APORTE DE LA CITOMETRIA DE FLUJO AL ESTUDIO DE SINDROMES
HEMOFAGOCITICOS
TÍTULO:
Autores:
Sanz, Marianela1*; Mitchell, Raquel2; Bernasconi, Andrea3; Prieto, Emma4; Danielian, Silvia5;
Rossi, Jorge6.
Servicio o Área, y sub Áreas
1
Servicio de Inmunología y Reumatología. Laboratorio de Inmunología Celular.
Hospital de Pediatría Prof. Dr. Juan P. Garrahan.
Buenos Aires, Argentina.*E-mail del autor: [email protected]
El Síndrome Hemofagocítico o Linfohistiocitisis Hemofagocítica (LH) es una patología grave y fatal que se
debe a una activación descontrolada de linfocitos T y macrófagos frente a la incapacidad del sistema
inmune de generar una respuesta efectiva.
Geneviève de Saint Basile, Gaël Ménasché and Alain Fischer
En condiciones normales durante una infección viral el sistema inmune se activa generando una respuesta
citotóxica para lograr la erradicación de la célula infectada. Eliminado el patógeno del sistema, la respuesta
inmune se autolimita por diferentes mecanismos que incluyen la destrucción de células efectoras por
citotoxicidad. La mayoría de las células efectoras mueren, quedando algunas como linfocitos T de memoria.
Tanto la eliminación de células infectadas como la autolimitación de la respuesta que se genera utilizan la
misma maquinaria citotóxica. Uno de los mecanismos es a través de la perforina, proteína que induce poros
en la membrana de la célula blanco, conduciendo a su muerte o apoptosis.
En pacientes con LH, frente a la misma infección, se produce una expansión descontrolada de los linfocitos
T sostenida por la persistencia de la infección, ya que hay una falla intrínseca en las células capacitadas para
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erradicar al patógeno. Esto genera una secreción de citoquinas por parte de los linfocitos activados que
activan macrófagos, los cuales activan a más linfocitos.
Altos niveles de citoquinas inflamatorias son secretadas y generan una respuesta inflamatoria sistémica.
Esto lleva a que los macrófagos activados fagociten células (hemofagocitosis) y junto con linfocitos
activados infiltren distintos órganos que pueden llevar a la falla del órgano.
Clínicamente es una enfermedad no maligna que se caracteriza por fiebre, hepatoesplenomegalia,
citopenias y hemofagocitosis en médula ósea, bazo, hígado y ganglios linfáticos.
Desde el punto de vista de los parámetros bioquímicos se presenta con hipertrigliceridemia y/o
hipofibrinogenemia, ferritina elevada, aumento del receptor soluble de IL-2(sCD25), disminución o ausencia
de funcionalidad de células Natural Killer (NK), subpoblación linfocitaria que se encarga de ejercer
citotoxicidad.
Se conocen formas primarias asociadas a defectos genéticos y secundarias asociada a infecciones,
trastornos autoinmunes y neoplasias. Dentro de las formas primarias, se describe la Linfohistiocitisis
Hemofagocítica Familiar (LHF), de aparición frecuentemente temprana, determinada por mutaciones en
genes de herencia autosómica recesiva. Estos genes codifican para proteínas involucradas en la maquinaria
citotóxica que linfocitos T y células NK utilizan para erradicar, por ejemplo, infecciones virales.
En base a la proteína involucrada se conocen 4 tipos de LHF, clínicamente indiferenciables:
*LHF2 por defectos en perforina, proteína (codificada por gen PRF1) contenida en gránulos citotóxicos de
las células citotóxicas y que afecta la formación de poros en la célula que debe ser atacada para ser
destruida, por ejemplo, una célula infectada por un virus.
*LHF3 por defecto en Munc13-4, (gen UNC13D),
*LHF4 por defecto en Sintaxina-11 (gen STX11),
*LHF5 por defecto en Munc18-2 (gen STXBP2).
Estas 3 proteínas participan en distintos pasos del tráfico de los gránulos secretorios hacia la superficie de
las células citotóxicas y permiten que los mismos lleguen a la interfase (sinapsis) entre estas células y la
célula blanco para poder liberar su contenido de granzimas y perforinas. Este proceso se conoce como
degranulación y al estar defectuoso se impide la liberación normal del contenido de los gránulos a las
células infectadas.
Célula T citotóxica
Monocito/
Macrófago
Munc13-4
Sintaxina-11
Munc18-2
Perforina
Célula blanco
Desde el laboratorio se pueden discriminar estas funciones por distintos ensayos.
El objetivo de este trabajo es presentar:
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a) las técnicas inmunológicas que se aplican en el laboratorio de Inmunología Celular para discriminar
defectos en la maquinaria citotóxica y decidir una búsqueda molecular para diagnóstico de LH.
b) los resultados obtenidos en pacientes con sospecha de LH que fueron estudiados por estas técnicas.
