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INFORMACIÓN GENERAL DEL
PROYECTO
TITULO DEL PROYECTO
Estrategia de producción y formulación de Hongos Entomopatógenos
seleccionados para su empleo como bioinsecticidas
CADENA
Chile
TIPO DE PROYECTO
Investigación Aplicadacontinuación
SUBSECTOR
ESLABON
Control Biológico
MACRO CADENA
Agricultura orgánica
Agricultura
Fecha de inicio
Fecha de termino
Tema
Sub Tema
Diciembre 2009
Diciembre 2013
Bioinsecticidas
Hongos Entomopatógenos
DEMANDA QUE ATIENDE
Control Biológico de plagas del chile
GRUPO DE INTERES
Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Guanajuato
Productores de Chile a nivel regional y estatal
MUNICIPIO
Irapuato, Gto.
PROBLEMÁTICA
El chile es un cultivo originario de la zona tropical de América y se calcula que la demanda
internacional crece 13% anualmente. Para aprovechar la creciente demanda del producto, es
indispensable desarrollar estrategias para incrementar la producción, promover nuevos usos y
presentar variedades cada vez más comerciales. México ocupa el segundo lugar en producción
mundial de chile y entre los principales estados productores está Guanajuato. Entre las estrategias de
los productores nacionales se tiene contemplado impulsar el cultivo orgánico del mismo. El control
biológico de las plagas de insectos del chile es una alternativa al uso de químicos y apoya a evitar
pérdidas de rendimiento por insectos plaga e impulsa el desarrollo de la agricultura orgánica, ya que
por medio de enemigos naturales se regulan las poblaciones de forma efectiva e inocua para el
ambiente, además de impulsar el crecimiento de las poblaciones de insectos que son enemigos
naturales de la plaga. En el Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Guanajuato (CESAVEG)
se tienen aislados de los hongos Beauveria bassiana y Metarhizoium anisopliae que han mostrado
potencial para el control de dos de las plagas de este y otros cultivos: el pulgón saltador Bactericera
cockerelli (Sulc.) (Hemiptera: Triozidae) y gallina ciega Phyllophaga spp. (Coleoptera: Melolonthidae).
Para optimizar la eficiencia y estimular la producción y comercialización de estos hongos, es necesario
tener datos completos para su registro o incluso patentado, por lo cual en la primera etapa de este
proyecto se propuso: i) obtener cultivos monospóricos de los aislados seleccionados de cada hongo en
base a sus cualidades metabólicas; ii) obtener la descripción molecular de cada aislado para su
identificación con fines de detección comercial y rastreo en campo (causa-efecto); iii) determinar el
modo de acción entre infección e intoxicación de los insectos por cada aislado. Al 30 de abril del 2010
se tiene un avance de más del 60%, con resultados totales de las primeros 2 objetivos y parciales del
último. En esta segunda etapa del proyecto, los objetivos son: iv) seleccionar los ingredientes del
medio de cultivo y las condiciones de crecimiento requeridas para asegurar la infección e intoxicación
de los insectos a controlar; v) escalar la producción de ambos entomopatógenos por fermentación
líquida sin afectar las cualidades de efectividad; vi) empatar el producto de fermentación líquida con la
técnica de producción bifásica (fermentación líquida y sólida). En la siguientes etapas se propone: vii)
seleccionar las técnicas e ingredientes de formulación de los hongos que aseguren su efectividad en
campo y una vida de anaquel de al menos 18 meses a temperatura ambiente; viii) realizar estudios de
auto-diseminación e identificación de los hongos en campo; ix) elaborar manuales guía de los procesos
de elaboración de cada producto hasta formulado y empacado; x) elaborar manuales guía de los
procesos de control de calidad para la certificación de cada producto comercial, para con esto poder
patentar y/o registrar los productos para su comercialización.
Palabras clave: Escalamiento, bioinsecticidas fúngicos, Bactericera cockerelli, Phyllophaga spp., chile,
Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae
INTRODUCCIÓN
El uso de agentes fúngicos para el control de insectos se basa en su habilidad de infectar,
colonizar y consumir activamente a su hospedero. Debido a esto, operan bien como bioinsecticidas de
contacto (Jackson y Glare, 1992).
La aplicación de hongos entomopatógenos es una práctica que ha cobrado un mayor interés al
comprobarse las ventajas de inocuidad y auto-diseminación, especialmente aquellos reconocidos por
su capacidad para causar enfermedades crónicas y muerte, tanto a los estados larvarios de
Phyllophaga spp y ninfales y adultos de B. cockerelli (Morales, 2002; Rodríguez del Bosque et al.,
2003). Los métodos comerciales de producción de propágalos de hongos como bioinsecticidas,
implican el uso de un hospedero vivo, y su efecto en el crecimiento ya sea por fermentación en cultivo
líquido, en substrato sólido, o bifásica o mixta, la cual combina ambos tipos de fermentación. Las
tecnologías de producción, formulación y aplicación juegan un importante papel para asegurar el
control efectivo de la plaga en condiciones de campo (Behle et al., 2009). Además, se ha demostrado
que la producción de ciertos metabolitos permite incrementar su efectividad y reducir el tiempo
requerido para causar la muerte. El uso y éxito comercial de todos los bioinsecticidas depende de los
métodos de producción a bajo costo, de la estabilidad del producto, de una vida de anaquel adecuada
y su efectividad bajo condiciones de campo (McDougall, 2003).
Para generar un producto comercial, los biopesticidas deben ser capaces de producir altas
concentraciones de esporas rápidamente, ya sea en medios líquidos o sólidos y debe de ser efectivo y
permanecer estable durante el almacenado, lo que conlleva a optimizar la formulación del producto
final. El secado es el método que se usa principalmente para estabilizar propágulos biopesticidas,
aunque para el caso de hongos entomopatógenos, el empleo de emulsiones en aceite ha dado los
mejores resultados. Los propágulos se mezclan con varios ingredientes, que pueden incluir
polisacáridos que forman cristales abrasivos, agentes desecantes, surfactantes y/o antioxidantes.
Uno de los principales problemas para el uso de hongos como biopesticidas es el costo de producción
(McDougall, 2003). Los hongos crecen más lentamente que las bacterias y frecuentemente no
esporulan o lo hacen a muy bajos niveles en cultivos líquidos sumergidos. Se he demostrado que el
ambiente nutritivo en el que se producen los biopesticidas tiene un gran impacto en la calidad y
cantidad del ingrediente activo. La habilidad de las esporas fúngicas para germinar rápidamente,
producir estructuras de infección de manera constante y sobrevivir al secado y almacenaje, se ha
asociado al medio ambiente nutritivo en el que se producen, al igual que en el formulado donde se
conserva. En virtud de que los cultivos, producidos a través de fermentaciones en medio líquido en
tanque cerrado (batch) están en un medio homogéneo, las condiciones nutricionales pueden ser
controladas para mantener cantidades óptimas, para obtener propágulos bioinsecticidas de alta
efectividad, pero se han observado diferentes desventajas que incluyen: el producto final muestra
menor vida de anaquel, baja o nula esporulación, y con frecuencia producen esporas de corta vida o
incapaces de sobrevivir al secado, entre otras (Bode, 2009). Es por esto que dentro de las estrategias
de producción se ha contemplado la fermentación bifásica, en la cual se usa el producto de
fermentación líquida como inóculo para la fermentación sólida. Además, se ha desarrollado el equipo
de procesamiento a bajo flujo para el cosechado y secado del biopesticida, el cual se puede programar
para lograr que se tengan lotes homogéneos y bajo condiciones de control de calidad más altas
(Steinkraus y Boys, 2005).
