando et al. 2003; Wadhwa, Takano et al. 2004). La
disminución significativa de los niveles de expresión que presenta esta proteína en
115
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
células NQO1-/-, podría estar relacionada con las diferencias que hemos encontrado en
ellas en cuanto a la proliferación celular y a su capacidad de respuesta a situaciones de
estrés.
Finalmente, la Transgelina es una proteína de unión a la actina y un supresor de
tumores. Se ha demostrado que su expresión se pierde en células transformadas y en
líneas celulares tumorales. Así mismo, los niveles de transgelina se reducen, o incluso
se pierden, en muestras de cáncer de colon, próstata y mama (Shields, Rogers-Graham
et al. 2002). Esta disminución en la expresión de transgelina encontrada en células
carentes de NQO1 ponen de manifiesto que éstas presentan propiedades similares a las
de células tumorales, entre las que se encuentran diversas modificaciones en el
citoesqueleto cuyo estudio, como se ha mencionado, abordaremos más adelante.
Con el objeto de determinar si la disminución de Elfin, GRP75 y transgelina era un
cambio inducido directamente por la falta de NQO1, transfectamos a las células NQO1/-
con el gen de rata, tal como explicamos en el apartado 23 de “Material y Métodos” y
estudiamos los niveles de expresión de estas proteínas. Los resultados (ver Figura R-19)
mostraron que estas proteínas no aumentaban en las células transfectadas, por lo que
podemos concluir que la falta de NQO1 no actúa de manera directa sobre la expresión
de estas proteínas, sino que los resultados obtenidos parecen deberse a cambios
indirectos relacionados con la ausencia de NQO1. Una posibilidad que explicaría la
falta de recuperación de la expresión de estas proteínas en los MEFs NQO1-/transfectados con el gen NQO1 es que estas alteraciones se deban a cambios genéticos
establecidos en los MEFs carentes de NQO1, y por lo tanto irrecuperables por la
transfección.
MEFs
NQO1-/-
NQO1-/- +
plásmido
vacío
NQO1-/- +
plásmido
con NQO1
Elfin
GRP75
Transgelina
Figura R-19. Inmunodetección de Elfin, GRP75 y Transgelina en células MEFs, 2QO1-/- y en
2QO1-/- transfectadas con plásmido vacío y con plásmido con 2QO1
116
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
10. Cambio en la organización del citoesqueleto de actina en las células carentes de
QO1.
En el análisis proteómico de las células NQO1-/-, mostrado en el apartado anterior,
encontramos modificaciones en proteínas relacionadas con el citoesqueleto de actina,
por lo que nos pareció interesante y pertinente estudiar la organización de este elemento
del citoesqueleto en dichas células en comparación con los MEFs control.
Aparte de los resultados obtenidos en el estudio proteómico, los primeros indicios sobre
cambios en el citoesqueleto los encontramos en la peculiar disposición que adoptaban
las células NQO1-/- en las placas de cultivo, y que era diferente a la que mostraban las
células control (Figura R-20). Además, habíamos observado en los cultivos que las
células NQO1-/-ofrecían menor resistencia que las controles a ser separadas del sustrato
con la solución de tripsina.
MEFs
NQO1-/-
Figura R-20. Micrografías de los cultivos celulares tomadas con el microscopio invertido, que
permite observar cambios morfológicos y de disposición de los dos tipos celulares.
Como se observa en la Figura R-20, los MEFs control adoptaban una organización más
desordenada en el cultivo, mientras que las células carentes de NQO1 parecían
organizarse más ordenadamente formando celdillas. No obstante, al igual que lo
ocurrido con los niveles de expresión de proteínas como Elfin o Transgelina (ver
anteriormente), cuando las células NQO1-/- fueron transfectadas con el gen NQO1 no
observamos que la disposición cambiara.
117
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
Debido a estos resultados, nos pareció apropiado estudiar el citoesqueleto de actina.
