Identifi cación de Conexina 32 en membranas de mitocondria de... corazón en ratones Cx43KI32

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PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008
Identificación de Conexina 32 en membranas de mitocondria de hígado y de
corazón en ratones Cx43KI32
Núñez E&, Jorge I&, Serrano H&$, Martínez-Acedo P&, Navarro PJ&, Pérez D&, Miró-Casas E#,
García Dorado D#, Vázquez J.&
&
Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Madrid,
Universidad de Puerto Rico, Arecibo, #Servicio de Cardiología, Hospital Vall d’Hebron, Barcelona,
España
$
Introducción
Las uniones gap (UG) son sistemas de comunicación de la membrana celular que une los citoplasmas de células adyacentes. Están constituidas
por proteínas de membrana denominadas conexinas (Cx), que en grupos de seis rodean un poro de
la membrana formando un hemicanal o conexón.
Las UG permiten actividades de coordinación rápida como la contracción del músculo cardíaco o
la transmisión de señales eléctricas neuronales. En
el corazón predomina la Cx43, localizada principalmente a nivel de los discos intercalados (DI)
del miocardio ventricular. El precondicionamiento isquémico (IP) (isquemia+reperfusión) retrasa
la muerte de los cardiomiocitos tras un período
prolongado de isquemia. La Cx 43 se expresa en
los cardiomiocitos (Schulz et al., 2004) y está implicada en este proceso; sin embargo el estudio de
la distribución subcelular de esta proteína no está
clara todavía. Por otra parte, se ha observado que
el precondicionamiento isquémico no tiene lugar
en ratones Cx43KI32 (García-Dorado et al., 1997).
El objetivo de este trabajo fue la identificación de
Cx43 en membrana mitocondrial de cardiomiocitos
de rata y estudio de la distribución mitocondrial de
la Cx32 en ratones transgénicos Cx43KI32 mediante espectrometría de masas.
Material y métodos
El flujo metodológico se esquematiza en la Figura 1. Las proteínas extraídas de la mitocondria de
hígado y corazón de ratón y de ratones Cx43KI32
se separan por SDS-PAGE y se someten a digestión
tríptica. Posteriormente, las muestras se analizan
mediante espectrómetría de masas. En primer lugar,
se realiza una búsqueda contra una base de datos de
ratón para identificar los péptidos correspondientes
a Cx43 y Cx32. Posteriormente, se utiliza la técnica
SMIM (selected MS/MS ion monitoring) (Jorge et
al., 2007), para concentrar la potencia de la trampa
iónica lineal sobre los péptidos derivados de estas
dos proteínas, llevando a cabo varias etapas de fragmentación (MS/MS) y subfragmentación (MS3).
Resultados
Se identificó, de forma completamente inequívoca, un péptido de la Cx43 en membrana mitocondrial de cardiomiocitos de rata (TYIISILFK) y
dos péptidos de la Cx32 en mitocondria de hígado
de ratón: LEGHGDPLHLEEVKR y LLSEQDGSLKDILR. Estos péptidos no se identificaron en la
mitocondria de corazón de ratones Cx43KI32.
Conclusiones
A partir de este estudio podemos concluir que
mientras que la Cx43 se expresa en mitocondria de
corazón de rata, la Cx 32 no se expresa en mitocondria de corazón de ratones Cx43KI32. El resultado
apoya el papel de la Cx43 en el proceso de precondicionamiento isquémico.
Bibliografía
García-Dorado D., Inserte J., Ruíz-Meana M., González
M.A. et al. 1997. Circulation 96: 3579-86
Schulz R., Heusch G. 2004. Cardiovascular Research
62: 335-44
Jorge I., Miró E., Villar M., Ortega-Pérez I. et al. 2007.
Journal of Mass Spectometry 42: 1391-1403
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PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008
6
Intensity
556.4
b30+
296.3
y”2 +
a3+
286.4 294.2
4
5
y20+
276.2
2
0
solubilización con SDS
Intensity
833.6
556.4
K
b30+
296.1
8
6
y”2+
294.2
4
5
70
b50+
522.4
+
y”3
407.3
y”4
520.4
a4+
399.9
b3 +
314.2
y5 0+
b50+ 589.3
556.4
y”5+
607.4
[b5-I]+
443.3
b4+
427.3
b6*+
685.5
b40+
584.7
0
200
300
400
m/z
500
600
700
J
400
a2+
237.11
b2+
265.07
Intensity
b6+
b6
669.4 687.4
0+
[b6-I]+
574.4
b7+
815.6
b7*+
798.7
a6+
659.4
y”6+
607.7
600
b70+
797.4
800
700
y”4+
720.50
y”6+
520.36
b4 +
520.36
b40+
473.0
y”3 +
833.59
y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2
T Y I I S I L F K
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8
y”5+
607.47
a4+
b3 +
378.26 463.28
40
y”5+
607.7
500
50
833.6
y6 y5 y4 y3 y2
a5+
512.4
60
549.1
300
Intensity
60
a5+
546.4
b3 b4 b5 b6 b7
b5+
427.3
+
300
100
50
a4+
399.3
b6+
702.5
b1 b2 b3 b4 b5
b5+
574.5
y”4+
520.4
I I S I L F K
2
833.6
40
549.1
b40+
409.3
0
200
30
[b6 0-I]+
556.4
b4+
427.3
10
42.39
549.1
10
20
b4
409.2
y”3 +
407.3
mitocondria
[b60-II]+
443.3
D
10
b3+
314.1
Retentio n Time (min)
12
15
I S I L F K
0+
720.5
720.5
y5 y4 y3 y2 y1
[b50-II]+
330.2
L
549.1
10
549.1
[b50-I]+
443.3
8
42.23
E
15
30
b7+
804.48
2+
20
y”8+
294.23
10
200
300
y”1
b70+
540.42
b6+
786.47
b5+
691.45
578.28
y”7 +
407.33
400
500
600
700
800
y”2+
996.62
b8+
923.49 b80+
933.49
900
1000
digestión
péptidos
Figura 1. Esquema del proceso de identificación de Cx43 en la membrana mitocondrial de cardiomiocitos de rata
Perfil de expresión proteica diferencial de la infección porcina con PCV2 por
SDS-PAGE, marcaje enzimático mediante isótopos estables (16O/18O) y trampa
iónica.
Ramírez-Boo M1., Serrano H2., Núñez E2., Jorge I2., Vázquez J.2, Segalés Q.3, Garrido J. J.1, Moreno
A1.
1
Dpt. Genética, Universidad de Córdoba- CSIC; Córdoba. 2Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica,
CBMSO (CSIC-UAM); Madrid. 3Universitat Autónoma de Barcelona (CReSA); Barcelona.
Introducción
El circovirus porcino tipo 2 (PVC2) es el agente
primario causante del llamado síndrome del destete, enfermedad que afecta al sistema inmune y al
patrón de expresión de muchas proteínas del cerdo.
Con vistas a caracterizar los mecanismos inmunológicos implicados en la interacción cerdo-PCV2,
hemos realizado estudios de expresión diferencial
en ganglios linfáticos mediante una combinación
de SDS-PAGE, seguida de una digestión en gel de
las proteínas separadas, marcaje de los péptidos con
16
O/18O e identificación y cuantificación con trampa
iónica lineal.
Material y métodos
Diez cerdos obtenidos por cesárea y privados
de calostro (4 controles y 6 inoculados con PCV2)
fueron sacrificados, comprobándose que habían de-