Para escalar la producción, se recomienda el proceso bifásico, esto involucra el monitoreo y
control de calidad del proceso, para asegurar la efectividad del bioinsecticida. En la primera etapa de
este proyecto se logró obtener cultivos monospóricos de aislados seleccionadas de los hongos B
bassiana y M. anisopliae, obtenidos de B. cockerelli, Epilachna varivestis y Phyllophaga spp., de los
cuales se tienen resultados parciales de actividad enzimática y actividad insecticida al producirlos por
fermentación líquida. También se determinaron los marcadores necesarios para realizar la tipificación
genotípica, gracias a lo cual se tiene la descripción molecular de cuatro aislados de B. bassiana y dos
de M. anisopliae, y se tienen resultados parciales de la producción de metabolitos, actividad insecticida
y respuesta inmune, además de algunos bioensayos con un formulado tipo emulsión, esto al 30 de
abril del 2010. Esperamos que en la siguiente etapa del proyecto se logre seleccionar los ingredientes
idóneos del medio de cultivo y condiciones de crecimiento requeridas para asegurar su efectividad
(infección e intoxicación) contra los insectos a controlar; escalar el proceso de producción de cada
aislado por fermentación líquida sin afectar las cualidades de efectividad definidas; empatar el producto
obtenido de fermentación líquida con la técnica de producción bifásica (utilizar este producto y
formularlo o continuar con fermentación sólida). Para la tercera etapa se pretende seleccionar las
técnicas, metodologías e ingredientes para formulación de cada aislado de cada hongos que aseguren
su efectividad en campo y una vida de anaquel de al menos 18 meses a temperatura ambiente; realizar
estudios de auto-diseminación y rastreo de los hongos en campo para definir hasta donde el efecto en
campo es resultado de la aplicación de las cepas del CESAVEG; elaborar manuales guía de los
procesos de elaboración de cada producto hasta formulado y empacado que detalle cada etapa del
proceso; y elaborar manuales guía de los procesos de control de calidad para el registro y la
certificación de cada producto comercial.
Justificación
El CESAVEG cuenta con aislados de los hongos Beauveria bassiana y Metarhizum anisopliae
que se obtuvieron de B. cockerelli y Phyllophaga spp además de Epilachna varivestis. De estos
aislados se logró determinar las características fenotípicas y genotípicas de los mismos. Además se
tienen avances de la producción de metabolitos, actividad insecticida y respuesta inmune, que al
completarlos nos ayudará a determinar el modo de acción y su potencial efectividad en campo,
además de ayudar a confirmar que los procesos de actividad biológica posterior a la aplicación de los
aislados, se debió a la efectividad y auto-diseminación de los mismos. En teoría, cada cepa y hongo
entomopatógeno pueden requerir condiciones nutricionales y fisicoquímicas diferentes para un óptimo
crecimiento y actividad insecticida, al igual que el soporte elegido para la formulación que permita
mantener al agente activo vivo pero inactivo, para asegurar una vida de anaquel comercialmente
aceptable. Para lograr optimizar la producción y formulación de un bioinsecticida a nivel industrial, se
requiere generar la información científica pertinente que permita determinar las condiciones idóneas de
crecimiento y desarrollo del agente activo para llevar el proceso a mayor escala, al igual que mantener
o incrementar su efectividad (actividad insecticida).
Objetivo General
Generar conocimiento relacionado al metabolismo de hongos entomopatógenos seleccionados,
producción a un nivel industrial y técnicas de formulación, que conlleve a la reducción de costos de
producción, estabilización, control de calidad, efectividad en campo y vida de anaquel que origine
productos bioinsecticidas económicamente factibles y confiables para su empleo en agricultura
orgánica y programas de manejo integrado de plagas.
Objetivos Específicos de la etapa dos
1. Evaluar la actividad insecticida individual o en conjunto de los cultivos monospóricos de los
aislados de B. bassiana y M. anisopliae sobre Bactericera cockerelli y Phyllophaga spp en
laboratorio.
2. Relacionar la efectividad de los aislados contra la inducción de la respuesta inmune de los
insectos evaluados en experimentos a nivel de invernadero.
3. Determinar las condiciones requeridas para asegurar la producción de metabolitos con
actividad insecticida generada en la cinética de crecimiento y determinar su influencia en el
desarrollo de esporas fúngicas y efectividad con ensayos paralelos a la cinética de crecimiento
en FML y FMS, como un parámetro de control de calidad.
4. Escalar la producción a nivel semi-piloto e industrial siguiendo los parámetros de control de
calidad previamente establecidos.
ANTECEDENTES
El chile en México ocupa el segundo lugar en volumen de producción y el tercero en superficie
cosechada, con 140 mil 693 hectáreas y una producción de un millón 853 mil 610 toneladas. Y a pesar
de este segundo lugar, México contribuye al mundo apenas con 9% de superficie y 8% de la
producción de chile.
El salerillo, Bactericera cockerelli (Sulc) es una de las plagas más importante del chile
(Capsicum spp.), jitomate (Lycopersicon esculentum Mill.) y papa (Solanum tuberosum L.) en México y
lleva a la pérdida de millones de dólares anualmente. Recientemente, la principal preocupación por la
infestación de este insecto se deriva a que además del daño que causa, es transmisor de fitoplasmas
(Lebsky et al., 2006; García, 2007). Para su control se usan insecticidas y los agricultores perciben que
su eficacia biológica no es satisfactoria debido al desarrollo de resistencia a los químicos (Vega et al.,
2008).
Datos obtenidos del reporte anual presentado por el CESAVEG en el 2008 (datos sin publicar),
Bactericera (=Paratrioza) cockerelli actualmente representa un serio problema en cultivos de jitomate y
chile como parte de los insectos vectores. Bactericera es considerado como transmisor de fitoplasmas,
causando la enfermedad conocida como “permanente” en tomate y chile. Se encuentra distribuida en
todo el estado y con poblaciones durante todo el año, con mayor densidad poblacional en los meses de
marzo a septiembre. Todos los trabajos de caracterización fitosanitaria de hortalizas durante los
últimos años, reflejan la importancia de esta plaga.
En cuanto a su distribución, Bactericera se encuentra en casi todo el estado de Guanajuato,
siendo un problema serio en aquellos municipios donde se siembra o se concentra la mayor superficie
de cultivos como chile, jitomate y tomatillo. Los municipios más afectados son Salvatierra, Celaya,
Silao, Pénjamo, Cortazar, Dolores Hidalgo, San Diego de la Unión, San Luís de la Paz, Acámbaro,
Juventino Rosas e Irapuato. Este insecto tiene incidencias de hasta el 95% en plantaciones a cielo
abierto, sobre todo en la región de Salvatierra, Celaya, Pénjamo y otras del Estado. En cultivos bajo
invernadero la incidencia llega a ser del 10 al 70%.
Con respecto a gallina ciega, esta se ha reportado en el complejo de plagas rizófagas,
acompañada del gusano alfilerillo, en el ciclo agrícola 2008 en los municipios de Acámbaro, Purísima
del Rincón, Valle de Santiago, Pénjamo, Apaseo el Alto, Jerécuaro y Manuel Doblado. Gracias a
medidas de prevención, se mantuvo estable en cuanto a sus niveles de incidencia con respecto al ciclo
anterior en la zona de riego. Los productores agrícolas que realizan una acción de control para este
tipo de plagas, protegen un mínimo de 500-kg/ha de grano de maíz y esto se incrementa en zonas de
temporal, en donde los niveles de recuperación fluctúan en una ton/ha. Analizando un área de trabajo
con respecto a varios ciclos históricos, los niveles de estados inmaduros de plagas rizófagas han
disminuido de 6 larvas x sitio de muestreo a una larva, lo cual ha permitido mejorar la fitosanidad del
cultivo. Siguiendo las metodologías de prevención, al implementar un sistema efectivo de control
biológico se podría mantener e incluso mejorar los programas fitosanitarios en el estado, y
probablemente a nivel nacional.
Una de las propuestas del control de ambos insectos es por medio de hongos entomopatógenos,
los cuales se producen a nivel industrial a nivel mundial. Los métodos iniciales de producción de estos
hongos se enfocaron en el uso del insecto hospedero o un medio artificial como vehículo de
crecimiento para el patógeno. Hoy en día, como lo fue entonces, el reto es el desarrollo de métodos
económicos para la producción de propágulos infecciosos. Para el desarrollo comercial, dentro de la
producción masiva también debe considerarse el costo y la estabilidad del biopesticida (Schisler y
Slininger, 1997). Una vez producido, el biopesticida se usa de manera similar a los insecticidas
químicos.
Pese a los esfuerzos en la investigación en control biológico de Phyllophaga spp. y B. cockerelli,
aún se está en una fase incipiente en lo referente al desarrollo de productos formulados de eficacia
aceptable. Sin embargo, se ha demostrado el potencial de algunos microorganismos y la necesidad de
usarlos en combinación con otras prácticas que permiten mejorar el control de los insectos
mencionados (datos no publicados).