Materiales y métodos:
Se estudiaron 10 pacientes, 7 de sexo femenino y 3 de sexo masculino, con sospecha de LHF (edad x: 2a; r:
1m-5a). Todas las determinaciones se realizaron en paralelo con una muestra de donante sano como
control del ensayo.
Los estudios realizados comprenden
1) Ensayo de citotoxidad estándar por liberación de Cr51.
La funcionalidad citotóxica de las células NK se determina por la cantidad de Cr51 liberado en el
sobrenadante de cultivo luego de 4hs de incubación de células mononucleares de sangre periférica del
paciente con células de la línea celular K562, (previamente incubadas con Cr51, de manera que el
radioisótopo quede incorporado en la célula y al ser destruída por la célula NK, sea liberado al
sobrenadante). La cantidad de cuentas radioactivas en el sobrenadante es proporcional a la cantidad de
cromo liberado y está directamente relacionado con la funcionalidad de las células NK presentes entre las
células mononucleares del paciente.
2) Técnicas por Citometría de Flujo.
Marcación de perforina: detección citoplasmática de la proteína en células NK por anticuerpos específicos
post permeabilización de la membrana celular.
Ensayo de degranulación para detección de CD107a: El CD107a (LAMP-1) es una proteína asociada en la
superficie luminal de los gránulos citotóxicos. Cuando se produce la activación y fusión de los gránulos con
la membrana plasmática de la célula NK, LAMP-1 queda expuesta en la superficie celular. De esta manera
puede ser detectada por anticuerpos específicos en la superficie de células NK y medida por Citometría de
Flujo.
Brevemente la técnica consiste en enfrentar células mononucleares de sangre periférica del paciente con la
línea celular K562 (célula activadora) durante dos horas. Posteriormente las células se marcan con
anticuerpos para identificar las células NK (CD56) y el CD107a. La expresión de CD107a es indicativa de una
degranulación normal. Si las células responden a este estímulo, es decir degranulan, van a expresar CD107a
en su superficie.
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Resultados:
Tabla de resultados de ensayos de citotoxicidad NK, expresión de perforina, degranulación (CD107a) y
determinación molecular de los genes involucrados en LHF, realizado en 10 pacientes.
GI
SM
VB
AL
LJ
LA
AM
CD
MR
BT
Edad
1a
3a
1m
8m
18m
5a
3m
2m
11a
11m
Sexo
F
F
F
F
F
F
F
M
M
M
% NK
8%
2,5%
7%
6%
5,8%
12%
1%
27%
18%
31%
Actividad NK
(VN: 39; r: 16-50%)
0,4%
0,4%
0,7%
ND
ND
O%
0%
ND
ND
ND
N
N
N
N
A
A
N
N
N
N
10%
5,4%
ND
2,6%
ND
ND
9,2%
6,5%
18%
7,6%
CD107a c/IL-2
(VN:30%; r: 27-37)
13%
4%
4,9%
ND
ND
ND
69%
16%
58%
31%
PRF1
ND
ND
ND
ND
LHF2
LHF2
D
D
ND
ND
STX11
LHF4
LHF4
D
D
ND
ND
D
D
D
D
STXBP2
ND
ND
LHF5
D
ND
ND
D
D
D
D
UNC13D
ND
ND
ND
LHF3
ND
ND
D
D
D
D
Expresión de
perforina
CD107a s/IL-2
(VN:17%; r:2-30)
N: normal; A: ausente; ND: no determinado; D: descartado; LHF: Linfohistiocitisis Hemofagocítica Familiar.
Conclusiones:
La actividad NK estaba defectuosa en los cinco pacientes en los que fue medida, cuatro de ellos
presentaban defectos en alguna de las proteínas descriptas (2 pacientes con LHF4, 1 paciente con LHF5, y
un paciente con LHF2).
La ausencia de expresión de perforina medida por Citometría de Flujo permitió llegar al diagnóstico de LHF2
en dos pacientes.
Defectos en los mecanismos de degranulación medidos por CD107a fueron encontrados en cuatro
pacientes, basado en una baja o casi ausente expresión de CD107a. Esto se correlacionó con mutación en
STX11 en dos de ellos y con mutación en STXBP2 y en UNC13D en otros dos.
Otros cuatro pacientes presentaron una expresión anormalmente alta de CD107a. En todos se descartó la
presencia de mutaciones en los genes implicados en los mecanismos de granulación sugiriendo en estos
pacientes el diagnóstico de LH secundaria.
El ensayo de CD107a permite discriminar entre los pacientes que deben someterse o no a la búsqueda de
mutaciones para Munc13-4, Sintaxina-11 y Munc18-2.
La aplicación de estas técnicas inmunológicas resulta útil para diferenciar los mecanismos involucrados en
pacientes con LH, orientando así la búsqueda de mutaciones para el diagnóstico molecular.
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