Para ello utilizamos faloidina conjugada con un fluorocromo (Alexa Fluor 488), cuya
unión a los filamentos de actina está ampliamente documentada, y que permite su
visualización con el microscopio de fluorescencia tal como se explicó en el apartado 22
de “Material y Métodos”. Mediante esta técnica analizamos si la ausencia de NQO1
producía alguna alteración visible sobre el citoesqueleto de actina. Cuando observamos
en el microscopio confocal los dos tipos celulares, encontramos que la arquitectura del
citoesqueleto de actina era considerablemente distinta, como puede observarse en la
figura R-21.
MEFs
NQO1-/-
Figura R-21. Alteración de los filamentos de actina en ausencia de 2QO1. La falta de NQO1 afecta a
la organización del citoesqueleto de actina.
Así, nuestros resultados mostraron que el citoesqueleto de actina presenta diversas
modificaciones en las células NQO1-/- y que afectan tanto a la cantidad y distribución
interna de los filamentos de actina, como al establecimiento de diversos tipos de
estructuras tales como fibras de estrés, filopodios, etc. Los MEFs control parecen
mostrar más cantidad de actina, pero las prolongaciones filamentosas parecen ser menos
numerosas y más cortas si se comparan con células NQO1-/-. Las alteraciones en la
dinámica de la actina filamentosa podrían desempeñar un papel importante en la
estimulación del crecimiento de los MEFs NQO1-/-.
118
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
El citoesqueleto de actina es una red dinámica de polímeros de actina y gran variedad de
proteínas asociadas. Sus principales funciones fisiológicas están relacionadas con la
motilidad celular y los cambios de forma de la célula durante el ciclo celular. También
participa en la organización del citoplasma para generar fuerzas mecánicas dentro de la
célula en respuesta a diversas señales extracelulares, y es esencial para algunas
actividades contráctiles además de controlar interacciones celulares, adhesión molecular
y transporte intracelular (Moustakas, Theodoropoulos et al. 1998; Schmidt and Hall
1998; Small, Rottner et al. 1999).
Las GTPasas-Rho participan en la regulación de la organización del citoesqueleto de
actina. Están implicadas además en vías de señalización que activan cascadas de
quinasas que regulan la expresión génica y controlan la progresión del ciclo y
proliferación celular (Khosravi-Far, Campbell et al. 1998; Schmidt and Hall 1998;
Small, Rottner et al. 1999). Algunas de las proteínas de esta superfamilia o de sus
reguladores resultan ser oncogénicos, y de hecho, las mutaciones o la sobreexpresión de
éstas parecen estar implicadas en diferentes tipos de cáncer. Se han acumulado muchas
evidencias, tanto en levaduras como en células de mamíferos, que indican que las
GTPasas de la familia Rho son reguladores de las vías de señalización que unen los
estímulos extracelulares o intracelulares al ensamblaje y organización de la actina del
citoesqueleto (Nudel, Zakut et al. 1983; Janmey 1994; Small, Rottner et al. 1999).
Por otra parte, quisimos determinar si la introducción del gen NQO1 en las células
carentes de él, revertía los cambios al fenotipo control, procediéndose a la transfección
del mismo, tanto con el plásmido vacío como con el que contenía el gen NQO1, como
se ha indicado en el apartado 23 de “Material y Métodos”. Como se observa en la figura
R-22 la introducción del gen NQO1 en las células carentes de éste, no parece conllevar
cambios en la organización de los filamentos de actina. Estos resultados parecen indicar
que la peculiar organización encontrada en las células carentes de NQO1 es debida a
cambios indirectos por la ausencia de este gen.
119
RESULTADOS: CAPÍTULO 3
-/-
NQO1
NQO1-/- ++
Plásmido
plasmido vacío
NQO1-/ -/- +
Plásmido
con
plasmidocon
NQO1
NQO1
Figura R-22. Filamentos de actina en células transfectadas con el gen 2QO1. Al introducirle el gen
NQO1 a las células carentes de éste no se observaron cambios en la organización de los filamentos de
actina.