La habilidad de las esporas fúngicas para infectar y matar insectos, es un factor clave que ha
llevado a su amplio uso como bioinsecticidas comerciales. Aunque las esporas fúngicas no requieren
la intervención de las defensas del hospedero para que la infección ocurra, debe haber humedad
ambiental desde la germinación de la espora hasta la penetración del tubo germinativo en el
hospedero. El propágulo infectivo se deposita y adhiere al insecto donde germina y ejerce presión
liberando enzimas (quitinasas, cutinasas) que producen la degradación de los tejidos, ablandándolos y
permitiendo la infección del hongo. Dentro del insecto, el hongo coloniza y se dispersa en la hemolinfa,
emitiendo sustancias micóticas (destruxina, desmetildestruxina) que afectan la fisiología y órganos
vitales hasta producir la destrucción de los tejidos, pérdida de sensibilidad, incoordinación de
movimientos, parálisis y posteriormente la muerte en un lapso variable de entre 4 y 8 días. El hongo
coloniza externamente el cadáver del insecto, produciendo y liberando millones de conidias infectivas
que son la fuente de inóculo para infectar a otros insectos (Castellanos, 1997).
Al igual que con Phyllophaga, también se ha reportado el empleo de entomopatógenos para el
control de B. cockerelli, pero sólo existen reportes genéricos de la posibilidad de uso de estos agentes
de control microbiológico. A este respecto, Velasco et al., (2004) reportaron una buena efectividad de
B. bassiana, M. anisopliae, P. fumosoroseus y Entomophthora virulenta en el manejo de poblaciones
de B. cockerelli en condiciones de invernadero. De igual forma, Castro et al., (2005) reportaron una
mortalidad diferencial de B. cockerelli en condiciones de laboratorio, dependiendo de la especie de
hongo que se utiliza, destacando un aislamiento particular de B. bassiana, mismo que al ser evaluado
en campo también mostró porcentajes de mortalidad en un modelo de dosis-respuesta.
Paralelamente, Díaz et al., (2005), reportaron una buena efectividad de Verticillium lecanii y B.
bassiana para el control de B. cockerelli en condiciones de campo en el cultivo de jitomate, y Soto et
al., (2006) mencionaron que el hongo B. bassiana del producto comercial Mycotrol y la cepa
denominada “Lygus”, resultaron ser sumamente efectivos para el control de la plaga en el cultivo de
chile.
Desde el desarrollo de la industria farmacéutica en la década de 1940, el uso de fermentación en
medios líquidos (FML) ha sido el método de elección para la producción industrial de varios productos
microbianos. La producción de biopesticidas no es la excepción. Todos los métodos de producción de
biopesticidas comerciales, aparte del uso de hospederos vivos, comparten inicios comunes que
incluyen el uso de fermentación en cultivos líquidos. En resumen, el proceso de producción de
biopesticidas comienza con el desarrollo de cultivos en lotes estables. Los lotes de cultivos del
biopesticida se usan para inocular cultivos de arranque en recipientes en agitación. Los cultivos
líquidos de biopesticidas se transfieren, posteriormente y de manera seriada, a recipientes más
grandes, como inoculo, dependiendo de la escala a la que se conduzca la producción. Un
requerimiento obvio para este proceso a gran escala, es un cultivo estable que produzca
uniformemente gran cantidad de propágulos eficaces de biopesticida, después de repetidos ciclos de
crecimiento. En el caso de producción de esporas fúngicas, se repite este proceso a gran escala hasta
que se alcanza un volumen suficientemente grande del producto.
Para métodos de producción de biopesticidas fúngicos en medio sólido (FMS) o bifásico (FB), se
usa la biomasa que se obtiene del proceso de FML como inóculo para la fase de crecimiento en
substrato sólido o como micelio formador de esporas.
Existen numerosas ventajas en el uso de métodos de FML para la producción de biopesticidas:
1. Son de costos relativamente bajos, debido a los procesos automatizados que pueden
hacerse a muy grandes escalas.
2. La tecnología necesaria para realizar los procesos de fermentación a tanque profundo
se ha ido perfeccionado con los años, por la experiencia que se tiene en la industria
farmacéutica y de bebidas.
3. Con equipos modernos de fermentación se puede controlar muy de cerca la
temperatura, pH, oxígeno disuelto y componentes nutritivos, factores que pueden
impactar profundamente en la productividad y calidad del biopesticida.
4. Realizar monitoreos programados para ajustar el crecimiento y mantener el control de
calidad del producto
Se deben de considerar el mecanismo de infección y el modo de acción de los hongos
entomopatógenos al momento de producir un bioinsecticida, para que tenga éxito comercial (capaz de
competir con un producto químico en efectividad y precio) (García-Gutiérrez et al., 2007). Para
propósitos de producción de agentes de biocontrol para aplicación en la agricultura, en el proceso de
producción a nivel de laboratorio, se busca proveer a los microorganismos un balance óptimo de
nutrientes, tanto macro como micro-elementos, para obtener un desarrollo con el máximo potencial de
biocontrol y eficiencia económica (Bartlett y Jaronski, 1988; Jackson et al., 2003). Para el caso de los
hongos, es muy importante evaluar el requerimiento y la combinación entre los nutrientes ya reportados
con la proporción del extracto de levadura y/o sales de nitrógeno (Wraight et al., 2001). Se ha visto
que para cada hongo y cepa, los valores óptimos son diferentes. En el escalamiento de la producción,
se puede proceder por fermentación en sustrato líquido y sólido. Para la primera opción, la
combinación de nutrientes y condiciones óptimas de fermentación (agitación/oxígeno disuelto, pH,
temperatura, etc.), se pueden determinar mediante cinéticas de crecimiento (Jackson et al., 1998),
combinadas con ensayos de actividad, ya que un buen crecimiento no garantiza la infectividad del
hongo (Stamets, 2003). Para el caso de FMS, se pueden evaluar granos de cereales como centeno,
cebada y trigo, y comparar su efectividad y costo frente al obtenido con arroz, soporte que se emplea
con mayor frecuencia para este propósito (Mendoça, 1992; Wraight et al., 2001). El grano quebrado,
humedecido y estéril, se inocula con el agente de biocontrol y se mantiene en aireación y asepsia, y al
igual que con la FML, se obtiene la curva de crecimiento adecuado para hongos (Wraight et al., 2001).
Por su parte, la fermentación en medio sólido (FMS) generalmente se limita a la producción de
agentes biopesticidas fúngicos. Esta técnica incluye la inoculación en substrato sólido nutritivo,
usualmente granos humedecidos o material inerte saturado con nutrientes líquidos, con biomasa
fúngica. Se provee al hongo de un medio propicio para su crecimiento, a medida que consume los
nutrientes presentes en el substrato sólido. Después de que el hongo ha agotado esos nutrientes, se
forman esporas aéreas en la superficie sólida del medio. La ventaja principal para usar métodos de
FMS es el hecho de que la mayoría de los hongos identificados como biopesticidas potenciales, son
hongos imperfectos (deuteromicetes), los cuales inician la formación aérea de esporas cuando crecen
en substratos sólidos. Debido a la simplicidad relativa del proceso, este método se práctica
ampliamente a escala comercial, particularmente en países donde está disponible la mano de obra
barata. El uso de la técnica de FMS para la producción de biopesticidas puede practicarse de varias
maneras, y fabricarse trampas, productos granulares y preparaciones de esporas asperjables (Moore y
Prior, 1993).
La elección del método de producción se determina de acuerdo con la plaga, la metodología de
aplicación disponible y el costo de mano de obra. Por ejemplo, si el agente activo va a usarse como
biopesticida de contacto para el control de insectos, las preparaciones de esporas deben producirse de
manera que puedan aplicarse por aspersión. El empleo de las bolsas de granos humedecidos,
esterilizados en autoclave, para la FMS es un método común en África, América Latina, Asia y Europa
Oriental. Las bolsas se abren, se inoculan con los cultivos líquidos del hongo entomopatógeno y se
vuelven a cerrar. Después de que el hongo en crecimiento consume los nutrientes del grano, las
bolsas se abren y su contenido se deja secar. El proceso de secado induce la esporulación. Se puede
controlar moderadamente la temperatura y el intercambio de gases usando bolsas pequeñas. Las
esporas se recogen de los granos cubiertos con el hongo (mohosos), enjuagando, aspirando o
moliendo el substrato sólido ya esporulado (Wraight et al., 2001).
En Estados Unidos y Europa se emplean métodos de FMS para la producción de bioinsecticidas
fúngicos, similares a los usados en Asia para la producción de alimentos fermentados. Los granos
humedecidos o substratos sólido inertes saturados con nutrientes líquidos se inoculan con la biomasa
fúngica obtenida de FML. Después, los substratos sólido inoculados se esparcen en capas delgadas
en charolas que se colocan en el fermentador de substrato sólido o en masa en fermentadores con
capacidad de mezcla. Durante los procesos de crecimiento y esporulación deben controlarse la
humedad, temperatura y aireación. Generalmente se emplean fermentadores de volumen moderado,
debido a que en fermentadores de substrato sólido puede ser difícil controlar las condiciones
ambientales (Jackson et al., 2003).
La producción a escalas mayores implica incrementar el número de fermentadores de volumen
moderado. Después de que se han sido consumidos los nutrientes en el grano por el hongo en
crecimiento, se incrementa el flujo de aire en el fermentador para secar la biomasa e inducir la
esporulación. La esporulación ocurre en la superficie del substrato sólido. La optimización de la
dimensión de las partículas y la proporción superficie–volumen incrementan la producción de esporas.
Ya concluida la esporulación, y cuando la totalidad del cultivo está seco, se separan las esporas de la
biomasa y todo el producto seco se muele hasta conseguir un polvo fino para permitir la aplicación por
aspersión. Utilizando estos métodos, en Estados Unidos y Europa se producen polvos conidiales de
hongos biopesticidas como B. bassiana, M. anisopliae y Trichoderma harzianum (Wraight et al., 2001).
Otro método de FMS incluye la inoculación de pastillas (prills) nutritivas con biomasa fúngica
obtenida de cultivos líquidos. Estas pastillas inoculadas se secan inmediatamente para estabilizar el
inóculo dentro del mismo (Eyal et al, 1992). Las pastillas nutritivas se producen para usarse como
inóculos granulares para el control de enfermedades de plantas e insectos móviles. La re-humectación
de las pastillas permite que crezca el biopesticida fúngico, consuma los nutrientes presentes en él y,
subsecuentemente, esporula en la superficie de la misma. En este caso, las esporas del biopesticida
se producen in situ. Las desventajas del método de producción de esporas en pastillas son los
requerimientos para condiciones in situ propicias para el crecimiento y esporulación del biopesticida, y
la necesidad de que la plaga esté en contacto pasivo con el propágulo infectivo (Wraight et al., 2001).
Así también, el método bifásico de producción de esporas (FB) puede usarse para producir
conidias para algunos biopesticidas fúngicos que no pueden inducirse a esporular en cultivos líquidos
(Walker, 1988). Este método se inicia con la producción en cultivo líquido de biomasa fúngica del
agente biopesticida. El medio líquido brinda al cultivo una dieta adecuada para retener en el micelio
fúngico los nutrientes y condiciones fisicoquímicas necesarias para la producción de esporas (AyalaZermeño et al., 2005). Para inducir la esporulación, la biomasa del micelio se deshidrata hasta formar
placas delgadas de micelio que después se secan lentamente con aire, frecuentemente en lapsos de
presencia de luz periódicos. A medida que se seca la biomasa, ocurre la esporulación en la superficie
de la placa del micelio. Usando esta técnica se han producido altas concentraciones de esporas del
hongo Alternaria cassiae, un agente de biocontrol para la maleza Cassia obtusif (Stowell et al, 1989).
Una ventaja de este método es que, después de un ciclo de FML, puede inducirse la esporulación de
los hongos que no esporulan en cultivos sólidos. La producción de esporas fúngicas en FMS requiere
un ciclo adicional de crecimiento en el substrato sólido. El escalamiento de la producción de hongos a
niveles mayores es una de las desventajas para usar FB. La producción de cantidades comerciales de
esporas de bioinsecticidas usando este método requiere que los cuartos o áreas extensas estén
estériles, para que el micelio se seque y esporule. A medida que aumenta la escala de producción se
dificulta más contrarrestar los problemas técnicos, como la extracción del agua, el intercambio de
gases, el control de la temperatura y mantener condiciones asépticas (Stowell et al, 1989). Durante el
proceso de cosecha de esporas se incurre en costos adicionales y deben mantenerse las condiciones
asépticas durante el retiro de las esporas de la placa del micelio. Es por esto que se ha sugerido
combinar el cosechado de esporas con la formulación, en un proceso biotecnológico de flujo.
Otro de los factores que pueden contribuir al éxito o fracaso en el control de insectos plaga con
hongos entomopatógenos lo representa el ambienta. Debido a las condiciones climáticas de altas
temperaturas y humedad en las cuales muchos plaguicidas son aplicados, el calor y la falta de una alta
humedad ambiental son un obstáculo importante para la infección fúngica por biopesticidas. Para
superar este problema, se busca que la producción de esporas y los métodos de formulación del
agente activo, reduzcan el tiempo requerido para la germinación de esporas y penetración en el
hospedero (Jackson, 1997).
Los factores bióticos y abióticos tienen una enorme influencia en el proceso infectivo. Las
esporas tienen requerimientos específicos de agua y temperatura, así como de otros factores
ambientales que en conjunto funcionan como inductores para la activación de receptores presentes en
el patógeno, que en su mayoría son glicoproteínas (Tanada y Kaya, 1993). Para llevar a cabo la
invasión del hospedero es necesario la adherencia de la pared celular de la espora fúngica con la
cutícula, donde además de la activación de los receptores patogénicos, participan la presencia de
iones divalentes como el Ca+2 y el Mg+2 que reducen las fuerzas de repulsión electrostática de la
superficie del insecto, por lo que pueden afectar su hidrofobicidad y promover la adhesión (Barnes y
Moore, 1997). Para el proceso de germinación, los factores de humedad, temperatura y condiciones
nutricionales están íntimamente relacionadas, es así como, la germinación de la espora se ve
favorecido por una humedad alta (70%) (Mendoça, 1992).
MATERIAL Y MÉTODOS
1. Fuente de los insectos
Actualmente se cuenta con una cría de Phyllophaga spp, en el CESAVEG, cuyos insectos
originalmente se obtuvieron de muestreos de zonas con gramíneas que mostraban manchas amarillas
y secas, similares a las causadas por el ataque a las raíces de larvas de este insecto. El desarrollo del
insecto se realiza alimentando a las larvas en plántulas de maíz, en macetas de 0.5-L de capacidad
con peat moss del No. 3 como sustrato para la planta y sin orificios en la base, para evitar que
escapen. Los bioensayos de actividad insecticida se realizarán aplicando las conidias contra larvas del
segundo y tercer estadio y evaluando la mortalidad por porcentaje de emergencia de adultos.
Por otro lado, se establecerá una cría de B. cockerelli para asegurar contar con la cantidad
suficiente de los insectos durante la realización de los bioensayos. Estas crías se iniciarán con insectos
colectados en campo en el municipio de Salvatierra, Gto. Para B. cockerelli se utilizarán plantas de
cultivo de chile como hospedero, cada planta estará contenida en una jaula de tela de organza y será
mantenida en una maceta de 3-L de capacidad con peat moss del No. 3 como sustrato. A cada jaula
así acondicionada con la planta de chile de 40-cm de altura, se le agregarán 50 adultos de B. cockerelli
durante 24-h para uniformizar la edad de la descendencia. Cuando se tengan ninfas de tercer instar, se
realizarán los bioensayos sobre este insecto. La crianza de estos insectos se mantendrá bajo
condiciones de invernadero a una temperatura entre 25-27°C y un fotoperiodo de16:8-h luz:oscuridad,
regulada con lámparas de 100 watts mediante un programador de período de tiempo (timer).
2. Evaluación de la actividad insecticida de los aislados de B. bassiana y M. anisopliae
sobre Bactericera cockerelli y Phyllophaga spp en laboratorio e invernadero.
Con el objetivo de evaluar la actividad insecticida individual o en conjunto de los cultivos
monospóricos de los aislados de B. bassiana y M. anisopliae sobre ninfas B. cockerelli y larvas de
Phyllophaga spp, se usará la técnica de dosis respuesta en base al porcentaje de mortalidad, para
calcular la concentración letal media (CL50) y noventa (CL90) de cada aislado a nivel de laboratorio e
invernadero.
A partir de esporas de tres aislamientos monospóricos y del producto comercial Mycotrol cepa
GHA de B. bassiana y dos aislados de M. anisopliae, se obtendrán esporas producidas en cajas Petri
con medio de cultivo Agar Dextrosa Saboraud (ADS), las cuales se cosecharán mediante raspado para
formar suspensiones, agregando 50-mL de agua deionizada con Tween 80 al 0.05% y a partir de las
cuales se prepararán las concentraciones a utilizar. Los bioensayos se realizarán siguiendo las
metodologías propuestas por Lacey, et al., (2009) y Butt y Goettel (2000). Los aislados se evaluarán en
pruebas de dosis-respuesta con las concentraciones de 0, 1X104, 1X105, 1X106 1X107, 1X108 y 5X108
conidios/mL, preparadas en buffer de fosfatos estéril y Tween 80 al 0.05%.