120
Capítulo 4: Análisis Ultraestructural
RESULTADOS: CAPÍTULO 4
Además de las observaciones directas efectuadas en las placas de cultivo con el
microscopio invertido donde encontramos modificaciones estructurales en las células
carentes de NQO1 (véase Figura R-20), a lo largo de esta Tesis hemos mostrado cómo
en estas células se modifican los patrones de expresión de una amplia gama de
proteínas, muchas de las cuales tienen un papel directa o indirectamente relacionado con
la forma de las células. Así, y por citar un ejemplo, el análisis con faloidina-Alexa fluor
488 y microscopía confocal mostró cambios radicales en la organización del
citoesqueleto de actina en las células NQO1-/- frente a los MEFs control (Figura R-21),
así como en proteínas relacionadas con la dinámica de dicho citoesqueleto (transgelina,
elfin, etc.; Figuras R-18). Además, en las células Nrf2-/- hemos encontrado cambios en
otras proteínas implicadas en tráfico vesicular (GM130, KDEL-receptor, Rab 7, etc.;
Figuras R-5). Por todo ello, cabe dentro de lo posible que la falta de NQO1 o de Nrf2
tenga una repercusión ultraestructural en las células que la microscopía óptica pueda no
resolver. Por ello, en este apartado abordamos un estudio morfológico en el que se
compara la ultraestructura de ambos tipos celulares con la de los MEFs control. Este
análisis lo hemos llevado a cabo tanto con técnicas de Microscopía Electrónica de
Barrido como de Transmisión, obteniéndose los resultados que se detallan a
continuación.
11. Microscopia Electrónica de Barrido (MEB).
Fijadas y procesadas las muestras como se detalla en el apartado 21.2 de “Material y
Métodos”, observamos algunas diferencias notables que afectaban sobre todo a las
células carentes de NQO1 (Figura R-23). Así, y a pesar de cierta heterogeneidad
ultraestructural encontrada en todos los casos, estas células presentaron modificaciones
que afectaban fundamentalmente a la cantidad y tipo de prolongaciones emitidas a partir
de la membrana plasmática. Como se observa en la Figura R-23, las células NQO1-/mostraban una cantidad considerablemente mayor de prolongaciones tipo filopodios y
arrugas si se compara con MEFs control o con Nrf2-/-. Además, el número de uniones y
contactos entre células era también más acusado en este tipo celular, lo que confirma los
resultados obtenidos con microscopía confocal. No se encontraron diferencias
significativas entre las células Nrf2-/- y las control.
123
RESULTADOS: CAPÍTULO 4
MEFs
MEFs
NQO1-/-
NQO1-/-
Nrf2-/-
Nrf2-/-
Figura R-23. Imágenes representativas de MEFs, 2QO1-/- y 2rf2-/- observadas con el microscopio
electrónico de barrido. Se observan que en las células carentes de NQO1 aumenta el número de
filopodios así como el de contactos entre células. En cambio las células Nrf2-/- presentan una organización
estructural similar a la de los controles.
Los resultados obtenidos parecen apoyar la idea de un efecto sustancial de la carencia de
NQO1 sobre la organización y mantenimiento de la forma de la célula, así como del
establecimiento de comunicaciones intercelulares, modificándose por tanto el patrón de
relación entre las células. Por otra parte, las modificaciones descritas en el análisis con
124
RESULTADOS: CAPÍTULO 4
microscopía confocal, apuntan a que dicho papel está íntimamente relacionado con la
dinámica del citoesqueleto de actina.
125
RESULTADOS: CAPÍTULO 4
12. Microscopia Electrónica de Transmisión (MET).
Aunque la microscopía de barrido permitió observar a las células en el contexto del
cultivo y en toda su extensión, este tipo de técnica no ofrece información acerca de la
ultraestructura de los orgánulos subcelulares y de los posibles cambios que
experimenten en función de la carencia de los genes que codifican para NQO1 o Nrf2.
Por ello, y para tener una visión global acerca de la respuesta morfológica de estas
células, se prepararon cultivos que fueron procesados para MET como se detalla en el
apartado 21.1 de materiales y métodos.