Para el caso de Pyllophaga spp, frascos de vidrio con 0.5-L de peat moss humedecido con tres
plántulas de maíz de 20 días se colocarán 5 larvas del segundo estadío.
Para el caso de B. cockerelli, en cajas Petri de 25 por 150-mm que contengan papel filtro
humedecido (cámara húmeda) y una hoja del cultivo de chile con 10 ninfas de la plaga sobre el haz de
la hoja, se le colocará un algodón humedecido en el pecíolo de la misma para mantenerla turgente.
Los tratamientos a evaluar serán los seis aislados por separado, más el control, con 10 plántulas
(30 larvas) por dosis para Pyllophaga spp., contra los dos aislados de M. anisopliae y 5 cajas con
hojas infestadas (50 ninfas) para el caso de B. cockerelli, contra los cuatro aislados de B. bassiana.
La aplicación de los tratamientos se realizará con un aspersor neumático colocado a 20-cm de
distancia de la maceta o caja Petri a 15 libras de presión durante 5-seg. El cálculo de la concentración
y viabilidad de los propágulos a utilizar se realizará de acuerdo a la metodología propuesta por Goettel
e Inglis (1997). Una vez realizada la aplicación, se adicionarán 5-mL de agua deionizada al papel filtro
y las cajas petri se sellarán con parafilm para formar una cámara húmeda y se incubarán a 25°C
durante ocho días. Cada caja Petri constituirá una repetición de cada tratamiento.
A partir del tercer día de la aplicación, se contabilizará de manera diaria, hasta los ocho días
después de la misma, el número de ninfas o larvas muertas por efecto del hongo en cada repetición y
tratamiento y los resultados obtenidos se analizarán utilizando el sofware Polo Plus (LeOra, 2007),
para estimar las CL de cada aislamiento. Para el caso de Pyllophaga spp., se contabilizará la
emergencia de adultos.
Cada concentración de cada aislamiento, se evaluará con cuatro repeticiones, mismas que se
obtendrán realizando las aplicaciones en dos ocasiones diferentes realizando dos repeticiones por
ocasión. Aquellos aislados que muestren la actividad más alta, se evaluarán nuevamente para cada
insecto plaga de chile, pero en combinaciones con los dos aislados, de la forma previamente descrita.
3. Efectividad de los aislados seleccionados en laboratorio contra la inducción de la
respuesta inmune de los insectos evaluados en experimentos a nivel de invernadero.
Siguiendo la metodología descrita en el punto anterior, los aislados de B. bassiana contra B.
cockerelli y los de M. anisopliae contra gallinas ciegas. Los lotes obtenidos del punto 1 de metodología
serán los tratamientos a evaluar. En base a los resultados, se realizará un experimento a nivel
invernadero, aplicando los aislados de B. bassiana sobre plantas de chile infestadas con huevecillos o
ninfas de B. cockerelli y larvas del segundo y tercer estadío de M. anisopliae en suelo con larvas de
gallinas ciegas. Los datos de mortalidad generados se analizarán por diferencias significativas de
medias, usando como controles un control negativo absoluto (sin insecto plaga ni plaguicida), uno para
el biológico (insecto plaga sin plaguicida biológico ni químico), y un control positivo (con plaguicida
químico recomendado para el cultivo y la plaga).
3.1 Efecto de la infección de los aislados, sobre el sistema inmune del insecto blanco
Los insectos expuestos en bioensayos de laboratorio, invernadero o campo a los aislados en
cultivo monospórico que se les determinará efecto de los aislados sobre el sistema inmune serán
larvas, los cuales se habrán sometido a un análisis de auto-diseminación o que presenten síntomas de
infección, así como también serán comparadas con la cría de laboratorio de la misma especie de
insectos (B. cockerrelli o Phyllophaga ssp.).
3.2 Obtención de la Hemolinfa.
Los diferentes estados larvarios serán esterilizados de la superficie con etanol al 80%, se
enjuagan en agua estéril y se anestesian en el hielo, posteriormente la Hemolinfa será ligeramente
extraída, a través de una pequeña punción hecha con una aguja estéril calibre 26 y recolectados
directamente en un microtubo 1.5-mL estéril, todo esto sobre una base de hielo
3.3 Conteo de hemocitos.
De la hemolinfa obtenida, se colocará una muestra directamente en un portaobjetos y se secará
al aire durante 20 a 30-min. Las células colectadas se fijarán con metanol durante 10min. La muestra
se dejará secar al aire. Las células se teñirán con Giemsa (dilución 1:9 en buffer de agua destilada)
por 10-15min, y posteriormente, en forma rápida las laminillas se lavarán con buffer de agua destilada y
se dejarán secar al aire. Finalmente, las laminillas se deshidratarán con alcoholes y montarán con
solución de Estellan (Merck). Los frotis se observarán al microscopio óptico (40X). Los conteos de se
harán por triplicado.
3.4 Medición de Fenol-oxidasa.
Una vez obtenida la hemolinfa de cada una de las muestras de los individuos en los diferentes
estados juveniles (larvarios o ninfales, según sea el caso) y adultos infectados con los tratamientos de
los aislados. Se removerán los hemocitos por centrifugación a 14000-rpm durante 5-min. Del
sobrenadante del plasma, se tomarán 10-μL y se mezclarán con150 μL de Dopamina 10mM en 50mM
fosfato sódico, pH-6.5, a 25°C y se medirá el cambio de absorbancia a 472nm en el espectrofotómetro
y se realizarán curvas de la oxidación del sustrato (L-DOPA) por la activación de la enzima
fenoloxidasa y los valores se graficarán para 5, 10 y 15-min para compararlos con los obtenidos de los
insectos tratados con los diferentes aislados. El experimento de hará por triplicado.
Los aislados seleccionados en base a su actividad insecticida se seguirán evaluando para la
producción por fermentación líquida, sólida y bifásica.
4. Selección de Medios y Condiciones de Producción a Escala Semi-Piloto.
4.1 Fermentación líquida, sólida y bifásica
Para determinar las condiciones requeridas para asegurar la producción de metabolitos con
actividad insecticida generada en la cinética de crecimiento y determinar su influencia en el desarrollo
de esporas fúngicas y efectividad con ensayos paralelos a la cinética de crecimiento en FML y FMS,
como un parámetro de control de calidad. Para lograrlo, se evaluarán diferentes métodos de
producción de cada aislado del CESAVEG, eligiendo ingredientes reportados por ser de bajo costo y
alto rendimiento, además de mantener la efectividad y producción de metabolitos (Churchill, 1982). Se
evaluará la composición de nutrientes del medio de producción siguiendo los protocolos de
requerimientos nutricionales descritos por Wraight et al. (2001), combinado con análisis de viabilidad
celular mencionados por Stentelaire et al. (2001), y actividad insecticida (Behle et al., 2006, -2009).
Dentro de los principales factores a considerar estarán la fuente de carbono, nitrógeno, fósforo
y azufre, así como diferentes microelementos (potasio, sodio, molibdeno, magnesio, hierro, etc.)
(Jackson et al., 2003). Los ensayos para determinar el compuesto y la cantidad requerida será
iniciando con los valores promedios ya determinados para el microorganismo y realizando
combinaciones con dosis por arriba y debajo del valor de referencia, hasta determinar las condiciones
nutricionales óptimas (Kanzok, Jacobs-Lorena, 2006). Se pondrá especial cuidado en los nutrientes
que aporten aminoácidos y/o vitaminas, como el extracto de levadura (Jackson et al., 1998).
Una vez determinado el medio, se harán estudios de la composición del mismo, para determinar
la factibilidad de emplear un medio de cultivo “mínimo” que permitan reducir el costo de producción,
para que a final de cuentas sea competitivo en precio con otros productos presentes en el mercado
(Wraight et al., 2001). De forma general, para un crecimiento homogéneo y rápido, la producción se
realizará en medio líquido, iniciando por crecer el microorganismo en tubo, después en matraz con un
volumen de medio del 20% (para el caso de hongos es importante mantener el medio con un buen
porcentaje de oxígeno, por lo que se emplearán matraces con escañas, para incrementar el mezclado)
(Jackson et al., 1997). Estos se harán crecer en una plataforma de agitación a temperatura ambiente.
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar.
Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. Otro factor
importante de considerar será el pH, ya que es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos, por lo mismo se evaluarán diferentes valores de pH hasta encontrar el óptimo de
crecimiento del microorganismo. Si el rango de crecimiento permite ajustar el medio a un pH, bajo
(ácido) o alto (alcalino), éste se elegirá puesto que reducirá las posibilidades de contaminación del
medio (Mercier et al., 2007). Se seguirá el mismo procedimiento para encontrar la temperatura óptima,
pero si el crecimiento del microorganismo es adecuado a temperatura ambiente, esta será la
temperatura a emplear.
El producto de fermentación líquida se tratará de estabilizar al mezclarlo en un sustrato que
tenga la capacidad de actuar como soporte del hongo, e inducir su esporulación durante el secado,
para así quedar como formulado, sin pasar lor fermentación sólida. De la misma forma, con el producto
obtenido de fermentación líquida se inocularán bolsas de arroz, para comparar el proceso de formulado
directo del proceso de fermentación líquida, con la técnica de fermentación bifásica. Por separado y
siguiendo la producción tradicional, de inóculo obtenido de matraces en agitación se procederá a
inocular bolsas de arroz, para tener el tercer tratamiento, de fermentación sólida.
En todos los casos, el crecimiento del microorganismo se monitoreará mediante la técnica
colorimétrica de medición de actividad de reducción del MTT por rango de respiración (Gomez-Flores
et al., 1995) y viabilidad celular fúngica (Stentelaire et al., 2001), el cual se ha empleado exitosamente
en el caso de hongos para control de fitopatógenos (Mercier et al., 2007), como lo describen
Stentelaire et al. (2001).
Durante la cinética, se tomarán muestras de 20-mL cada 12-h a partir de las 54 h, para
determinar producción de metabolitos y actividad enzimática, y al final de la producción, se tomarán
cinco muestras para comprobar que el producto conserve la actividad enzimática deseable y observada
al generar los cultivos monospóricos. Los resultados, aunados a los de vialidad y efectividad, servirán
de base para la selección final del medio de cultivo y condiciones fisicoquímicas idóneas para cada
aislado.
5. Evaluación de la viabilidad y efectividad de los lotes de producción por FML, FMS y FB
La viabilidad de cada aislado se determinará en las diferentes fases de producción, cosechado,
formulación y vida de anaquel, mediante las siguientes técnicas:
a. Número más probable por unidades formadoras de colonia (UFC),
b. Actividad celular por la técnica colorimétrica de reducción del MTT
5.1 Técnica de número más probable
La cuenta viable de hongos se basa en el fundamento de que al crecer sobre un sustrato sólido,
como los medios sugeridos para el crecimiento de hongos como agar de papa y dextrosa (BD-BIXON),
o agar Saboraud (BD-BIXON), cada conidia viva o fragmento de micelio germinará y crecerá hasta
formar una colonia visible a simple vista (García & Uruburu, 2000). Por lo tanto, se utilizará esta
técnica para determinar la viabilidad en base a número más probable.
Los valores se analizarán comparando las UFC por tratamiento x dosis x repetición
y los valores finales nos darán las UFC (Luna-Olvera et al., 2007), por medio de la siguiente fórmula:
UFC= promedio del número de colonias por repetición, x dilución de la muestra
5.2 Actividad por la técnica colorimétrica (método de reducción del MTT)
Para monitorear la supervivencia o la viabilidad del hongo durante el proceso de formulación, se
realizará la técnica colorimétrica de reducción de MTT (3-(4,5-dimethiltiazol-2-yl)-2,5-difenil-2H-bromuro
de tetrazolio) (Research Organics) (Gomez-Flores et al., 1995) ya que es equivalente (Stentelaire et al.,
2001) y permite incrementar el número de muestras analizadas. Esta técnica se basa en la habilidad
de la enzima deshidrogenasa mitocondrial de células viables, de reducir al MTT y convertirlo en
cristales de formazán, los cuales son de color azul oscuro e impermeables a la membrana, por lo que
se acumulan en células vivas. El número de células vivas es directamente proporcional a la cantidad
de cristales de formazán. Para realizarlo, se tomarán 2-mL del hongo creciendo para inoculo y en
FML, o 2.0-g en FMS, cosechado de conidias, o formulados, a tubos cónicos estériles de 15-mL. Al
tubo se adicionarán 200-µL de la solución de MTT a una dosis de 5-mg/mL (0.025-g del reactivo MTT
en 5-mL de de buffer de fosfatos, PBS estéril) a cada tratamiento, usando 4 repeticiones. Todos los
tubos se incubarán y se mantendrán en observación durante 20-min a temperatura ambiente (25°C). Si
hay cambio de color a azul en los primero 5min, esto indicará contaminación bacteriana. La pureza del
cultivo se verificará al microscopio. Las muestras positivas se dejarán incubando por 2.5-h a
temperatura ambiente (25°C), y entonces se agregarán 400-µL de buffer de lisis DMSO (dimetilsulfóxido en duodecil-sulfato de sodio), a cada tubo, y se colocarán en oscuridad durante 8min para
solubilizar las sales de formazán. Por último, se tomará la lectura de la absorbancia (densidad óptica,
con lámpara de luz UV) a 570-nm. Se registrarán las lecturas y realizará el análisis estadístico de las
lecturas de absorbancia para la selección de nutrientes y condiciones físico-químicas.
6. Escalamiento de producción
Debido a que en el CESAVEG ya se tiene establecido el método de producción por FMS y que
en la naturaleza la mayoría de los hongos crecen formando hifas colonizando un sustrato sólido, la
producción de esporas de hongo por FMS será el método para comparar al iniciar con la FML para este
proyecto (Mendoça, 1992; Wraight et al., 2001). Para la FML, se evaluarán ingredientes de bajo costo
y fácil obtención en el ámbito local (preferentemente subproductos de origen natural). Los hongos
previamente seleccionado, se propagarán y evaluarán empleando diferentes condiciones
fisicoquímicas y rangos nutricionales, corriendo curvas de cinética de crecimiento, producción de
metabolitos y biomasa, para seleccionar la óptima para cada agente de biocontrol (Mercier et al.,
2007). Para esto, cada aislado se hará crecer en matraces con escañas y se determinará el tiempo de
incubación, rango de agitación, nutrientes y demás parámetros requeridos para potenciar su uso como
semillero, en base a producción de esporas (UFC) y viabilidad (MTT). De ahí, se inoculará tanques de
15 a 20-L de capacidad, con el medio seleccionado, y de nuevo se evaluará la cinética de crecimiento,
tal y como se mencionó a nivel de matraz.
Ya seleccionados el medio y las condiciones optimas de la FML, se evaluará la FMS. Los granos
a evaluar serán arroz (control positivo), centeno, cebada y trigo, todos enteros y con cáscara. En este
caso, los granos serán pre humedecidos en un porcentaje del 60-70% del peso seco del grano. Los
granos pre-humedecidos se esterilizarán por calor húmedo en dos sesiones de 30min en autoclave y
después se inocularán con el hongo producido en FML a una relación del 10% peso-volumen. Para la
producción se emplearán bolsas adaptadas con aeración, para mantener las condiciones estériles todo
el tiempo. El hongo se dejará crecer, realizando una curva de crecimiento pero medio de medición de
actividad (Stentelaire et al., 2001). Todos los trabajos experimentales serán derivados de un cultivo
monospórico de cada aislado. Con la finalidad de incrementar el rendimiento de conidios, se evaluará
del suministro de oxígeno a través de diferentes contenedores (forma tradicional, tapón de algodón y
bolsas con filtro integrado) en la producción de conidios. Se determinará la cantidad de conidios/g de
sustrato. Cuando el crecimiento de mantenga estable, se realizará el secado del grano con un
desecador de aire o secador de lecho fluido (Behle et al., 2006; Mercier et al., 2007). Con los lotes
obtenidos se hará una comparación de la efectividad entre la producción por FML y la bifásica (primero
FML y después FMS)
Para asegurar que al medio de cultivo y condiciones fisicoquímicas seleccionadas no modifiquen
la viabilidad y efectividad de los aislados de cada hongo, se determinará la actividad de los productos
obtenidos de la FML, FMS y FB, siguiendo la tecnología descrita en el punto 4 de la metodología,
evaluando el producto de los aislados de B. bassiana contra B. cockerelli y los de M. anisopliae contra
gallinas ciegas. Los lotes obtenidos del punto 1 de metodología serán los tratamientos a evaluar. En
base a los resultados, se realizará un experimento a nivel invernadero, aplicando los aislados de B.
bassiana sobre plantas de chile infestadas con huevecillos o ninfas de B. cockerelli y M. anisopliae en
suelo con larvas de gallinas ciegas. Los datos de mortalidad generados se analizarán por diferencias
significativas de medias, usando como controles un control negativo absoluto (sin insecto plaga ni
plaguicida), uno para el biológico (insecto plaga sin plaguicida biológico ni químico), y un control
positivo (con plaguicida químico recomendado para el cultivo y la plaga).