Las características generales de los tres tipos de células se muestran en la Figura R-24
donde, en una primera aproximación visual, se aprecia un aparente incremento en el
número de mitocondrias en las células carentes de NQO1 y Nrf2. El análisis
morfométrico realizado confirmó esta primera impresión. Así, se comprobó que ambos
tipos celulares presentaban un incremento significativo en la superficie de célula y/o
citoplasma ocupada por dicho orgánulo (Figura R-25). Sin embargo, el análisis
planimétrico de las mitocondrias individuales mostró que éstas eran significativamente
menores en las células NQO1-/- y prácticamente idénticas entre sí en las Nrf2-/- y MEFs
control (Figura R-26). Por otra parte, encontramos un incremento en la densidad
electrónica de la matriz mitocondrial también en células NQO1-/- y en menor medida en
las Nrf2-/- (véase Figura R-24). No se detectaron cambios significativos en el resto de
los orgánulos subcelulares.
126
RESULTADOS: CAPÍTULO 4
Figura R-24. Imágenes que muestran el aspecto ultraestructural de los tres tipos celulares
estudiados. Las imágenes de la izquierda corresponden a porciones de células de los distintos tipos.
Tanto en las NQO1-/- como en las Nrf2-/- se aprecia un incremento en el número de mitocondrias, así
como en la densidad electrónica de la matriz frente a los MEFs control. A la derecha se muestran
imágenes representativas de mitocondrias a mayor magnificación (CG, complejo de Golgi; N, núcleo,
RER, retículo endoplásmico rugoso; se muestran algunos ejemplos de mitocondrias señalados con
flechas).
127
RESULTADOS: CAPÍTULO 4
*
*
0,090
superficie de célula ocupada
por mitocondrias (µm2 / µm2)
0,080
0,070
0,060
0,050
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
MEFs
NQO1-/-
Nrf2-/-
*
*
superficie de citoplasma ocupado
por mitocondrias (µm2 / µm2)
0,100
0,090
0,080
0,070
0,060
0,050
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
MEFs
NQO1-/-
Nrf2-/-
Figura R-25. Diagramas que muestran la porción de célula (arriba) y citoplasma (abajo) ocupada
por mitocondrias en los tres tipos celulares. Los datos están expresados en µm2 de mitocondrias/µm2 de
célula total (arriba) o de citoplasma (abajo). Se cuantificaron aproximadamente 15 células de cada tipo. *
p < 0,05 versus MEFs control
128
RESULTADOS: CAPÍTULO 4
***
Diámetro de las mitocondrias (µm)
0,450
0,400
0,350
0,300
0,250
0,200
0,150
0,100
0,050
0,000
MEFs
NQO1-/-
Nrf2-/-
Figura R-26.- Diagrama que muestra variaciones en el diámetro medio mitocondrial en los tres
tipos celulares. Las células NQO1-/- mostraron una disminución significativa (*** p< 0,001) frente a las
control. No se encontraron cambios en las Nrf2-/-. Los datos, expresados en µm, se corresponden con la
media de unas 100 mitocondrias por experimento.
Las mitocondrias se describen en ocasiones como "las plantas generadoras de energía"
de las células, debido a que producen la mayor parte del suministro de ATP, que se
utiliza como fuente de energía química. Además de esta función, las mitocondrias están
implicadas en procesos tales como señalización, diferenciación y muerte celular
programada, así como en el control del ciclo y crecimiento celular (McBride, Neuspiel
et al. 2006), de lo que se deduce el papel crucial de este orgánulo en el metabolismo y
dinámica celular. Desde este punto de vista, no resulta especialmente sorprendente que
cambios tan drásticos ocurridos en las células que afectan al crecimiento, a la defensa
antioxidante, a la forma y contacto entre células, como ocurre en las NQO1-/- y Nrf2-/-,
vengan acompañados de alteraciones ultraestructurales y, en este sentido, es esperable
que afecten a uno de los orgánulos más lábiles de la célula como es la mitocondria
(Chan 2006).
En nuestro caso, parece que la falta de alguno de los genes estudiados induce cambios
importantes que afectan a las mitocondrias no sólo a nivel cuantitativo, estructural y
ultraestructural, sino también a nivel cualitativo, como se desprende del cambio en las
características de contrataste de la matriz mitocondrial, especialmente en las células
NQO1-/-. Estos resultados son compatibles con los obtenidos por Koopman et al (2007)
129
RESULTADOS: CAPÍTULO 4
en
fibroblastos
dérmicos
de
niños
con
deficiencia
severa
en
actividad
NADH:ubiquinona reductasa, donde encontraron fragmentación de las mitocondrias y
cambios en el patrón de su distribución en las células al tiempo que se incrementaban
los niveles de ROS en la mismas (Koopman, Verkaart et al. 2007).