BIBLIOGRAFÍA
Ayala-Zermeño, M. A., T. Mier, J. Sánchez-Robles, & C. Toriello. 2005. Variabilidad intraespecífica del
crecimiento de Lecanicillium lecanii (=Verticillium lecanii) por efecto de la temperatura. Revista
Mexicana de Micología. 20: 93-97.
Barnes, S. E., & Moore D. 1997. The effect of fatty, organic or phenolic acids on the germination of
conidia of Metarhizium flavoviride. Mycol. Res. 101: 662-666.
Bartlett, M. C., & Jaronski S. T. 1988. Mass production of entomogenous fungi for biological control of
insects. En: Fungi and Biological Control Systems (Burge M. N., Ed.), Manchester University
Press, Manchester, UK.
Behle, R. W., Compton, D. L., Laszlo, J. A. & Shapiro-Ilan D. I. 2009. Beauveria bassiana (Balsamo)
Vuillemin conidia from UV degradation. J Econ Entomol. 102 (5): 1759-1766.
Behle, R. W., C. Garcia-Gutierrez, P. Tamez-Guerra, M. R. McGuire, & M. A. Jackson. 2006.
Pathogenicity of blastospores and conidia of Paecilomyces fumosoroseus against larvae of the
Mexican bean beetle, Epilachna varivestis Mulsant. Southwest Entomol. 31: 289-295.
Bode, H. B. 2009. Entomopathogenic bacteria as a source of secondary metabolites. Current Opinion in
Chemical Biology. 13 (2): 224-230.
Butt, T.M. y Goettel, M.S. 2000. Bioassays of entomogenous fungi. En: Navon, A. y Ascher, K.R.S.
(Eds.). Bioassays of Entomopathigenic Microbes and Nematodes. CAB International. New York,
pp: 141-195.
Castellanos, D. O. 1997. Importancia en la patogenicidad de la acción enzimática del hongo Beauveria
bassiana sobre la broca del café. Rev. Colomb. Entomol. 23: 65–71.
Castro, Z. T. J., Tamayo, M. F. y Vallecillo, G. H. 2005. Efectividad biológica de hongos
entomopatógenos contra Paratrioza cockerelli (Homoptera: Psillidae) en tomate de cáscara. En:
Bujanos, M. R., Delgado, C. J. C., Tamayo, M. F. y Marín, J. A. (Eds.). Memorias del XXVIII
Congreso Nacional de Control Biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológico. 17 y 18 de
noviembre. San Miguel de Allende, Gto. Méx. Pp: 222-224.
Churchill, B.W. 1982. Mass production of microorganisms for biological control, pp.139-56. En: R.
Charudattan and H.L. Walker (ed.). Biological Control of Weeds with Plant Pathogens. John
Wiley and Sons, New York.
Díaz, G. O., Silva, F. M. A., Tiscareño, M. A., Monreal, C. T. y Villanueva, J. J. A. 2005. Alternativas
biorracionales y microbiales para el manejo de Bactericera cockerelli (Sulc.) (Homoptera:
Psillidae). En: Bujanos, M. R., Delgado, C. J. C., Tamayo, M. F. y Marín, J. A. (Eds.). Memorias
del XXVIII Congreso Nacional de Control Biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológico. 17
y 18 de noviembre. San Miguel de Allende, Gto. Méx. Pp: 218-221.
Eyal, J., J. F. Walter, L. Osbourne, & Z. Landa. 1992. Method for Production Land Use of Pathogenic
Fungal Preparation for Pest Control. U.S. Patent # 5,360,607.
García, M. D., & F. Uruburu. 2000. La conservación de cepas microbianas. Act Sem. 30:12-6.
García, N. B C. 2007. Transmisión de fitoplasmas por Bactericera cockerelli (Sulc) a plantas de chile,
papa y tomate. Tesis Doctoral. Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del I.P.N.
Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas. México.
García-Gutiérrez, C., P. Tamez-Guerra, H. Medrano-Roldán, & M. B. González-Roldán. 2007. Mercado
de bioinsecticidas en México. En: Biotecnología financiera aplicada a bioplaguicidas. Ed. García
Gutiérrez C. & H. Medrano-Roldán. Artes Gráficas La Impresora, Durango. México. pp: 17-40.
Goettel, M. S. e Inglis, G. D. 1997. Fungi: Hyphomycetes. En: Lacey, L. A. (Ed.). Biological Techniques:
Manual of Techniques in Insect Pathology. Academic Press. San Diego, California, pp: 213-249.
Gomez-Flores, R., S. Gupta, R. Tamez-Guerra, & R. T. Mehta. 1995. Determination of MICs for
Mycobacterium avium-M. intracellulare complex in liquid medium by a colorimetric method. J Clin
Microbiol. 33: 1842-1846.
Jackson, M. A. 1997. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective
fungal biological control agents. J. Ind. Microbiol. Biotechnol 21: 180–187.
Jackson, M.A., Cliquet, S., & L.B. Iten. 2003. Media and fermentation processes for the rapid production
of high concentrations of stable blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces
fumosoroseus. Biocontrol Sci Technol. 13: 23-33.
Jackson, M. A., Frymier J. S., Wilkinson B. J., Zorner P., & Evans S. 1998. Growth requirements for
production of stable cells of the bioherbicidal bacterium Xanthomonas campestris. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 21: 237-241.
Jackson, T. & Glare T. 1992. Use of pathogens in scarab pest management. Interpept. Andover.
Hampshire, England. pp 298
Jackson, M.A., McGuire, M.R., Lacey, L.A. & Wraight, S.P. 1997. Liquid culture production of
desiccation tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus.
Mycol Res. 101:35-41.
Kanzok, S. M., and Jacobs-Lorena, M. 2006. Entomopathogenic fungi as biological insecticides to
control malaria. Trends in Parasitology. 22: 49-51.
Lacey, L. A., De la Rosa, F. y Horton, D. R. 2009. Insecticidal activity of entomopathogenic fungi
(Hypocreales) for potato psyllid, Bactericera cockerelli (Hemiptera: Triozidae): Development of
bioassay techniques, effect of fungal species and stage of the psyllid. Biocontrol Sci. Technol. 19:
957-970.
Lebsky, V., A. Poghosyan, R. Servín V, & J. A. Larrinaga. 2006. Infección por fitoplasma en chile ancho
en el estado de Baja California Sur: Estudio de caso. En: Proceedings, Third World Pepper
Convention. Chihuahua, Chih. pp. 126–129.
Luna-Olvera, H. A., Tamez-Guerra P., Sandoval-Coronado C., Damas-Buenrostro G., & T. RangelGalán. 2007. Ecología Microbiana, Manual de prácticas. Primera edición, UANL. pp 8-17.
McDougall, P. 2003. The cost of new agrochemical product discovery, development and registration in
1995 and 2000. A consultancy study for Crop Life America and the European Crop Protection
Association. http://www.croplife.org
Mendoça, A. F. 1992. Mass production, application and formulation of Metarhizium anisopliae for control
of sugarcane froghopper, Mahanarva posticata, in Brazil. In: C. J. Lomer & C. Prior (Eds).
Biological control of locusts and grasshoppers, Proceedings of the International Institute of
Tropical Agriculture, Cotonou, Republic of Benin 29., pp. 239-244.
Mercier, J., J. I. Jiménez-Santamaría, & P. Tamez-Guerra. 2007. Development of the volatile-producing
fungus Muscodor Albus Worapong, Strobel y Hess, as a novel antimicrobial biofumigant. Rev
Mex Fitopat. 25: 173-179.
Moore, D. & C. Prior. 1993. The potential of mycoinsecticides. Biocontrol News and Information. 14:
31N–40N.
Morales, H. 2002. Pest management in traditional tropical agroecosystems: lessons for pest prevention
research and extension. Integrated Pest Management Reviews. 7 (2).
Posada, F. J. & Vega, F. E. 2005. A new method to evaluate the biocontrol potential of single spore
isolates of fungal entomopathogens. J Insect Sci. 2005; 5: 37.
Rodríguez del Bosque, L.A., F. Silvestre-García, V.M. Hernández-Velázquez, & H. Quiroz-Martínez.
2003. Virulence of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against Phyllophaga crinita
and Anomala flavipennis (Coleoptera: Scarabaeidae) larvae. En: Estudios sobre coleópteros del
suelo en América. Aragón, G.A., M.A. Morón y A. Marín (Eds.). Publ. Esp. BUAP. Puebla,
México. pp. 337-345.
Schisler, D. A. & P. J. Slininger. 1997. Microbial selection strategies that enhance the likelihood of
developing commercial biological control products J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 19: 172–179.
Soto, G. M. H., Cruz, C. L. R., Vallecillo, G. H. y Tamayo, M. F. 2006. Efectividad biológica de dos
cepas del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana contra el pulgón saltador Bactericera
cockerelli (SULC.) (Hemiptera: Triozidae) en el cultivo de chile. En: Molina, O. J., Mellín, R. M.
A., Archila, M. A. B. y Arredondo, B. H. C. (Eds.). Memorias del XXIX Congreso Nacional de
Control Biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológico. 5-10 de noviembre de 2006.
Manzanillo, Col. Méx. Pp: 76-78.
Stamets, P. E. 2003. Mycopesticides. US Patent 6660290.
Steinkraus, D. C., and Boys, G. O. 2005. Mass harvesting of the entomopathogenic fungus, Neozygites
fresenii, from natural field epizootics in the cotton aphid, Aphis gossypii. J Invertebr Pathol. 88
(3): 212-217.
Stentelaire, C., Antoine, N., Cabrol, C., Feron, G. & Durand, A. 2001. Development of a rapid and highly
sensitive biochemical method for the measurement of fungal spore viability. An alternative to the
CFU method. Enzyme and Microbial Technology. 29: 560-566.
Stowell, L. J., K. Nette, B. Heath, & R. Shutter. 1989. Fermentation alternatives for commercial
production of a mycoherbicide. Soc. Ind. Microbiol. 16: 219–227.
Tanada, Y. & Kaya, H. 1993. Insect Pathology. Academic Press. San Diego, Ca. (Usa). Pp 666.
Vega, G. M T., Rodríguez J. C., M, Díaz O. G, Bujanos R. M, D. Mota S, Martínez J. L. C, Lagunas A.
T, & Garzón J. T. 2008. Susceptibilidad a insecticidas en dos poblaciones mexicanas del salerillo
Bactericera cockerelli (Sulc) (Hemiptera: Triozidae). Agrociencia 42:463–471.
Velasco, S. J.L., Sánchez, V. J., Villalobos, J. y Bujanos, M. R. 2004. Control biológico de mosquita
blanca Trialeurodes vaporariorum y pulgón saltador Bactericera cockerelli (Homoptera:
Aleyrodidae, Psillidae) en jitomate en invernadero. En: Cortéz, M. E., Vejar, C. G., Gálvez, R. J.
B., Barrientos, C. J., Meza, G. L., Apodaca, S. M. A. y quintero, B. A. (Eds.). Memorias del XXVII
Congreso Nacional de Control Biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológico. 8-13 de
noviembre. Los Mochis, Sin. Méx. pp: 157-160.
Walker, H. L. 1988. Production of spores for field studies: Alternaria macrospora as a potential
biocontrol agent for Spurred anoda. USDA Ag. Technol., Southern Series (ISSN 0193–3728), No.
12:1–5.
Wraight, S.P., M.A. Jackson & S. L. Dekock. 2001. Production, stabilization and formulation of fungal
biocontrol agents. En: Fungi as Biocontrol Agents, Butt, T. M., C. Jackson & N. Magan, (Eds.).
CABI Publishing, Willingford, Oxon, United Kingdom. pp 253-288.
IMPACTOS O
DEMANDADOS
LOGROS
ESPERADOS
POR
PRODUCTO
Y/O
RESULTADO
1
Producto uno: Determinar las condiciones requeridas para asegurar la producción de
metabolitos con actividad insecticida generada en la cinética de crecimiento y determinar su
influencia en el desarrollo de esporas fúngicas y efectividad con ensayos paralelos a la cinética
de crecimiento en FML y FMS, como un parámetro de control de calidad.
1.1
Impacto ambiental: La información que se genere permitirá incrementar la producción a nivel
piloto e industrial, con el desarrollo y beneficios de industria biotecnológica en lugar de química.
Tecnológico: La implementación de la tecnología generada permitirá establecer los parámetros
de control de calidad requeridos para la producción de esporas fúngicas y efectividad con
1.2
ensayos paralelos a la cinética de crecimiento en Fermentación en medio líquido y en medio
sólido, para bioinsecticidas de este tipo.
1.3
Económico: Los resultados podrían ser de interés por otras compañías, para la transferencia de
tecnología y su implementación en procesos que involucren la producción de hongos.
1.4
Social: tecnología podría cambiar la visión de la comunidad al empleo de nuevas biotecnologías
en la región.
1.5 Ecológico: Los resultados permitirá reducir la cantidad de empleo y aplicación de químicos
2
2.1
Producto dos.
Escalar la producción a nivel semi-piloto e industrial siguiendo los
parámetros de control de calidad previamente establecidos.
Impacto económico:
La adecuación para la construcción y equipamiento que
permita el escalamiento de la tecnología.
2.2 Tecnológico:
2.3
El potencial de transferencia de tecnología a nivel industrial.
Social:
El desarrollo de conocimiento e implementación de un proceso de
producción industrial de este tipo.
Ecológico: La
2.4
3
3.1
reducción en el empleo de químicos y generar desechos no tóxicos y
que puedan emplearse como biofertilizantes.
Producto tres.
Relacionar la efectividad de los aislados contra la inducción de la
respuesta inmune de los insectos evaluados en experimentos a nivel de campo.
Económico Los empleos y derrama económica relacionada a la comercialización de
bioinsecticidas fúngicos
Tecnológico Al igual que en el aspecto económico, la detección oportuna de respuesta
3.2 inmunológica derivada a la exposición de bioinsecticidas fúngicos lo cual permitiría proponer
estrategias para que no redunde en pérdidas de cultivos.
Social El posible desarrollo de resistencia de insectos a un bioinsecticida afectaría a la sociedad
3.3 campesina, especialmente a los productores de chile, pero además se reduciría la confianza en
el empleo de agentes biológicos.
Ambiental Evitar, detectando a tiempo con técnicas confiables, el potencial desarrollo de
resistencia o respuesta inmunológica de insectos a bioinsecticidas fúngicos para reducir el
3.4
impacto ambiental de esto y entender el porqué en las diferencias de susceptibilidad a los
productos biológicos de esta naturaleza.
Ecológico: Si se encuentra una técnica confiable para detectar la inducción de la respuesta
celular de insectos expuestos a hongos entomopatógenos, su detección oportuna podría evitar su
3.5
uso a largo plazo y evitar el desarrollo de resistencia relacionada a este factor, lo cual evitaría
pérdidas económicas.
BENEFICIARIOS DIRECTOS DEL PROYECTO
Nombre
Ignacio Soto
Trejo
CURP
xxxxxxxxxx
Telefono
Mail
xxxxxxxxxxx xxxxxxxx
Dirección
Cooperativa de Productores
Agrícolas de Guanajuato
COLABORADORES DEL PROYECTO
Nombre
Especialidad Institución
Fernando
Entomólogo
Tamayo Mejía
Violeta
Elizalde
Microbiólogo
Blancas
Gabriela
Damas
Buenrostro
Corre electrónico
Actividades en el
proyecto
SAGARPA
[email protected]
Bioensayos, evaluación
en invernadero y campo
CESAVEG
[email protected]
Aspectos relacionados a
la producción de hongos
Microbiólogo
U.A.N.L
(estudiante
doctorado)
[email protected]
Gricelda
Microbiólogo
Núñez Mejía
U.A.N.L
(estudiante
doctorado)
[email protected]
_________________________________
Dra. Patricia Tamez Guerra
Responsable técnico del proyecto
Aspectos relacionados a
la producción y
evaluación de
micotoxinas
Aspectos relacionados a
caracterización molecular
y respuesta inmune en
insectos