Más recientemente, Sauvanet et al (2010) (Sauvanet, Duvezin-Caubet et al.) han
revisado los efectos de diversos inhibidores de los complejos mitocondriales en la
estructura de este orgánulo encontrado cambios de diversa índole (fragmentación,
cambios de forma, incremento o disminución del número total de mitocondrias por
célula, etc.) y señalando la dificultad que entraña asociar una terminado estatus
energético de la célula (alterado, por ejemplo, por un funcionamiento defectuoso de
alguno de los complejos mitocondriales) con una morfología mitocondrial determinada.
Por otra parte, las células tumorales presentan abundantes y variables alteraciones en
sus mitocondrias, y aunque no sea posible asignar una alteración determinada a un tipo
concreto de neoplasma, en algunos tumores se ha encontrado una disminución en el
tamaño mitocondrial con aumento de la condensación de la matriz (Arismendi-Morillo
2009), lo que es parcialmente compatible con nuestros resultados obtenido en células
NQO1-/-.
En resumen, tanto las células NQO1-/- como las Nrf2-/- presentan alteraciones
ultraestructurales en sus mitocondrias que probablemente estarán relacionadas con su
capacidad y/o consumo energético además de con la dinámica alterada de estas células
en sus patrones de crecimiento celular. Sin embargo, los resultados obtenidos no
permiten establecer una relación inequívoca entre los cambios morfológicos
mitocondriales y el resto de las modificaciones inducidas por la falta del gen.
130
COCLUSIOES
______________________________________________________________________
CONCLUSIONES
- La actividad NQO1 se induce durante la senescencia celular y los primeros pases de
inmortalización en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) controles.
- La falta de NQO1 produce una inhibición temprana del crecimiento de los MEFs, pero
no afecta a la inmortalización. En cambio, la carencia de Nrf2, provoca una activación
temprana del crecimiento, con una inhibición aparente de la senescencia en estas
células.
- NQO1 y Nrf2 afectan al límite de proliferación del cultivo. Mientras que la falta de
NQO1 alarga la vida de los cultivos, la falta de Nrf2 la acorta.
- Tanto NQO1 como Nrf2 intervienen en la regulación del crecimiento celular. La falta
de NQO1 aumenta el crecimiento de los MEFs inmortalizados, mientras que la falta de
Nrf2 lo reduce. Además, el efecto de NQO1 sobre la regulación del crecimiento de los
MEFs es directo.
- La falta de Nrf2 produce alteraciones funcionales en el sistema de endomembranas en
los MEFs.
- La falta de NQO1 o de Nrf2 produce cambios en otras proteínas con función
antioxidante, disminuyendo los niveles de especies reactivas de oxígeno, probablemente
a través mecanismos de hormesis.
- El abordaje proteómico permite demostrar que la falta de NQO1 afecta tanto a
proteínas estructurales y de estrés, como a otras implicadas en la diferenciación y
proliferación celular
- La falta de NQO1 produce alteraciones en la organización del citoesqueleto de actina,
la organización y mantenimiento de la forma de la célula, así como del establecimiento
de comunicaciones intercelulares, modificándose por tanto el patrón de relación entre
las células. Sin embargo, estas alteraciones estructurales parecen estar relacionadas
indirectamente con la falta de NQO1. La organización y mantenimiento del
citoesqueleto de actina depende en parte de NQO1, lo que implica que tanto la forma
celular como el patrón de relación entre células dependen también de este enzima. Sin
133
CONCLUSIONES
embargo, los resultados de los experimentos de transfección del gen no parecen indicar
un papel directo de NQO1 en estos procesos.
- La falta de NQO1 y de Nrf2 provoca alteraciones ultraestructurales en las
mitocondrias de los MEFs. NQO1 y Nrf2 juegan un papel relevante en el
mantenimiento de la ultraestructura y posiblemente en la función mitocondrial.
134
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